基因工程抗体2013

1、工程抗体临床肿瘤治疗的难点Ø 常规的放、化疗方案选择性较差Ø 肿瘤细胞产生耐药性Ø 肿瘤病灶发生微小转移靶向治疗Ø小化合物Ø 生物大抗体v 特异性v 多样性v的定向性临床治疗的候选抗体Ø 抗血清（多克隆抗体）Ø单克隆抗体Ø 嵌合抗体和改型（CDR移植）抗体Ø 人源抗体免疫反应HAMAHACA HAHA鼠单克隆抗体可变区组cDNA的克隆抗体可变区的克隆、构建与表达噬菌体抗体库的构建示意图Assembly of VH and VL gene using a linker(G 4 S) 3VHlinkerVLP

2、CRVLVHDigested withSfiI and NotI , ligationVHVLE-tag fd geneIIISfiIAmprNotIpCANTAB5E原理： 吸附洗脱扩增RT-PCR扩增抗体可变区和单链抗体的拼接1 23 4M5 678BstNI酶切图谱上1-8：PCR产物；下1-8：PCR产物BstNI酶切；M：lDNA/ EcoRI+HindIII3轮panning后，获得一均一文库ELISA和免疫组化法鉴定scFv阳性空白对照（PBS ）对照抗CD3 scFv（M13KO7）抗体噬菌体scFv抗体片断的SDS-PAGEstIIVHCH1stIIVLCLstIIVHCH1

3、(CPP)3s sFabF(ab)2s ss sFab 表达载体构建图F(ab)2表达载体的构建pYZcpp3非 还 原 条 件 SDS-PAGE 分 析纯化的抗CD20 F(ab)2 SDS-PAGE分析纯化的抗CD20 F(ab)2 HPLC分析(Raji细胞)1:2:Fab3:F(ab)24:阳性对照对照抗CD20 Fab和F(ab)2的药代动力学Fab半衰期为6小时F(ab)2半衰期为36小时.807060504030201003.125 6.25 12.52550100¿¹ åÌ Å¨¶È £&

4、#168;¦Ì g/ml£©F(ab')2Fab'F(ab)2的IC50=22.8 g/mlFab的IC50=45.9 g/ml抑瘤率=64%ÒÖÆÖÂÊ£¨%£©肿瘤体积（mm3）700600500400300200100013 16 19 22 25 28 31时间（天）治疗组对照组大小排阻层析分析l Diabody：77.29minl ANTI-PGP SCFV：90.10minl 66KD：75.16minl 45KD：79.39

5、minl 25KD：90.18min*Diabody的量约为50KDa抗PGP/抗CD3 Diabody与CD3及PGP靶抗原的特异性结合a,b,c: Jurkat cellsd,e,f: K562/A02 cellsK562/A02K562抗PGP/抗CD3Diabody介导的细胞毒作用Diabody(400ng/ml)60scFv- CD3+scFv Pgp(400ng/ml)PBS504030201002512.56.253.1E:T RATIO激活的T淋巴细胞对耐药细胞K562/A02裂解作用%SPECIFICLYSI抗PGP/抗CD3Diabody介导的细胞毒作用scFv- CD3+

6、scFvPgp(400ng/ml)35Diabody(400ng/ml)PBS3025201510502512.5 6.25E:T RATIO3.1激活的T淋巴细胞对敏感细胞K562裂解作用%SPECIFIC LYSIS抗PGP/抗CD3Diabody介导的体内活性PBSDiabody CTLADMCTL+Diabody300025002000undetecedtumor150010005000411182532394653 (天）耐药细胞K562/A02肿瘤体积（mm3)抗PGP/抗CD3Diabody介导的体内活性3000PBSDiabody CTLCTL+DiabodyADM250020

7、001500100050004111825323946 (天）敏感细胞K562肿瘤体积（mm3)几种四价双特异抗体预靶向的放射免疫治疗抗CD20单克隆抗体抗生物素蛋白菌素交联剂后注入90YDOTA生物素，治疗非金淋巴瘤靶向CD20的抗肿瘤烯二炔强化抗体融合蛋白stII VHCH1LDPstIIVLCL抗CD20嵌合Fab-LDP融合蛋白的SDS-PAGE分析FACS分析抗CD20人鼠嵌合Fab-LDP融合蛋白与B淋巴瘤细胞的结合1.3X109 M-11.22X109M-1抗CD20人鼠嵌合Fab-LDP融合蛋白在鼠皮下B淋巴细胞移植瘤部位的富集移植瘤移植瘤CD20Fab-LDM对B淋巴瘤细胞的

8、作用(体外)细胞系IC50（mol/l)CD20Fab-LDMLDMDaudiRaji0.8 x 10-100.9 x 10-102.9 x 10-103.1 x 10-10CD20Fab-LDM对B淋巴瘤细胞的作用(体内)瘤 体积(mm3)20001750PBSCD20Fab1500CD20Fab-LDM0.125mg/Kg1250LDM0.05mg/Kg1000CD20Fab-LDM0.25mg/Kg7505002500时间 (天)CD20Fab-LDM对B淋巴瘤细胞的作用(体内)瘤 体积（mm3）3000PBS2500CD20Fab-LDM0.125mg/KgCD20Fab-LDM0.2

9、5mg/Kg2000LDM0.025mg/Kg1500LDM0.05mg/Kg1000500253035404550时间 (天 )抗体的三维结构Ø X-ray衍射Ø NMRØ 蛋白质同源模建FvArg-H44 Ser-L105DiabodydsPgp-Diabody (a)和dsCD3-Diabody (b) SDS-PAGE电泳分析'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization+PHMA02Peptide 50uM

10、Peptide 100uMCompetitive inhibition on PHMA02 binding to Pgp in K562/A02 cells with mimetic peptideC6和m2表达的可溶性抗CD3 scFv抗体片断的SDS-PAGEphoAVLstIIMarker12Amp rCLstII2000 bpVH1000 bppYZFcd20750 bp500 bpCH1250 bp100 bporiTet1轻链VL; 2.重链VHstIIVL CLstIIVH CH1免疫荧光竞争试验CD20-7+HI47CD20-2+HI47HIT3aHI4770.86%0.59%

11、37.55%98%CD20-7竞争性抑制HI47与Raji细胞的结合的能力强于CD20-2抗CD20抗体Fab的亲和力Ka: CD20-2 1´109 M-1 CD20-7 2.2´109 M-1CD20-7与Raji细胞的亲合力高于CD20-2抗CD20抗体对Raji细胞生长的抑制作用对照组OD-实验组OD抑制率% =×100对照组OD抑制率% = a lgx+b x: 样品浓度IC50=10 (50-b)/aCD20-7: 31.51 mg/mlCD20-2: 63.70 mg/ml与亲和力的实验结果相符合cell growth inhibition rate %8070CD20-7CD20-26050403020100LgXHI47(m)R A N S S V S Y M L轻链：CDR1-LHI47R A S S S V S Y M L核糖体展示技术抗体的表达&#