农杆菌介导法

1、农杆菌介导的咼效水稻遗传转化体系的研究A Highly Efficie ntAgrobacterium - mediated Rice Tran sformatio n Method水稻是基因组研究的模式植物，近年来水稻基因组研究取得了很大进展，构建了遗传图谱和物理图谱，完成了籼稻和粳稻的全基因组草图测2 - 3序，以及第1号和第4号染色体的精细测4 - 5序，并对第10号染色体的结构进行了详细分析。在此基础上，各实验室大规模地，系统地进行水稻功能基因研究，普遍采用的研究手段是基因标签技术。基因标签技术包括T - DNA和转座子标签，创建大量的基因标签体是功能基因研究的材料平台。而根癌农杆菌介

2、导的水稻遗传转化是水稻基因标签技术中的重要步骤之一。本研究完善了根癌农杆菌介导的水稻转化方法，以期为水稻功能基因研究提供丰富材料，为水稻重要农艺性状的改良开辟途径。1材料以水稻品种日本晴(Oryza sativa L. ssp.japonica)为试验材料。菌株类型为 EHA105超毒力菌株，载体为增强子捕获载体 pFX- E24. 2 - 15R( 见图1),载体上带有GUS报告基因、35 S的CaMV启动子序 列和潮霉素选择标记基因(HYG)。农杆菌菌株为EHA105GAL4/罔1祓用pFXr E24.2- 15R上的T- DM%片设闿注：RB为T I)辭后边界一 GM.4/VP16為酵M

3、桂录激活了 GAL1DN.X粘合区弓单抱病癬VP陌激厝区站融合基囲伍心£为6 个璽复的上游激活序列”BoBS为SI菌垃餉(尊)朗秤酸覘娥I乩 CuMVSSS是花椰轲毒启胡.IIYG址选择林记華帙建T- DNA 帀边界*2方法2.1水稻愈伤组织的诱导 诱导方法参照HIEI7等。将日本晴水稻种子去壳，用75 %乙醇灭菌5min， 再用2. 5 %的次氯酸钠灭菌处理不同时间(40min，37 min ,30 min 和25 min)， 以确定最佳灭菌时间，灭菌后用无菌水冲洗 68次，于MS固体培养基上28 'C避光培养，30 d 后，将愈伤组织进行继代培 养，得到胚性愈伤组织。2.

4、2农杆菌转化愈伤组织 用AB固体培养基+氯霉素25 mg/L + 利福平20 mg/L + AS 20 mg/L培养农杆菌，在20 C下培养56 d。用无菌勺子轻轻刮下培养的农杆菌，放入AAM液体培养基中(加有2 mg/L 2，4-D ,0.7 g/L 脯氨酸，20 mg/L AS）, 在80 rpm/min ,27'C下，摇荡培养4 h。将挑好的胚性愈伤组织放入锥形瓶，菌液倒入另一锥形瓶中，并加入AAM培养基（+AS50mg/L）,分别调节OD600值至不同数值（0. 120、0. 145 、0. 158 、0. 190 、0. 195） , 以确定最佳的发杆菌浓度。然后将菌液倒入愈

5、伤组织中 , 用手 轻摇，感染15 min。再吸干菌液，将愈伤组织放入装有滤纸的培养皿中干燥，移至共培养基上27 C下共培养34 d。2.3转化体的获得将共培养的愈伤组织转出，无菌水漂洗34次，再用NB培养基+ 50 mg/L 头抱霉素在室温下100 rpm摇洗12 h，洗2遍后吸干放在滤纸上。将吸干的愈伤组织转入N6选择培养基上（+ 50 mg/L 潮霉素+ 500 mg/L 头抱霉素），27 C下暗培养20 d后，继代一次。将新长出的抗性愈伤组 织转移到N6预分化培养基上，28 C下，暗培养7 d。将抗性愈伤组织转移到N6分化培养基上，28下，光照12 h/ d，培养23周后，新鲜愈伤组织

6、将有绿点出现，每2周继代一次，待分化出完整小苗后转入壮苗培养基MS中。炼苗并移栽。2.4 GUS染色分析参照Jefferson 的方法，切取T0代转化体的叶片、种子等器官进行染色，在37 C下反应1216 h，弃去染色液，用95 %的酒精脱色，在解剖显微镜下观察拍照。染色液组成为50mM的磷酸钠盐缓冲液，pH7.0，10 mMEDTAD. 1 %TritonX- 100，1 mg/ml 的 X - Glue，0. 1 mM铁氰化钾，0.1mM亚铁氰化钾，20 %甲醇。3 结果与分析3.1 不同灭菌时间对愈伤诱导率的影响 灭菌是转化成功的关键技术之一 ， 既要保证灭菌彻底 ， 又不能影 响种子萌

7、发和产生愈伤。用 2.5 % 次氯酸钠对 200 粒种子分别处理 40 min 、 37 min 、 30min 和 25 min ， 结果表明 ， 随着灭菌时间的增加 ， 愈伤诱导率呈下降趋势。灭菌 40 min 时 ， 愈伤诱导率仅为 77 %，大部 分种子不能萌发 ， 推测可能是胚已被到灭菌效果 ， 次氯酸钠对种子萌发无影响 ， 种子萌发力强 ， 但是由于 萌发消耗了很多养分 ， 反而部分抑制了愈伤组织的生长 ， 故其愈伤诱导率为 96.3 %， 反而低于灭菌 30 min 时的愈伤诱导率 97.3 % 。而且 ， 灭菌 40 min 和 37 min 时 ， 形成的愈伤颗粒比较小 ，

8、侵染时易于褐死 ， 不利于转化，而灭菌30 min时的愈伤颗粒大小在 3 mm左右，适合于转化，且诱导率最高。因此，2. 5 % 次氯酸钠的最适灭菌时间为 30min 。3.2 愈伤组织的继代培养时间对转化率的影响 愈伤组织经过多代培养后 ， 会产生体细胞突变 ， 不利于转化体的筛选。同时 ， 多代培养后 ， 愈伤组织逐渐衰老死亡 ， 将大大降低转化效率。但是传统的方法直接用 诱导的愈伤来转化 ， 也会降低转化效率 ， 这可能是细胞的周期状态影响了转化效率 ， 有报道认为当愈伤组 织细胞处于细胞周期 S时期和G2周9期的比例高时转化效率最高，而且S期是细胞DNA复制期，此时转化有利于 T- 链

9、转变成双链 ， 增加稳定整合和遗传。所以经过适当的继代培养 ， 可以使细胞处于转化最 佳状态而提高转化效率。本实验通过观察 ， 经继代培养后的愈伤组织表面光滑 ， 质地致密 ， 粒形好 ， 继代培养67d时转化率最高。培养时间太短，愈伤组织表面粗糙，粒小，不利于转化；培养时间过长则愈伤组织变软 , 发粘 , 转化后易褐化死亡。3.3 农杆菌浓度对转化效率的影响 农杆菌浓度直接影响到转化效率。农杆菌浓度太低时 ， 每个愈伤组织 块产生的抗性愈伤数极少 ， 大部分不产生抗性愈伤 ； 浓度太高 ， 则愈伤组织很容易被过度侵染 ， 共培养后 无法恢复活力 ， 在进行选择培养时 ， 大多数会褐化死亡。本

10、研究用不同 OD 值的农杆菌菌液分别处理生长 状况良好一致的300个愈伤组织，发现当OD6O0直为0.1450.190时，转化效率基本保持在 79 %左右, 当0D600值低于0. 145 时，转化率较低，超过0. 190 时，愈伤死亡数量增多，并且选择培养时，因过 多的农杆菌覆盖在抗性愈伤组织上 ， 抑制了其生长。4 结论与讨论农杆菌转化效率的影响因子包括菌株类型、水稻基因类型、培养基成分组成、组织培养条件等。笔者 通过对日本晴水稻转化条件的研究，发现在日本晴的转化过程中，当种子灭菌30 min时，愈伤的诱导率最高，继代培养67 d后的转化率最高，菌浓度0D600值为0. 1450. 190

11、时，转化效率高。另外，试 验还发现在分化培养时 ， 黑暗条件下预培养 7 d 的可以大大减少愈伤组织的褐化程度 ， 分化效率达到 85 %。优化后转化体系大大减少了组织培养时间 ，3 个月即可获得转化植株 ， 不但节省成本 ， 而且减少由 于组培而激活 Tos17 等水稻内源转座子从而造成体细胞突变的频率 。农杆菌介导的基因转化技术已经很成熟 ， 但是要适应高通量的水稻基因组研究 ， 快速完成 T -DNA 插 入饱和突变体的创制 ， 需要大大提高抗性愈伤组织的分化效率。传统转化技术将转化后的愈伤组织直接放 在同一培养基上进行分化与选择培养 ， 容易造成愈伤组织因褐化而抑制分化。因为选择培养基中含有的高 浓度抗生素使未转化的愈伤组织褐化而产生酚类等有毒物质 ， 抑制了抗性愈伤组织的生长和分化。有人对 传统转化方法进行初步改进 ， 把抗性愈伤组织单独放在含有抗生素的分化培养基上培养 ， 但是由于抗生素 的影响以及分化培养基中的ABA等见光分解，结果直接影响了分化效果。笔者在此基础上做了进一步的改进 ， 将选择培养基上的抗性愈伤组织转到分化培养基上 ， 然后放置在黑暗下培养 7 d ， 再转到新的分化培 养基上光照下培养 ， 只需 10 d 左右就能分化成苗 ， 分化效率可达 85 %。该方法的优