2018年浙江省医药卫生科技奖推荐项目

1、2018年浙江省医药卫生科技奖推荐项目信 息 表项目名称RR酶表达和酶活性异常在结直肠癌发病中的作用机制及其临床意义项目简介本成果在台州市科技计划项目（编号：1301ky55）、浙江省医学会临床科研基金（编号：2013ZYC-A144）资助下，自2013年开始进行了RR酶表达和酶活性异常在结直肠癌发病中的作用机制及其临床意义的研究。根据项目合同，本课题由三门县人民医院（浙江大学医学院附属第一医院三门湾分院）负责承担，浙江大学医学院合作完成。通过3年多的研究，圆满完成既定计划。通过本课题的实施，从细胞和动物层面，证实了RR酶小亚基RRM2表达在结直肠癌发生发展过程中的重要作用，并探索了其可能的分

2、子机制及与一线化疗方案FOLFOX的相关性，为进一步科学研究奠定了基础。为研究结直肠癌与RR酶的关系，本课题组首先收集了三门县人民医院2005年1月-2010年12月手术切除经病理检查证实为原发性结直肠癌标本192例，并取距离肿瘤边缘1cm处组织为癌旁组织。采用免疫组化二步法检测结直肠癌石蜡切片组织中RR酶三个亚基RRM1,RRM2和RRM2B的表达，结果表明RRM2在大多数结直肠癌组织中高表达，并与肿瘤的分化、转移及预后密切相关，而RRM1和RRM2B与肿瘤大小正相关，与转移呈负相关。本研究提示RRM2可能在结直肠癌发生发展中起着类癌基因作用，因此，课题组选择RRM2继续以下研究。为研究RR

3、M2调控结直肠癌发生发展的分子机制，课题组查阅了国内外文献，发现在胰腺癌细胞系Panc1中，E2F1可转录激活RRM2的表达(Lai and Chou et al., 2014)，但关于其在结直肠癌中以及与肿瘤恶性表型的关系却尚未见报道。本课题组在多株结直肠癌细胞系中证实E2F1可转录激活RRM2的表达，并选择E2F1与RRM2表达水平均较高的HT29细胞及表达水平均较低的RKO细胞继续研究。随后课题组在HT29细胞中干扰E2F1并过表达RRM2水平，在RKO细胞中过表达E2F1并干扰RRM2，应用CCK8实验、EDU实验、划痕实验及transwell实验分别检测其对细胞生长、增殖、迁移及侵袭

4、的影响，结果显示增强E2F1及RRM2表达可促进细胞生长、增殖、迁移及侵袭，反之则抑制细胞生长、增殖、迁移及侵袭能力。随后课题组应用免疫组化法检测E2F1与RRM2在结直肠癌细胞中的表达水平，发现两者在肠癌组织中高表达并呈正相关，且与肿瘤的淋巴结转移，TNM分期，远端转移及不良预后密切相关。同时课题组在应用染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)对RRM2上游启动子区域进行分析时发现其存在CREB结合位点。为研究CREB与RRM2的相关性及对结直肠癌细胞恶性表型的影响，课题组首先对TCGA数据库进行分析，发现CREB家族成员CREB1与RRM2

5、 mRNA水平正相关，随后应用免疫组化法检测显示CREB1在结直肠癌组织中表达水平也增高，并与RRM2表达正相关。为进一步研究其调控机制，课题组应用ChIP及报告基因法证实CREB1为RRM2的上游基因，并可直接转录激活RRM2的表达。进一步体外细胞实验和体内裸鼠实验结果显示，CREB1可促进细胞生长、增殖、迁移及侵袭，而过表达CREB1同时干扰RRM2可抑制肠癌细胞的生长、增殖、迁移及侵袭等生物学功能。那么E2F1与CREB1之间是否存在着某种联系呢，课题组应用western blot和RT-PCR技术发现过表达E2F1后CREB1表达上调，反之则表达水平降低。说明E2F1可能通过上调CRE

6、B1的表达激活RRM2基因，从而促进结直肠癌细胞的恶性生物学表型。为进一步研究RRM2在临床上的重要意义，课题组针对结直肠癌患者RRM2的表达水平与一线化疗方案FOLFOX之间关系进行分析，发现未应用FOLFOX化疗患者，RRM2低表达组预后明显较好。而针对所有患者的分析发现RRM2低表达组应用FOLFOX方案化疗后较未应用组预后佳，而RRM2高表达组应用FOLFOX方案化疗与未应用组，预后无显著性差异。综合以上研究及国内外文献报道，本课题组认为E2F1/CREB/RRM2信号通路与结直肠癌的生长、增殖、迁移、侵袭及转移等生物学功能密切相关，其表达水平与一线化疗方案FOLFOX的疗效密切相关，

7、可能参与化疗药物耐药过程。因此该通路有望成为治疗结直肠癌的新型基因药物靶点。相信随着研究的不断深入，以E2F1/CREB1/RRM2信号通路为靶点的肿瘤治疗将可能受到人们越来越多的关注。客观评价1、与国内外相关技术的比较：目前国内外已有文献报道了RRM2在结直肠癌组织的表达及对对癌细胞增殖和迁徙的影响，KRAS介导的RRM2表达上调对于结直肠癌细胞系的增殖的影响等相关研究报道，但对RRM2促进结直肠癌发生发展的具体作用机制目前尚不明确，其与临床化疗敏感性关系亦尚未见相关的系统性研究。本研究通过核糖核苷酸还原酶小亚基RRM2在结直肠癌发生发展中的作用机制及其临床意义进行研究分析，首次从转录调控角

8、度提出E2F1/CREB1/RRM2信号通路在促进结直肠癌发生发展中的重要作用，并发现RRM2表达水平对FOLFOX化疗方案疗效的重要预测价值， RRM2低表达患者，应用FOLFOX化疗可明显延长其生存期，因此针对RRM2高表达患者若是应用RRM2抑制剂联合FOLFOX化疗是否能大大改善患者预后，提高其化疗疗效，这将为日后抗肿瘤治疗提供新的方向。相信随着研究的不断深入，以E2F1/CREB1/RRM2信号通路为靶点的肿瘤治疗及RRM2抑制剂联合一线化疗药物的疗效研究将可能受到人们越来越多的关注。2、科技查新报告委托项目RR酶表达和酶活性异常在结直肠癌发病中的作用机制及其临床意义,发现E2F1及

9、CREB1对RRM2的转录调控作用,将E2F1、CREB1、RRM2三个因子有机联系起来形成E2F1/ CREBI/RRM2信号通路,并从转录调控角度分析该通路驱动的结直肠癌细胞生长增殖、迁移、侵袭、转移及耐药的相关性,除查新委托单位发表的文献有涉及外,在国内外所检其他文献中未见述及。3、浙江省医学会鉴定意见 该课题首先提出了E2F1/CREB1/RRM2通路活化可促进大肠癌细胞的生长、增殖、侵袭和转移等恶性生物学功能的新机制；还发现RRM2低表达大肠癌患者对FOLFOX化疗方案有效，可延长5年生存期。研究结果有创新性，对大肠癌临床治疗选择及预后判断有指导意义。为针对E2F1/CREB1/RR

10、M2信号通路为新靶点的肿瘤治疗及RRM2抑制剂联合一线化疗药物的疗效研究提供新思路。该成果在SCI期刊发表3篇论文，其中IF>5的有1篇，被引用 11次,他引8次。鉴定专家组一致认为，该课题有创新性，研究成果在相关领域处国内领先水平，部分达国际先进水平。同意通过鉴定。建议通过多种形式进一步推广成果。主要完成人情况排名姓名性别出生年月技术职称工作单位1陈翔男1962.09主任医师三门县人民医院2邵吉民男1962.10教授浙江大学医学院3方泽钧男1990.11技师三门县人民医院4章小敏女1961.10主任药师三门县人民医院5颜崇县男1982.02副主任医师三门县人民医院6裘兰兰女1975.0

11、2主管技师三门县人民医院主要完成单位情况1、三门县人民医院：完成了本项目中的细胞学和动物学实验及相关研究，论文的撰写，并积极联系医院推广本项目的研究成果。 2、浙江大学医学院：负责项目研究的前期工作基础，对本项目进行课题指导。专利目录无代表性论文专著目录(1)Zejun Fang, Aifen Lin, Jiaoe Chen, Xiaomin Zhang, Hong Liu, Hongzhang Li, Yanyan Hu, Xia Zhang, Jiangang Zhang, Lanlan Qiu, Lingming Mei, Jimin Shao*, Xiang Chen*,CREB1 d

12、irectly activates the transcription of ribonucleotide reductase small subunit M2 and promotes the aggressiveness of human colorectal cancer,Oncotarget,2016, 7(47),78055-7806（IF=5.008）(2)Zejun Fang, Chaoju Gong, Hong Liu, Xiaomin Zhang, Lingming Mei, Mintao Song, Lanlan Qiu, Shuchai Luo, Zhihua Zhu,

13、Ronghui Zhang, Hongqian Gu, Xiang Chen*, E2F1 promote the aggressiveness of human colorectal cancer by activating the ribonucleotide reductase small subunit M2, Biochemical and Biophysical Research Communications. 2015, 464: 407-415 (IF=2.297)(3)Chongxian Yan*, Zejun Fang, Hong Liu, Jianli Shao, Anh

14、ua Wang, Long Sun, Zhihua Zhu, Shuchai Luo, Xiang Chen，Response to FOLFOX chemotherapy in patients with colorectal cancer according to RRM2 expression，International Journal of Clinical and Experimental Medicine,2016,9(11), 21970-21978.（IF=1.075）完成人合作关系情况陈翔：主要负责该项目的整体策划，实验的设计，对于该项目RRM2在结直肠癌中的表达及作用机制研

15、究等工作做出了大量贡献，是两篇代表性论文的通讯作者（文章1、2）。邵吉民：主要负责项目研究的前期工作基础， RR酶三个亚基在结直肠癌中的表达以及临床意义，并负责后期RRM2在结直肠癌中作用机制研究的指导，是文章1的共同通讯作者。方泽钧：作为该项目的主要完成人，负责具体的细胞学和动物学实验，尤其是RRM2在结直肠癌中的表达水平检测及RRM2与E2F1和CREB1的相互作用关系和对结直肠癌恶性表达的影响，是两篇代表性论文的第一作者（文章1、2）。章小敏：主要负责分子生物学实验和数据统计。颜崇县：主要负责病例收集，数据统计，是文章3的第一/通讯作者。裘兰兰：主要负责免疫组化实验。成果推广情况（申报科技进