临床样本DNA模板的常规制备方法

1、临床样本 DNA 模板的常规制备方法、病毒标本中提取 DNA(支原体、腺病毒)处理方法(1 )将擦拭过的咽拭纸放入1.5ml 装有 1ml 生理盐水的 eppendorf 管中(2 )以 10,000r/min 离心 5 分钟，去上清液。(3 )沉淀物加入 30 ml TE液混匀后煮沸 10 分钟，4 C 保存备用。二、从细菌中提取 DNA1 . NG (淋球菌)DNA 的提取 标本可取自尿道、生殖道或结膜分泌物(1 )取男性尿道口或女性宫颈处分泌物于事先加有1ml 生理盐水的 eppendorf 管内(2 )振荡棉签或拭纸使 NG 释放出来。(8 )加入 2 倍体积无水乙醇沉淀 DNA。(9

2、 )去乙醇，空气干燥后加入30 卩l的 TE 液，置 4C冰箱保存备用。2 . TB (结核杆菌)DNA 的提取临床标本可来源于痰、 尿、支气管灌洗液、胸水、腹水、心包积液等。处理方法也不尽相同，除痰标本外,其他标本大致相同。注意痰标本的留取一定要取次日早上的晨痰，留存器皿要无菌消毒，避免污染。(1 )痰标本 TB DNA 的提取1挑少许痰液放入 1.5ml 的 eppendorf 管中，加入 5mo1/L NaOH 500gl混匀，使痰液变稀，室温中摇动 20 分钟。2加入 1mo1/L NaH2PO4600gl混匀(起中和作用)，10,000r/min 离心 5 分钟。3去上清液，补加 T

3、E 至 500gl混匀，加少许溶菌酶。4置 37C消化 30 分钟。5加等体积的酚、氯仿、异戊醇(25 : 24 : 1 )混合液，摇匀 20 分钟。610,000r/min 离心 5 分钟，将上清液移至另一干净eppendorf 管中，加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液，继续摇匀 20 分钟。710,000r/min 离心 5 分钟，移上清液于另一小管中，加入等体积异丙醇摇匀。810,000r/min 离心 5 分钟，去上清液，置空气中干燥，加入 30glTE 溶解沉淀物，置 4C冰箱备用。(2 )胸水、腹水、支气管灌洗液、尿液、心包积液标本TB DNA 的提取1将上述液体 3ml ，经反复

4、离心，去上清液，留沉淀物。2按上述痰标本处理操作步骤-提取。三、组织内基因 DNA 的提取1 . HPV (尖锐湿疣)提取(1 )取绿豆大小的组织样品于 1.5ml 的 eppendorf 管中，加入细胞裂解液少许，裂解液含 0.1mo1/LNaC1、0.2mol/L 蔗糖、0.01 mol/L EDTA 、0.3mol/L tris( pH8.0 )和 0.5%-1% SDS(2 )用眼科剪剪碎组织(越细越好)，补足裂解液至400gl，并搅散组织块。(3 )置 60C65C水浴消化 2-3 小时，中间摇匀两次。(4 )加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液抽提，摇匀20 分钟。(5 ) 10,0

5、00r/min 离心 5 分钟，上清液移入新的eppendorf管中，用两倍体积的乙醇沉淀DNA(6)10,000r/min 离心 5 分钟，去上清液，空气干燥沉淀物，加入30 卩l的 TE，置 4 C 保存备用。2 各种肿瘤组织提取(胃、肠、心肌、骨骼肌、肝、腺癌、子宫、绒毛等)(1 )取绿豆大小的组织样品于1.5ml 的 eppendorf 管中，加入细胞裂解液少许，每10ml 裂解液含有：1 mol/L Tris-HCI 0.1ml0.5mol/L EDTA 2ml5 mol/L NaC1 0.2ml20% SDS 1ml200 卩 g/卩蛋白酶 K 1ml1 mol/L DTT 0.3

6、9ml(2 )用眼科剪尽量剪细组织块，补加细胞裂解液至500gl o(3 ) 55C66C保温 23 小时，中间摇匀两次。(4 )加入等休积的酚、氯仿、异戊醇混合液摇匀20 分钟，10,000r/min 离心 5 分钟。(5 )上清液移入新的 eppendorf管中，加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液继续摇匀20 分钟，10,000r/min离心 5 分钟。(6 )上清液移入新的 eppendorf 管中，加入 2 倍体积无水乙醇沉淀 DNA。(7 )挑出 DNA，用 70% 乙醇洗两次，空气干燥，加适量 TE 溶解 DNA (根据 DNA 量决定加入 TE 量)，置 4C保存备用。四、血标本

7、 DNA 的提取方法一：(1 )取抗凝外周血 50 卩l，加入 6mol/L ，NaI 50 卩l，混匀，振荡 30 秒。(2 )加等体积的氯仿、异戊醇混合液，振荡30 秒。(3 ) 10,00012,000r/min离心 25 分钟。(4 )取上清液移至新的 eppendorf管中，加入异丙醇 80gl混匀，至沉淀产生。(5 ) 12,000r/min 离心 3 分钟，去掉异丙醇，37% 异丙醇再洗一次，离心，去上清液，沉淀物干燥 后(放室温)，加入 30 卩l无菌水溶解，置 4C保存备用。方法二：(1 )取 10ml 外周血，放于 50ml 管中，按 1.3:10 加入 ACD 抗凝。(2

8、 ) 4,000r/min 离心 10 分钟，去上清液。(3 )加 1.7%NH4CI 至 50ml ，混匀，放 37C保温 45 分钟。(4 ) 4,000r/min 离心 10 分钟，去上清液。(5 )加入 50ml PBS 液混匀，4,000r/min 离心 10 分钟。(6 )去上清液，沉淀物中补加TE 液至 10ml ，充分混匀。(7 )加入 2.5ml 5mol/L NaClO4,混匀，力口 3ml 10% 的 SDS 混匀。(8 )置 55C60C保温 23 小时。(9 )加入等体积的酚、氯仿、异戊醇(25 : 24 : 1 )混合液摇匀 40 分钟。(10)4,000r/min

9、 离心 10 分钟，轻轻将上清液移入新的eppendorf 管中。(11 )用 2 倍体积无水乙醇沉淀 DNA，轻摇，挑出悬浮 DNA 放入新管中。(12 )加入 5 ml 的 TE 液，溶解后加 50gl RNA 酶(20mg/ml)。(13 )置 37C温箱中保温 1 小时，加 50 卩 1 10%SDS 、100gl 20mg/ml 的蛋白酶 K、120 卩 1 0.5mol/L 的 EDTA 混匀，37C过夜。(14 )加 5ml TE 液，混匀后加 10ml 酚、氯仿、异戊醇(25 : 24 : 1 )混合液，混匀，放置 40 分 钟。(15 ) 4,000r/min 离心 10 分

10、钟，去上清液，加入 2 倍体积的无水乙醇，沉淀DNA，挑出 DNA 用75%乙醇洗两次。(16 )空气干燥后，加入适量 TE 溶解 DNA，置 4C备用。人最终要寻找的，就是最爱的那个自己。只是这个自己，有人终其一生也未找到；有人只揭开了冰山的一角，有人有幸会晤一次，却已用尽一生。人生最难抵达的其实就是自己。古希腊哲学大师亚里士多德说：人有两种，一种即 吃饭是为了活着”一种是 活着是为了吃饭”一个人之所以伟大，首先是因为他有超于常人的心。志当存高远”风物长宜放眼量”这些古语皆鼓舞人们要树立雄无数个自己，万千种模样，万千愫情怀。有的和你心手相牵，有的和你对抗，有的给你雪中送炭，有的给你烦忧与其说

11、人的一生是同命运抗争，与性格妥协，不如说是与自己抗争，与自己妥协。我不敢恭维我所有的自己都是美好的，因为总有个对抗的声音：你还没有这样的底气。”很惭愧，坦白说，自己就是这个样子：卑微过，像一棵草，像一只蚁，甚至像一粒土块，但拒绝猥琐！懦弱过，像掉落下来的果实，被人掸掉的灰尘，但拒绝屈膝，宁可以卵击石，以渺 小决战强大。自私过，比如遇到喜欢的人或物，也想不择手段，据为己有。贪婪过，比如面对名利、金钱、豪宅名车，风花雪月，也会心旌摇摇，浮想联翩。倔强过，比如面对误解、轻蔑，有泪也待到无人处再流，有委屈也不诉说，不申辩，直到做好，给自己证明，给自己看！温柔过，当爱如春风袭来，当情如花朵芳醇，黄昏月下，你侬我侬。强大过，内刚外柔，和风雨搏击，和坎坷宣战，不失初心，不忘梦想，虽败犹荣。这样的自己一个个站到镜中来，千面万孔。有的隐着，有的浮着，有的张扬，有的压抑，有的狂狷，有的沉寂，有的暴躁，有的温良庸俗的自己，逐流的自己，又兼点若仙的自己，美的自己，丑的自己，千篇一律的自己，独一无二的自己。我们总想寻一座庙宇，来安放尘世的疲惫，寻一种宗教，来稀释灵魂里的荒凉。到头来，却发现，苦苦向往的湖光山色，原来一直在自己的心里，我就是自己的庙宇，我就是自己的信仰。 渺小如己，伟大如己！王是自己，囚是自己。庙堂是自己，