三级淋巴结构在结直肠癌中的作用研究进展(全文)

1、三级淋巴结构在结直肠癌中的作用研究进展（全文）摘要 肠道作为全身免疫细胞富集的重要器官，肠道免疫微环境改变在结直肠癌 的发生发展中发挥重要作用。深入了解结直肠癌进程中肠道免疫微环境的 变化是未来探索结直肠癌新型治疗策略的基础。三级淋巴结构（TLS）是近年发现的存在于结直肠癌周围的免疫细胞聚集结构，与次级淋巴器官（SLO）具有类似的表型和功能特征。越来越多的研究证据表明，三级淋 巴结构与疾病进程、病人预后及辅助治疗疗效均存在显著相关性。结直肠癌中的遗传突变导致肿瘤抗原的产生，抗原提呈细胞识别抗原并递 呈给适应性免疫细胞，从而介导抗肿瘤免疫应答 1 。传统观点认为， 二级淋巴结构（secondar

2、y lymphoid organs ，SLO）如肠系膜淋巴结、 派尔集合淋巴结是肠道免疫应答发生的主要场所 2。在上述二级淋巴 结构中，结合了抗原的树突状细胞（ DC ）从肿瘤内迁移至二级淋巴结构， 将抗原呈递给CD4+ T和CD8+ T细胞；B细胞在抗原结合到初级卵泡中 后也在淋巴结内活化，增殖并形成生发中心（ germinal center ， GC）， 随后淋巴细胞增殖并分化为效应T细胞和记忆性B细胞迁移至肿瘤，介导抗肿瘤免疫应答 3。三级淋巴结构（ tertiary lymphoid structures ， TLS）的发现则颠覆上述传统的抗肿瘤免疫应答，其是在非淋巴组织内形 成的异位

3、淋巴结构，与淋巴结具有相似的结构和功能，存在于肿瘤基质和 边缘，并在乳腺癌、高级别浆液性卵巢癌、非小细胞肺癌和结直肠癌呈高 表达状态 4-6 。 TLS 可为细胞和体液免疫提供重要的淋巴细胞功能环 境，促进和维持抗肿瘤免疫反应。 TLS 形成、组成、结构和功能可能受到 位置和特定炎症刺激的调节，因而在不同组织和疾病中表达不同的特性 7。本文就 TLS 在结直肠癌中的形成、结构及生物学意义做一综述。1 TLS 的定义与组成TLS 是指在慢性炎症部位产生的淋巴细胞聚集结构。在细胞组成成分上，其与SLO类似，均包括适应性淋巴细胞、浆细胞、GC、树突状细胞( dendritic cells ， DC

4、)、滤泡树突状细胞( follicular dendritic cells ， FDCs)、基质细胞、高内皮微静脉(high endothelialvenule , HEV)和淋巴管8-9 。根据细胞聚集区域，TLS可进一步划分为T细胞区、B 细胞区和 HEV。 T 细胞区具有 CD3+T 细胞和成熟的 DC( DC-Lamp+ ) 簇的特征； B 细胞区由活跃的 GC 组成 10；HEV 表达外周节点寻址蛋 白(PNAd )具有募集血液中淋巴细胞的功能。TLS与SLO最大的区别在于 TLS 缺乏完整的细胞周围包绕结构，这也由其独特的形成过程所致。2 TLS 形成过程TLS 的形成主要由淋巴细

5、胞或基质细胞在炎症环境中分泌的趋化因子调控，女口 CXC-趋化因子配体 13 (CXC chemokine ligand 13, CXCL13 )和白细胞介素 7( IL-7 )，可将淋巴组织诱导细胞( lymphoid tissue inducer , LTi)募集到炎症部位11-12 。LTi属于3型固有淋巴样细胞， 其形成和功能发挥均依赖 RoR Y的表达13 。LTi表面表达淋巴毒素-a1 (32配体(lymphotoxin- a (32 , LT a (32)，可与基质细胞表面表达的淋巴毒素B受体(lymphotoxin-(3 receptor , LT 3)结合，促进基质细胞分泌血

6、管内皮生长因子 C( vascular endothelial growth factor C， VEGFC )诱导 HEV 的发生以及黏附分子的分泌，如血管细胞黏附分子 1 (vascular cell adhesion molecule 1， VCAM1 )和细胞间黏附分子 1 ( intercellularadhesion molecule 1 , ICAM1 ) 14。趋化因子 CC-趋化因子配体 19( CC-chemokine ligand 19， CCL19 )和 CCL21 也可参与 LTi 募集以及淋巴细胞和DC归巢15 。除了上述TLS依赖的形成途径外，其他免 疫细胞也可以

7、通过LTBR信号依赖的途径从附近的 HEV募集淋巴细胞进入 T 细胞和 B 细胞区 16-17 。此外，由巨噬细胞和内皮细胞分泌的细胞 因子IL-36 丫可通过上调基质细胞及血管内皮细胞VCAM-1和ICAM-1的表达，并借趋化因子 IL-8、CCL2 和 CCL20 来提升 HEV 募集淋巴细胞的 能力，进一步促进 TLS 的形成和成熟 18-19 。与 SLO 类似， TLS 的成 熟主要以 FDCs 和成熟 B 细胞的增多为特征，细分为 3 个阶段：( 1 )早 期TLS ( E-TLS)，由致密的淋巴细胞聚集体组成，无FDCs。( 2)初级滤泡样 TLS ( primary folli

8、cle-like ，PFL-TLS)，有 FDCs，无 GC°( 3) 继发性滤泡样 TLS (secondary follicle-like ，SLF-TLS)，有活跃的 GC 20。克罗恩样淋巴反应( Crohn 's-like lymphoid reaction ， CLR) 是结直肠癌特异的异位淋巴反应，也被认为是特殊形式的 TLS。在CLR早期， CD4+T 细胞主要与成熟的抗原提呈 DC 聚集；随着 CLR 成熟，越来 越多的 B 细胞和 FDCs 被募集组成淋巴滤泡；当高度组织化时， CLR 最终 也能形成另一种形式的功能性 TLS，具有募集淋巴细胞功能，并促进

9、肿瘤特异性适应性免疫反应 21 。 Vayrynen 等 22 研究发现，组成 CLR 淋巴滤泡的最大细胞亚群是 CD20+ B 细胞，约占滤泡的 60% ，其次为 CD3+ T 细胞(38%)、 CD68+ 细胞(11.1% )、 FoxP3+T 细胞( 0.4%) 和 CD83+ 成熟 DC(0.36% )。此外，在 CLR 中还发现 CD21+ FDCs 网 格，在GC反应中对选择性记忆 B淋巴细胞具有重要功能 5-6 。在CLR 中，CD83+成熟DC最常见于T细胞区，而CD68+细胞散布在滤泡周围， CD68+ 细胞具有清除凋亡 B 细胞的作用 22-23 。3 TLS 在结直肠癌预

10、后预测中的价值作为抗肿瘤免疫反应的重要特征，TLS代表免疫反应的主要位点24-26 o 基于此，多项研究已经评估 TLS预测结直肠癌病人预后的价值，TLS与低局部区域复发率、低远处转移率和高生存率相关 20，27-28 o分析TLS 密度、成熟度和位置(肿瘤附近或与肿瘤的距离)对评估病人预后至关重 要 29 o3.1 TLS 的密度、 成熟度及其对病人预后的影响 TLS 的密度在控制 肿瘤发生发展方面具有重要作用，可作为结直肠肿瘤进程的参数之一，其 定义是滤泡数量与浸润前缘长度的比值30 。据报道，在结直肠癌中，TLS 密度与较好的生存率呈正相关， 与肿瘤分期呈负相关 22， 30 o TLS

11、 成熟度是评估病人预后价值的又一重要参数，TLS成熟度主要依据E-TLS、PFL-TLS 和 SFL-TLS 的比例， 其对结直肠癌复发的预测能力可能高于 TLS密度20 。有研究表明，存在SFL-TLS病人的复发风险明显低于没有任何GC-TLS者（9.5% vs. 28.5% ）: 20 。这说明伴有 GC反应的TLS代表着“功能性”的亚型，GC的发展预示着肿瘤特异性 B细胞和CD4+ T细 胞的启动。 该研究发现在 TLS 密度低的肿瘤中 TLS 成熟度越低， TLS 成熟 过程被阻止在 E-TLS 阶段，这导致 PFL 和 SFL-TLS 阶段所占比例显著下 降。3.2 TLS的位置及其

12、对病人预后的影响在同一类型肿瘤内，TLS可存在于不同位置，并且形态上也不尽相同。 Munoz-Erazo 等9发现在 黏膜、黏膜下层、肌间神经层和肠系膜均存在TLS，黏膜TLS倾向于扁平细长或泪滴状，而黏膜下和肠系膜TLS则显得大而圆。En gelhard等31 在 38% 的转移性黑色素瘤中发现 TLS 出现在 3 个位置：肿瘤周围基质 （瘤 外）、瘤周和瘤内，尽管部分瘤周 TLS也出现B细胞与T细胞聚集体，但 在总体上， 与瘤内相比， 瘤周和瘤外 TLS 更密集。 这些不同位置 TLS 的组 织水平可能由不同机制形成， 或许在功能上也存在差异 31 。 Sofopoulos 等32将乳腺肿

13、瘤周围 TLS 定义为距浸润边缘 5 mm 以内的区域，根 据正常乳腺组织与浸润性边缘之间的距离和间隔， 将 TLS 细分为相邻和远 端TLSo相邻TLS被认为是位于浸润边缘表面的TLS，远端TLS被认为是在其与肿瘤浸润边缘之间插入了正常乳腺组织的一类TLSo近端TLS高密度与无病生存期（DFS）降低有关而与总生存期（OS）无关，远端 TLS 密度则与病人DFS和OS均呈负相关。Posch等20 将结直肠肿瘤周 围 TLS 定义为距侵袭性边缘 7 mm 以内的部分， 覆盖的范围更大， 但并未 细分，也未评估预后价值。此外，虽然大多数研究均描述了肿瘤周围 TLS， 但很难确定具体位置。因此， T

14、LS 的位置对于预后的预测价值仍需进一步 验证。3.3 TLS 对转移性结直肠癌预后的影响在多种类型肿瘤的转移灶中可发现TLS，提示其可能参与了转移灶免疫微环境内的肿瘤免疫应答。 转移灶中 TLS 密度与良好的预后相关则初步证实了上述结论 33-34 。 虽然 TLS 在转移部位的形成机制尚不明确，但有证据表明，结直肠癌肝转 移灶中的肿瘤微环境可为 B 细胞的启动和成熟创造关键条件， 进而诱发具 有GC活性的TLS : 33。原发肿瘤的类型也会影响 TLS的形成，例如在 结直肠癌肺转移灶中，TLS密度显著高于肾癌肺转移灶，提示除了局部肿 瘤微环境外，原发肿瘤的类型包括肿瘤抗原的类型是决定TLS

15、产生的另一重要因素 35。那么结直肠癌原发灶内的TLS 是否具有判断转移灶内TLS 数量和密度以及预测总体预后的能力。目前，尚缺乏相关文献支持此 推测。发生转移的结直肠癌原发灶内TLS密度较未转移者有所降低，提示TLS 在总体上仍然以发挥抗肿瘤免疫应答为主，随着疾病进程甚至肿瘤转 移，其数量和功能会逐渐下降，因而未来探索如何增强 TLS 的应答或许能 为治疗结直肠癌提供帮助 34。3.4 TLS 预测辅助治疗效果及其在辅助治疗后的改变虽然是否能够通过评估 TLS 对肿瘤辅助治疗效果进行预测尚无定论， 但在转移 性结直肠癌中，TLS密度与化疗效果呈正相关，提示细胞毒性化疗药物除 了直接杀伤肿瘤外

16、还可能通过调控 TLS 来发挥抗肿瘤治疗效果 36-37 但具体的机制仍不明确。为何TLS无法判断不伴有转移的结直肠癌化疗效 果，可能与更复杂的肿瘤免疫微环境有关，尤其是大部分接受辅助化疗的 病人往往处于肿瘤进展期，而进展期病人组织内的TLS密度也相对较低，因此，进一步深入探索化疗及其他辅助治疗对 TLS 的作用或许能为理解如 何重塑免疫微环境而达到抗肿瘤免疫应答提供帮助。目前，对于肿瘤的辅助治疗手段有放疗、化疗、靶向治疗和免疫 治疗，无论何种治疗手段都会对 TME 中免疫因素产生影响 38。 Silina 等39 对肺癌的研究发现，新辅助化疗可使GC形成受损，但TLS的密度并不受影响，GC比

17、例的降低使TLS功能出现异常，从而消除 TLS密度 的预后价值。为了确定新辅助治疗对 TLS成熟的影响，该研究通过分析高 表达 TLS 病人，观察到新辅助化疗后病人 SFL-TLS 和 GC 的比例均显著降 低。 Kuwabara 等40发现， 在接受新辅助放化疗的胰腺癌病人中， TLS 总量减少， 但 CD8+T 细胞和 HEV 高于直接手术治疗的病人， 与良好的预 后有关。关于结直肠癌治疗对 TLS影响的证据较少，V?yryn等:22 发现术前接受新辅助治疗病人 TLS 密度明显降低。这些证据表明，新辅助 放化疗可能会影响TLS的形成和成熟，进而消除 TLS的预后价值。4 TLS 在肿瘤治

18、疗中的价值除了具有预后价值外，TLS还可以直接作为抗肿瘤免疫反应的推动器。研 究表明，肿瘤疫苗发挥抗肿瘤效果与 TLS 形成密切相关。对高级别宫颈上 皮内瘤变(CIN2-CIN3 )病人进行针对 HPV16和HPV18的E6和E7蛋白进行治疗性疫苗接种后，在残留上皮内病变的间质内观察到TLS形成，其中靶组织内CD8+ T细胞浸润强度显著增加(平均3倍)41 。同样， 对胰腺导管腺癌( PDAC )病人接种分泌粒 -巨噬细胞集落刺激因子( granulocyte-macrophage colony - stimulating factor， GM-CSF )的同种异体PDAC疫苗(GVAX)后也观察到TLS的形成，GVAX与环磷 酰胺联合应用后TLS数量增加42 o基于TLS的结构与上述功能特点，诱导TLS形成或许有利于抗肿 瘤免疫应答， 而以靶向 TLS 形成相关信号及主要免疫组分的策略正在积极 探索中。HEV允许淋巴细胞进入肿瘤增强抗肿瘤免疫反应43 o在小鼠模型中，诱导Treg