加德纳菌生物膜在复发性细菌性阴道病中的作用研究

1、加德纳菌生物膜在复发性细菌性阴道病中的 作用研究隋龙余竑敏 苏婷婷【摘要】 目的 通过对阴道加德纳菌的生物膜形成能力和不同的 pH 环境下的生长情况进行评估，研究其生物膜形成的 致病机制及诱发耐药与导致 BV 复发的关系。方法 从 58 例 BV 患者阴道分泌物标本中分离培养出阴道加德纳菌株，检测其 在不同的 pH 环境下的生长情况，通过 K-B 法和肉汤稀释法检测其耐药情况，使用微量板半定量法检测其生物膜形成能力。 结果 加德纳菌在阴道酸性环境下生长受到抑制，而在碱性环境下能够正常生长。临床加德纳菌对克林霉素、红霉素、头孢 曲松、青霉素和万古霉素等敏感率较高，而对左氧氟沙星和甲硝唑的耐药率分

2、别为 67.2%和 63.8%。加德纳菌生物膜形成阳 性率为 48.3%。结论 BV 患者的阴道 pH 值升高，易于阴道加德纳菌的繁殖。加德纳菌的生物膜形成能力较强，可能与细菌 性阴道病治疗后易复发有关。【关键词】 致病菌 细菌性阴道病 微生态失衡 加德纳菌 生物膜 耐药Research of the role of Gardnerella Vaginalis in recurrent bacterial vaginosisYU Hong-min，SU Ting-ting，SUI LongDepartment of Gynecology，Key Laboratory of Female Rep

3、roductive Endocrine Related Diseases of Shanghai，Obstetrics and Gynecology Hospital，Fudan University，Shanghai 200011，ChinaCorresponding author: SUI Long, Email: suilong1Abstract: OBJECTIVE To evaluate the association of Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis on its pathogenesis and therapeut

4、ic efficacy. It also assesses the antimicrobial resistance of clinical isolates of Gardnerella vaginalis towards the currentcommonly-used antimicrobial drugs, metronidazole and clindamycin. Under various modifications of in-vitro environmental factors, thegrowth and colonization of Gardnerella vagin

5、alis can be appraised. METHODS Vaginal swabs were collected from women attending the gynaecology outpatient department and clinically diagnosed as bacterial vaginosis (BV) over a period of seven months from September2012 to February 2013. A total of 58 Gardnerella vaginalis isolates were identified

6、and evaluated its growth alteration under various pHfluctuations. Antibiotic resistance assay of clinical isolates was determined utilising the disk diffusion and broth microdilution methods, and employment of semi-quantification microtiter plate to assess biofilm-forming capacity. RESULES Growth of

7、 Gardnerella vaginaliswas restricted in acidic vaginal environment whereas alkaline condition was found be more conducive for its growth. High antimicrobial susceptibility testing of clinical isolates to clindamycin, erythromycin, ceftriaxone, penicillin and vancomycin was observed, whereas result o

8、f antibiotic resistance to levoflovaxin and metronidazole indicated 67.2% and 63.8%, respectively. 48.3% of the strains exhibitedstrong biofilm-f1orming ability. CONCLUSIONS A healthy female vagina usually confers an acidic environment which inhibits theovergrowth of pathogens. However, when pH elev

9、ates in the vagina of BV patients, Gardnerella vaginalis is more prone to colonize. This correlates its capacity to form biofilm with the propensity to cause recurrence of BV after treatment.Keywords：Pathogens; Bacterial vaginosis; Microbiota imbalance; Gardnerella vaginalis; Biofilm; Antibiotic res

10、istance细菌性阴道病（Bacterial vaginosis, BV）是由 于阴道内的微生态平衡紊乱，原来的优势菌群即乳杆菌的数量减少，厌氧菌和细菌性阴道病相关微生 物（BV-associated bacteria, BVAB）过盛繁殖，如阴道加德纳菌、阿托波菌等多种微生物，导致菌群失 调而引起的一组无阴道粘膜炎表现的症候群1。BV 是育龄妇女常见的阴道感染性疾病，约占 外阴、阴道感染的 40%50%。BV 的主要临床表 现是阴道分泌物异常虽多数患者没有临床症状， 但 BV 带来的健康问题却令女性苦恼。越来越多的 证据表明细菌性阴道病直接导致自然流产、早产、 足月前胎膜早破、羊水感染、产

11、后子宫内膜炎和剖 腹产后切口感染以及围产儿并发症等不良妊娠结 局2，。随着临床广谱抗菌药物的广泛使用，耐药菌株 的不断出现，该类感染性疾病的治疗已日益表现出 局限性，因此探讨 BV 患者的阴道内正常菌群的变化和致病菌的耐药情况显得尤为重要。细菌性阴道合以下条件：(1)一周内无口服或阴道置药史者；(2) 就诊前一周未进行阴道灌洗者；(3)非月经期及无阴 道出血症状；(4)非妊娠期妇女。二、研究方法1、菌株来源及诊断标准采用 Nugent 革兰染色评分法作为诊断标准， 从临床诊断为 BV 病人的阴道分泌物标本中分离培 养出 58 株阴道加德纳菌。根据阴道的三组优势菌 分别为乳杆菌形态（革兰阳性大杆

12、菌）、阴道加德 纳菌或拟杆菌形态（革兰染色变异或阴性球杆菌） 和动弯杆菌形态（革兰染色变异弯曲弧形杆菌）。 是三组形态细菌分值之和为总分，结果分为正常态（03 分）、过渡态或中间菌群态（46 分）和4病的发病及其复发的致病因素十分复杂，其发病机BV（710 分）。阴道加德纳菌标准菌株，购自制尚不清楚。BV 患者和健康女性阴道内存在包括 阴道加德纳菌、阿托波菌等多种微生物。研究已证 明阴道加德纳菌较其他 BV 致病菌更能生成簇状致 密的生物膜及赋予更强的细胞毒素，因此导致 BV 治疗后仍反复发作3。生物膜（biofilm）能保护细 菌抵抗抗生素的治疗和人体免疫系统的攻击并从 中不断释放细菌，从而

13、造成机体的反复感染。本研 究旨在通过对 BV 标本中阴道加德纳菌的分离、培 养出阴道加德纳菌株，检测其在不同的 pH 环境下 的生长情况，通过 K-B 法和肉汤稀释法检测其耐药 情况，使用微量板半定量法检测其生物膜形成能 力，进而研究其生物膜形成的致病机制及诱发耐药 与导致 BV 复发的关系。资料与方法 一、资料来源2012 年 9 月2013 年 3 月于复旦大学附属妇 产科医院门诊就诊的，取临床诊断为 BV 复发（一美国典型菌种保藏中心，编号： American Type Culture Collection，ATCC 14018），所需试剂多购自 英国 OXIOD 公司。2、细菌分离、鉴

14、定方法1）表面接种法：将阴道分泌物通过三区划线 接种于自制的哥伦比亚血平板上，37厌氧培养 48 h。观察有无形成针尖大小（0.30.5mm）、圆形、 光滑、不透明、不溶血（在人血或兔血琼脂平板上 可出现 溶血）的菌落。挑取特征菌落通过 API Strep 链球菌鉴定条作进一步鉴定。2）API 20 Strep 试验由 20 个管所组成的含测 定糖发酵的干燥底物。取 2ml 无菌 DH2O 试管，用 无菌棉签收集平板上的菌落，制成菌悬液，混浊度 为 McFarland 4。于前半部的试验条（VP 到 ADH） 每杯分装约 150ul 菌悬液，对 ADH 只充满管的部 分。后半部的试验条（RIB

15、 到 GLYG）：打开 API PG 培养基，转入剩下菌液约 0.5ml,充分混匀。用石蜡 油覆盖在 ADH 到 GLYG 试验管上，形成凸面。盖O年内曾有阴道瘙痒等不适主诉，使用过甲硝唑等阴上培养盒，于 37C 培养 4h 后，在 VP 管中加 1 滴道栓剂治疗史）的女性患者阴道分泌物标本 58 例， 从中分离培养出阴道加德纳菌株。临床标本收集符VP1 和 VP2，在 Hip 中加 2 滴 Nin 试剂，在 Pyra到 LAP 管中分别加入 Zym A 和 Zym B 试剂各 1 滴，等待 10min，参照色谱或读表读其结果。继续培养 20h，再读一次结果，并记录。3 试验为一组，每试 验标

16、记 1、2 和 4。在每组中对阳性反应的数字相加， 获得一个 7 位数，溶血反应构第 21 个试验，数字 为 4，参照分析图谱索引得出鉴定的种名，鉴定百 分率。如有与鉴定相矛盾的试验，通常参见该种的 阳性反应的百分比。3、细菌药敏情况检测（1）纸片扩散法（K-B 法）将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检 的加德纳菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取 琼脂中的水分溶解后会不断地向纸片周围区域扩 散，形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范 围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌 圈。抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程 度，并与该药对加德纳菌的最低抑菌浓度（Minimal inhibi

17、tory concentration, MIC）呈负相关，即抑菌圈 越大，则 MIC 越小。挑取 45 个纯培养菌落，用无菌生理盐水校 正菌液浊度，使其与标准比浊管的浓度相同（0.5 麦氏单位），涂布整个哥伦比亚平板表面，再重复 两次，每次旋转平板 60º，使整个平板涂布均匀， 最后用棉拭涂布平板四周边。经 37厌氧培养 6-8h。于室温中干燥 3-5min 后，用纸片分配器取药 敏纸片，分为克林霉素、红霉素、头孢曲松、青霉 素、万古霉素、左氧氟沙星和甲硝唑贴于平板表面。 将贴好纸片的平板置 37厌氧孵育 24h 后，用卡尺 量取抑菌圈直径。根据 CLSI M100 最新标准（参考

18、草绿色链球菌）将所测抑菌圈的大小，敏感（S）、 中介/中敏（I）及耐药（R）分别为 8mg/ml、8-16mg/ml 和 32mg/ml。测试加德纳菌时应测量生长受抑制区 而不是溶血受抑制区域。（2）肉汤稀释法药敏试验鉴于目 前美国临 床实验室 标准化研究所 ( Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)尚 无推荐可用于阴道加德纳菌药敏试验方法和判定标准，参考其推荐的常规肉汤稀释法进行操作并做 了部分改动5，因阴道加德纳菌在 Mueller-Hinton (MH)肉汤不能生长，在实验中使用 BHI 培养基进 行替代。1)用无菌接种环沾取

19、少许细菌菌种，临床阴道 加德纳菌菌株在哥伦比亚血平板表面分区划线，37厌氧孵育过夜; 2)从血平板上挑取单个菌落，接种至 35 mLBHI 液体培养基中，37静止培养至 24 h；3)菌液准备：将处于对数生长中期的菌液用 BHI 培养基调整接种量，通过紫外分光光度仪使 OD600 读数约为 0.5（相当于 0.5×108 CFU/mL），再 用 BHI 培养基 1：100 稀释，使细菌的终浓度约为 105。4)将抗生素即甲硝唑及克林霉素进行连续倍比 稀释，药物浓度范围根据 CLSI 推荐采用合适的浓 度梯度，若 CLSI 没有此种药物则参照同一类药物 的范围。每个孔中加入稀释好药物溶

20、液的最小量为 200L，因为在加入等体积的接种菌液时，药物将 被 1:2 稀释，所以各管中抗菌药物的浓度应是所需最终浓度的 2 倍；5)菌液接种：用微量移液器分别取 200L 稀 释好的菌液依次接种至装有 200L 含从高浓度 (1024mg/L)到低浓度(0.02mg/L)药物 BHI 培养基的 孔板中。这样孔板内的药物均被 1：2 稀释，菌液 的最终浓度约为 105CFU/mL。同时设立不加药物的 生长质控管和不加细菌的空白对照管；6) 培养和结果判断：将菌液置于 37，静止厌氧培养 18 小时，肉眼观察有无细菌的生长。MIC 为肉眼观察孔板中的细菌生长完全被抑制时的最 小药物浓度。4、加

21、德纳菌生长曲线的测定将过夜生长的加德纳菌 ATCC 14018 按 1:100 的比例分别接种至不同 pH 值 BHI 培养基中，pH 值 分别为：pH3.5, pH4.5, pH5.5, pH6.5, pH7.5, pH8.5和 pH9.5。经紫外分光光度仪调整接种量使 OD600读数起始约为 0.05。厌氧环境下，37静置培养， 每隔 1 h 测量一次 OD600，共测量 18 h。以 BHI 培 养基作为本底，实验重复两次，取平均值，最后根 据测量值绘制加德纳菌在不同 pH 环境下的生长曲 线。5、微量板半定量法检测生物膜的形成挑取血平板上单个加德纳菌菌落于 BHI 培养 基中培养 24

22、h，用含 0. 25% 葡萄糖的 BHI 培养基 1： 100 稀释后加入 96 孔培养板( 200L/孔)，37厌 氧静置培养 24h，弃菌液, PBS 清洗，甲醇固定 15min，室温干燥, 加入 2%结晶紫染色 8 min，水 洗至无色，室温干燥后, 用酶标仪测 OD570。各菌 株测得的 OD570 的平均值加 3 倍标准差值评价临床 加德纳菌菌株的生物膜形成能力6,7。重复上述操作资料采用 t 检验，p<0.05 有统计学意义。 结 果 一、临床加德纳菌菌株的耐药情况分析通过 K-B 法检测 58 株临床加德纳菌对 6 种常 用抗生素的敏感性。药敏结果显示，阴道加德纳菌 对克林

23、霉素、红霉素、头孢曲松、青霉素和万古霉 素敏感率较高，而对左氧氟沙星的耐药率高达 67.2% （见图 1）。鉴于临床上常用甲硝唑及克林霉 素治疗 BV，本研究同时通过改良的肉汤稀释法测 定了 58 株加德纳菌对甲硝唑和克林霉素的最低抑 菌浓度值（minimal inhibitory concentration, MIC）。 结果显示，37 株临床菌株对甲硝唑的 MIC 值 128mg/L，占所检测菌株的 63.8%，其余 21 株临床加德纳菌的甲哨唑的 MIC 范围为 0.2-56 mg/L，使用番红素染色。MIC50为 8 mg/L，MIC90为 16 mg/L。所测定的 586、激光共聚焦

24、显微镜(CLSM)观察加德纳菌生物膜形态选取 3 株能形成生物膜的临床加德纳菌菌株（临床菌株编号 81，515 和 730），将其过夜培养后， 按 1:100 的比例接种于玻璃底的 Fluoro dish 内，37有氧或厌氧条件下静置培养 36h。去上清，PBS 清洗 3 次，加入 1000L Live/Dead 染液（SYTO9 将活细菌染为绿色，PI 将死细菌染为红色），室温 放置 20min 后于激光共聚焦显微镜下观察。7、扫描电镜(SEM)观察加德纳菌生物膜选取 3 株能形成生物膜的临床加德纳菌菌株（临床菌株编号 81，515 和 730），将其过夜培养后， 按 1:100 的比例接种

25、于平底 96 孔聚乙烯细胞培养板 的圆形孔底，作为阴道加德纳菌生物膜生长介质。 有氧或厌氧条件下培养 36 h 的平皿经 PBS 洗涤 3 次，用 2%戊二醛固定 2h，真空干燥 72h，镀金， 型场发射扫描电子显微镜下观察。三、统计学方法应用 SPSSl9.0 版统计软件进行数据分析，阴道 加德纳菌生物膜的厚度以均数±标准差表示，计量株临床加德纳菌株均对克林霉素敏感，MIC 范围为0.2-3.2mg/L，MIC50 为 0.8 mg/L，MIC90 为 1.6 mg/L。图1 2012 年 58 株阴道加德纳菌的耐药性分析二、加德纳菌浮游菌形态观察（共聚焦显微镜 和扫描电镜）浮游加

26、德纳菌经 Live/Dead 染色后，活的细菌 被 SYTO9 染成绿色，死细菌被 PI 染成红色，在激 光共聚集显微镜下观察多呈球状或杆状，多个细菌 间有多种排列形式，有呈丝状和杆状，无荚膜鞭毛 和芽孢（见图 2）。对比使用结晶紫及番红素两种不同染料染色 阴道加德纳菌生物膜，两者比较测出的 OD570 值p>0.05，差异无统计学意义。图 2a,×630图 2b,×2500图 2c,×6300图 2d,×630图 2e,×2500图 2f,×6300图2 a-f 共聚焦显微镜下加德纳菌浮游菌形态观察浮游加德纳菌经 Live/D

27、ead 染液（SYTO 9 和 PI 配制成的混合染液）染色后，活的细菌被 SYTO 9 染成绿色，死细菌被 PI 染成红色。图 2a-c 为加德 纳菌 ATCC 14018 在激光共聚集显微镜的不同形 态；图 2d-f 为临床菌株 730（生物膜阴性）浮游的 形态观察，同样呈现多种形态生长，杆状形态居多，其中多个细菌间有多种排列形式。 在扫描电镜下对浮游的加德纳菌进行观察，也能很明显地观察到加德纳菌呈现多种形态，多为球 状和杆状。对不同加德纳菌的直径进行测量，多数 菌体直径在 0.4-2.2m，少数可达 6m（见图 3）。 图 3a, ×3000图 3b, ×3000图

28、3c, ×10000 图 3d, ×30000图 3e, ×30000图 3f, ×100000图3 a-f 扫描电子显微镜下加德纳菌浮游菌形态观察图 3a-c 浮游加德纳菌 ATCC 14018 在扫描电镜下的形态学特征，呈球状或杆状，不同的细菌大小不一； 图 3d-f 中对不同加德纳菌的直径进行了测量，分别为 722nm、751nm 和 2295.2nm。三、临床加德纳菌菌株的生物膜形成能力检测将 58 株分离培养的临床加德纳菌，于 37厌 氧静置培养 24h 后，对所形成的生物膜进行结晶紫 染色（见图 4），测定临床菌株的生物膜的 OD570 值。

29、 以标准菌株 ATCC 14018 的 OD570 的平均值加 3 倍标准差值为判断标准，本实验测定值为 0.26，OD570 值大于 0.26 判定为生物膜阳性菌株，而 OD570 小于 等于 0.26 的为生物膜阴性菌株。58 株临床加德纳 菌中共有 28 株生物膜形成阳性， 占总菌量的 48.3%。图4 不同菌株的生物膜形成能力用 BHI 培养基 1:100 稀释后加入 96 孔板内( 200L/孔) ,厌氧静置培养 36h 后，结晶紫染色，观 察不同菌株生物膜的厚度，用酶标仪测 OD 570 值。以 ATCC 14018 的 OD570 为标准，OD570 值>0.26 为生物膜

30、阳性菌株，而 OD5700.26 为生物膜阴性菌株。四、不同 pH 值对加德纳菌菌株的生长和生物膜 形成能力的影响1、通过对加德纳菌 ATCC 14018 在不同 pH 环 境下的生长曲线，发现在 pH3.5 和 pH4.5 的情况下， 加德纳菌生长缓慢，厌氧培养 18h，OD600 只达到 0.2 和 0.6.而在 pH8.5 和 pH9.5 时，生长速度并没有 明显降低，厌氧培养 18h 后，OD 值都能达到 2.5 左右，与加德纳菌在最适 pH 值（pH=7.5）环境下 能达到的最高 OD 值没有明显差异（见图 5）。图5 不同 pH 环境下的加德纳菌的生长曲线2、由于加德纳菌标准菌种

31、ATCC14018 不能形 成生物膜，故本研究选择了能形成生物膜的临床菌 株 81，515 和 730，评估不同 pH 值对加德纳菌生 物膜形成能力的影响。如图 6 所示，临床菌株 81 在最适 pH 值（pH=7.5）时，生物膜形成能力最强。 随着培养基 pH 的降低或升高，加德纳临床菌株 81 的生物膜形成能力都有所降低，其中培养基 pH 值 为 3.5 和 4.5 时，生物膜形成能力下降最为明显；而当培养基的 pH 值偏碱为 8.5 和 9.5 时，菌株 81 的生物膜形成能力下降水平较培养基 pH 偏酸时 弱。加德纳临床菌株 515 和 730 在上述不同 pH 环境下出现了同样的情形

32、。图 6 不同 pH 环境下的临床加德纳菌菌株 81生物膜形成情况a）加德纳菌生物膜的形态观察加德纳菌临床菌株 81，515 和 730 在 37分别 在厌氧及有氧状态下静置培养 36h 的生物膜经 Live/Dead 染色后，置于激光共聚焦显微镜下观察。 在 Z 轴方向以 1m 的间隔进行断层扫描，获取生 物膜各层面的一系列图像，通过 IMARIS 7.0.0 (Bitplane)软件组合呈三维图像。每个加德纳菌临床 菌株生物膜样本随机选取 3 个视野，对形成的生物 膜厚度进行测量，在有氧情况下，临床菌株 81，515 和 730 的平均厚度分别为：9.5±0.2m，8.2+0.2

33、 m，8.9+0.1m，而生物膜结构较为疏松（见图 7）。 但在厌氧状态下，临床菌株 81，515 和 730 的平均 厚度分别为：12.3+0.3m，10.8+0.2m，11.2+0.1 m，生物膜形态非常致密（见图 8）。经培养后发 现加德纳菌在有氧和厌氧情况下形成生物膜的能 力有明显差异（p<0.05）。 图 7a, ×630图 7b, ×2500图 7c, ×630图 7d, ×2500图7 共聚焦显微镜下加德纳菌临床菌株 81 在有氧状态下的生物膜形态观察图 7a-b 为临床菌株 81 有氧状态下形成的生物膜经 Live/Dead 染液染

34、色后，在激光共聚焦显微镜观察到的三维图像；图 7c-d 为临床菌株 81 有氧状态下形成的生物膜的平面图。生物膜明显有松散脱落迹象，生物膜内细菌绝大部分为活菌（被 SYTO9 染成绿色），而黄色为 PI 和 SYTO9 复染。 图 8a, ×630图 8b, ×630图 8c, ×2500 图 8d, ×630图 8e,×630图 8f, ×2500图8 共聚焦显微镜下加德纳菌在厌氧状态的生物膜形态观察图 8a 和 8d 为临床菌株 515 在厌氧状态形成生物膜的三维图像和平面图；图 8b-c 和 8e-f 为临床菌株 81 在厌氧

35、状态形成生物膜的三维图像和平面图。在高倍镜下（2500 倍），可清楚地观察到生物膜内细菌的排列情况，被染成 红色的死菌较有氧状态下明显增多，但生物膜的结构更加致密。在扫描电镜下，生物膜阴性加德纳菌 ATCC 14018 只能在平板上形成少量的菌落，菌落稀疏散在分布，而生物膜阳性的加德纳菌临床菌株 81 和515 能形成致密的生物膜，电子显微镜下可观察到 这些临床菌株的胞间基质分泌较多，将加德纳菌的 菌体包被其中，导致细菌轮廓不清（见图 9）。图 9a图 9b图 9c图 9d图 9e图 9f图 9a- f 扫描电镜下加德纳菌生物膜形态观察图 9a 和 9d 为生物膜阴性菌株在扫描电镜下的形态；图

36、 9b 和 9e 为临床菌株 81 形成的生物膜；图9c 和图 9f 为临床菌株 515 形成的生物膜在电镜下的形态。五、加德纳菌耐药性与生物膜形成能力的关系根据阴道加德纳菌生物膜的形成能力，使用发病率有上升趋势。其治疗的复杂性及引起该疾病 的相关致病菌一直是研究的热点，在全球抗生素的8ATCC 14018 在 OD570 为 0.26 所形成的生物膜作为耐药报道逐年递增。本实验对 BV 病人中分离的生物膜阳性及阴性的截断点。58 株临床菌中，生物 膜形成阳性占 48.3% ，其对甲硝唑耐药有 67.9%， 而在生物膜阴性的耐药率有 40%。对这两组菌株的 生物膜形成能力进行统计学分析，二者有

37、明显差异（p=0.034<0.05） 见表 1。表 1 加德纳菌甲硝唑耐药性与生物膜形成能力的 关系 甲硝唑耐生物膜阳 19生物膜阴 12菌株总 31甲硝唑敏91827 菌株总数 28 30 58 讨论细菌性阴道病是妇产科常见的疾病，近年来其58 株临床加德纳菌进行了耐药性分析，结果显示该菌对克林霉素、红霉素、头孢曲松、青霉素和万古 霉素耐药率较低，而对临床常用抗菌药物左氧氟沙 星和甲硝唑的耐药率较高。有文献报道分离自尿路 感染患 者的 阴道加 德纳 菌对甲 硝唑 的耐药率 65.8%9，也有文献报道从 BV 病人中分离加德纳菌 对甲硝唑的耐药率为 68%10，与本文报道的耐药比 例较为

38、一致，但对其它克林霉素类和头孢霉素类抗 生素的敏感性不太一致。由此可见，不同地区的用 药习惯的差别或流行菌株的不同会出现不同的耐 药现象，应根据个体各自的药敏结果选用敏感的抗 菌素治疗临床避免使用已耐药药物，以取得最佳疗 效。细菌生物膜基质可降低抗生素穿透生物膜结构能力，导致生物膜中的细菌所接触的抗生素浓度 显著降低。生物膜内的养份和氧气量含量较少，多 数细菌代谢迟缓，生长缓慢，因此对药物更不敏感。 本研究通过对临床加德纳菌生物膜形成能力的检 测，发现 48.3%的菌株都能形成生物膜，而有报道 显示，来源于非 BV 病人的加德纳菌株的生物膜阳 性率很低，说明 BV 发病与生物形成能力有关。也

39、有报道说耐药菌株中的生物膜阳性的比例较高，加 德纳菌生物膜的扫描电镜照片显示，生物膜中胞间 基质分泌较多，将细菌包被在其中，从生物膜三维 结构测量出生物膜厚度可达到 12m，导致现临床 常用抗生素很难将生长在其中的细菌完全灭活，使 得细菌表现出更强的耐药性，有报道显示生物膜内 细菌对抗生素的耐药性增加了 100-1000 倍，从而容 易形成慢性、持续性感染。临床使用抗生素可使 BV 的症状暂缓解，但不能完全清除生物膜内的加德纳 菌，还会对健康阴道微生态产生不良影响，使临床 常规治疗 BV 的抗菌药不能获得理想疗效，且产生 耐药的细菌株及致病菌逐渐增多，导致 BV 反复发 作，迁延不愈的情况。正

40、常女性阴道内寄生有大量微生物，以乳杆菌 为主，另外包括奇异菌属、巨球型菌属、加德纳菌 属及消化链球菌属等少量共生菌，通常不致病。乳 杆菌是健康妇女阴道内最重要的优势菌群，产生乳 酸、过氧化氢和细菌素等，能维持阴道的酸性环境 pH 范围在 3.84.4，抑制病原体入侵和其他菌群的 过度繁殖11。阴道内各种微生物群相互制约、相互 依赖，共同保持阴道微生态的平衡，而这种平衡一 旦被打破，乳杆菌失去优势，其他微生物过度生长， 导致炎症发生12。加德纳菌在不同 pH 环境下的生长曲线显示， 在偏酸的 pH3.5 和 pH4.5 的情况下加德纳菌生长缓 慢，而在偏碱的 pH8.5 和 pH9.5 时，生长

41、速度并没 有明显降低。同样当 pH 值为 3.5 和 4.5 时，加德纳 菌生物膜形成能力下降最为明显，而 pH 值偏碱为 8.5 和 9.5 时，加德纳菌生物膜形成能力仅有所下降，但较培养基 pH 偏酸时弱。说明加德纳菌适合在碱 性环境下生长，而阴道的酸性环境可抑制其生长。 而且厌氧的环境，更促使其繁殖，这可能与阴道分 泌物在厌氧和有氧环境下 pH 值和乳酸量有关，厌 氧环境下其 pH 较低及乳酸含量较高。阴道加德纳 菌在 pH<4.5 生长缓慢，由于厌氧菌产生脱羧酶， 可促进阴道加德纳菌分解氨基酸，生成氨和胺，使 pH 提高，其菌因此获得适宜的 pH 环境生长，逐渐 增殖为优势菌。p

42、H 超过 5.5 时，会严重削弱中性粒 细胞的趋化、吞噬及杀菌功能。阴道内 pH 升高的 同时增加异性间 HIV 的传播和易感性，并与胎膜早 破及早产有关。有研究显示阴道内 pH 上升有利于 细菌粘附到真核细胞上，阴道上皮真核细胞上存在 特定细菌的受体，阴道内菌群的改变会影响自身受 体的特异性。因此保持产过氧化氢乳杆菌的量在正 常范围乃是恢复阴道微生态的平衡的关键因素，为 治疗 BV 及可减少其导致的并发症。标准治疗方案虽然短期内消除临床症状，但不 能清除细菌生物膜，现有治疗措施包括延长抗生素 疗程及联合用药等。首选方案是阴道用甲硝唑栓剂 10 天，两周一疗程，共 6 个月。替代方案为开始用

43、克林霉素栓剂治疗，之后在月经后使用甲硝唑栓剂 治疗，剂量及用法同前，但疗程延长至 2 个月13。 复发性 BV 的治疗难度比较大，再次治疗后依然会 有复发的可能。现存抗生素不能将生长在生物膜中 的细菌完全灭活是治疗后持续复发的一大因素，因 此新的能够有效杀伤生物膜内活菌的抗生素的开 发变得尤为迫切。基于阴道微生态在 BV 发病过程 中的重要性，使用乳杆菌胶囊恢复阴道菌群平衡为 治疗 BV 提供了新的治疗手段。乳酸能发挥广谱抗 菌作用及其代谢产物可刺激阴道黏膜细胞免疫的 功能，提高局部免疫力，抑制其他致病菌的繁殖。 有研究表明在口服甲硝唑片的基础上，阴道内放置 乳杆菌胶囊，可改变失衡的厌氧菌和需

44、氧菌比例， 恢复阴道微生态平衡，短期效果明显，且无药物不 良反应14。最近也有研究表明特定亚型的阴道加德纳菌 菌株与 BV 发病相关，导致 BV 的临床菌株比非 BV 的菌株更易致病，提示不同亚型的加德纳菌株的毒 力有显著差异，致病能力不同。导致 BV 及复发的 因素有很多，有阴道微生态的变化引起的菌群失调 15，致病菌产生了多种耐药机制等，本实验对 BV 患者中分离的临床加德纳菌的耐药性和生物膜形 成能力等方面做了分析，探讨了加德纳菌在细菌性 阴道病发病和治疗过程中所起的作用。综合以上， BV 病因复杂，阴道加德纳菌各生物亚型与 BV 之 间相互关系及其致病的具体机制还有待进一步研 究。参考

45、文献1 Taylor B D, Darville T, Haggerty C L. Does bacterial vaginosis cause pelvic inflammatory disease?J. Sex Transm Dis,2013,40(2):117-122.2 Turovskiy Y, Sutyak N K, Chikindas M L. The aetiology of bacterial vaginosisJ. J Appl Microbiol,2011,110(5):1105- 1128.3 贾海军，李金科，胡丽娜，等. 非妊娠期妇女 BV 和 VVC发病状况及 相关危

46、险因 素分析 J. 实用妇产科杂 志,2008,24(5):283-286.4 Fethers K, Twin J, Fairley C K, et al. Bacterial vaginosis (BV) candidate bacteria: associations with BV and behavi- oural practices in sexually-experienced and inexperienced womenJ. PLoS One,2012,7(2):e30633.5 Clinical and Laboratory Standards Institute: Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, 7th.Z. 2006.6 Patterson J L, Girerd P H, Karjane N W, et al. Effect of biofilm phenotype on resistance of Gardnerella vaginalis to hydrogen peroxide and lactic acidJ