人源诺如病毒感染性评价新方法的建立

1、人源毒性评价新方法的建立人源毒性评价新方法的建立摘要毒（noro, NoVs）按照其编码衣壳蛋白 ORF2 序列的不同，可以将其分为 5个组（GI-GV）；其中 GI，GII，GIV 组可人类被称为人源毒（human noro,不能HuNoVs）。HuNoVs 是全世界范围内导致非细菌性肠胃炎的主要病原之一。由于该进行体外培养和增殖，严重阻碍了对其机制和免疫学等方面的研究。目前，HuNoVs 的检测方法主要依赖于反转录 PCR（RT-PCR）和实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）。但是，两种RNA，还是完整的方法均无法区分扩增模板是来自于游离颗粒。本研究在前期工作的基础上，利用唾液（含有 H

2、uNoVs 的受体）可与 HuNoVs 特异性结合的属性，初步建立了该性评价的新方法原位捕捉荧光定量 PCR（ISC-RT-qPCR）。本研究通过筛选 A，B，O 血型唾液样本的亲和性，并优化三者的最佳比例，完善了以唾液为包被受体的 ISC-RT-qPCR 检测方法。对其进行初步应用发现，ISC-RT-qPCR 方法可用于自然河水中HuNoVs 污染的检测。本研究为 HuNoVs 检测中包被受体的选择上提供了新思路，也为其实际应用开辟了新道路。毒，检测方法，ISC-RT-qPCR，HBGAs，唾液：人源人源毒性评价新方法的建立THE ESTABLISHMENT OF A NEW METHOD

3、TOEVALUATE THE INFECTION OF HUMAN NOROABSTRACTNoro(NOVs), according to its different sequence of open reading frame 2 that encodescapsid protein, can be divided into 5 genogroups. Among those noroII and genogroup IV can infect human which are called human noro, genogroup I, genogroup(HuNoVs). Humann

4、oroare one of the main pathogens causing acute non-bacterial gastroenteritis all over theworld. Immunological knowledge of HuNoVs such asinfection mechanism and hostspecificity, is seriously limited due to its inability to be cultured and proliferation in vitro. Current detection methods of HuNoVs m

5、ainly focused on RT-PCR (reverse-transcription PCR) and RT-qPCR (real-time quantitative reverse transcription-PCR). However, both of the two methods cannot make sure the amplification templates come from the free viral RNA or from complete particles, that is cannot distinguish between infectious and

6、 non-infectious particles. On thebasis of preliminary work, my research focused on using the feature of saliva (containing the receptors of HuNoVs) to capture HuNoVs, and initially establishing a new method to detectHuNoVs-ISC-RT-qPCR (in situ capture quantitative (real-time) reverse transcription-P

7、CR). Inthis study, I screen the strongest affisaliva samples of A, B, O blood type, andoptimize the best ratio of the three to improve the new ISC-RT-qPCR detecting method using saliva-coated receptor. Finally in a preliminary exploration of the application discovery, ISC-RT-qPCR detecting method ca

8、n be used to detect HuNoVs in surface water (artificial polluted by HuNoVs). This experiment not only further improves ISC-RT-qPCR method offering a new choice for coated receptor to detect HuNoVs, but also opens the way for its practical applicationexploration.Key words: human noro, detecting metho

9、d, ISC-RT-qPCR, HBGAs，saliva人源毒性评价新方法的建立目录第一章 绪论11.11.21.31.41.5毒简介1毒流行病学特征1毒性研究现状2毒检测方法现状3人源人源实验目的及意义4第二章 唾液样品的收集和处理52.1唾液52.1.1 唾液样本2.1.2 唾液样本对象5方法52.22.3处理唾液5本章小结5第三章 唾液包被的原位捕捉荧光定量 PCR（ISC-RT-qPCR）方法的建立与评估63.1 唾液包被 ISC-RT-qPCR 检测方法可行性验证63.1.13.1.23.1.3实验材料6实验方法6结果与分析83.2 ISC-RT-qPCR 新方法筛选最佳临床样本93

10、.2.1 GI 组3.2.2 GII 组的筛选9的筛选103.2.3 小结103.3 筛选亲和性最强的唾液样本103.3.13.3.23.3.3用 GI 组用 GII 组样本（3010）筛选唾液样本10样本（3009）筛选唾液样本11小结123.4 采用亲和性最强的唾液样本调节最适比133.4.1 优化 3010（GI）的唾液比133.4.2 优化 3009（GII）的唾液比143.4.3 小结143.5 本章小结14第四章 人工污染 HuNoVs 样本的检测164.1河水取样164.1.1 取样地点164.1.2 取样方法16检测运用164.24.2.14.2.24.2.3人工污染16检测1

11、6结果及分析164.3本章小结17人源毒性评价新方法的建立第五章 结论18参考文献20谢辞25人源毒性评价新方法的建立第一章 绪论最道：2015 年 5 月中旬，北京市朝阳区花家地实验小学的学生陆续出据京华现恶心、腹泻、呕吐等症状。经北京市朝阳区疾病预防中心确认，患病学生是受毒。近年来，国内外毒暴发案例屡见不鲜，常出现在中小学、游和控轮等密集且封闭或半封闭的地方。但是，对于毒的暴发目前仍无法进行。制。建立高效的毒检测体系是解决该问题的重要1.1毒简介, NoVs）最初从 1968 年在美国Ohio 州 Norwalk 市一所小学暴发的毒（noro冬季呕吐疾病研究中分离出来的1，曾被命名为（No

12、rwalk 毒属2，NV）。NoVs粒子直径 2738是一种单链正股 RNA，无包膜，属于嵌杯科nm3，组全长约 7.7 kb，由 3 个开放阅读区（open reading frames, ORF）组成。其中，ORF1 区编码非结构蛋白；ORF2 区编码主要衣壳蛋白 VP1；ORF3 编码次蛋白 VP2。4根据其编码衣壳蛋白 ORF2 序列的不同，可将其分为 5 个组（genogroups）5，即GI-GV。不同 NoVs 在和抗原性方面差别很大2 , 6-9。其中 GIII 是，GV 是；GI，GII，GIV（GII/11 是猪源）都能人10，被称为人源HuNoVs）。在衣壳蛋白编码序列多

13、样性的基础上， GI 组有 8 个毒（human noro,簇，GII 组有 17 个簇；GIV 组有 1 个簇4。Fankhauser 等研究显示11：GII 组是 HuNoVs 诱发案例的主要所导致的型，占 73%；GI 组 HuNoVs 占 26%，其余案例的病原属于 GIV 组。其中，GII.4发现12，GII.4 在过去的毒暴发案例的 70%80%。毒暴发和扩散案例最为常见。Kroneman 等的10 年里在美国、欧洲、大洋洲已经成为流行毒株，占所有所以，本实验以 GI 和 GII 组 HuNoVs 为主要研究对象。1.2 人源毒流行病学特征之一13。由于 HuNoVsHuNoVs

14、是造成非细菌性肠胃炎的主要剂量很低量约 18 个粒子）14，所以极易扩散（。易感人群于被 HuNoVs 污染的环境后，1524 h 会出现腹泻、呕吐、肌痛、恶心、发烧等临床症状，可一直持续到 2472 h15。各个阶段人群都可HuNoVs，常发生在人口的场合，如学校、养老院、医院、餐厅，甚至宴会等11。HuNoVs 主要通过粪口途径，以受污染的、媒介，或者通过人与人之间的接触传染13 , 16-19。流行病学研究发现，HuNoVs 的与季节有关，暴发最低20。高，但是该峰值出现在冬季，而夏季则虽然 HuNoVs性强、没有体外增值模式或细胞系，目前并没有成或者抗用于预防或治疗。El-Kamary

15、 等已经制得了 NV (GI.1)的疫苗21，虽已通过临床实验验证该行毒株。的性能22，但其并未投入商业生产且 GI.1 毒株为与细菌不同，是严格的胞内寄生，故污染的在、转运和储存过程中增殖。研究表明，HuNoVs 对于热、剂和 pH 的抗逆性较强，且稳定地于不同环境23；等利用 ISC-RT-qPCR 方法评估的 HuNoVs 灭活条件24为：16 ppm 浓度的氯处理 20s，72 oC 加热 4 min 或者 1 J/cm2 紫外线辐射；且具有较强的抗逆性。对耐受。由此可见，HuNoVs第 1 页 共 25 页人源毒性评价新方法的建立1.3 人源毒性研究现状由于 HuNoVs 不能体外繁

16、殖，缺乏组织培养系统和动物模型25，故人们对其发病机理及其生物学信息，如生存、和表达等了解甚少。目前很多、猪源、的也被证实与肠胃炎有关5 , 26 , 27。毒（murine noro, MNV）是唯一一种能毒28；由于其与 HuNoVs 的相似性，MNV在体行细胞培养和小动物体内增殖的毒29。这为我们了解被广泛视为最能替代 HuNoVs 的毒在组织培养内的，不能直接全方面揭示机制和宿主体内的发病机理提供了帮助。但是，MNV 毕竟是性30。HuNoVs 对人的除了寻找与 HuNoVs 相似的动物杯状进行类比研究，探求其致病机理，也有研究另辟蹊径，利用昆虫细胞表达 ORF2 时，VP1 可以自动

17、折叠成类颗粒（-like particles,VLPs）来研究受体31。VLPs 是模实组织和构象的多重蛋白结构，它不含有病难以区分33 , 34。它可以用于产生更安全、毒的组32，在形态学和免疫性上与真实便宜的。VLPs 提供了结合。例如，通过重组让我们有效地认识毒，研究和宿主的特异性类粒子（recombinant Norwalk-like particles，rNV VLPs)与培养的 Caco-2 细胞（人克隆结肠行结合，并进入细胞的研究35揭示了细胞，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞）进毒衣壳蛋白的 C 末端区可能与细胞特异性结合有关，rNV VLPs 与细胞的结合具有饱和性和特异性

18、，且其可能识别肠细胞上的某种受体。2000 年，Ruvon -Clouet N 等研究发现36，兔症（Rabbit Hemorrhagic Disease）作为一种杯状，能与兔上皮细胞上 H 型的两种组织血型寡糖结合。为了寻找HuNoVs 在细胞上的受体，Marionneau S 等将该结果类推到同属的 HuNoVs 上37，以 rNVVLPs 证实 NV 可与小肠上皮细胞和型唾液中的组织血型抗原（histo-blood group, HBGAs）结合，但不与泌型唾液结合，即 NV 与小肠上皮细胞的结合与型、泌型有关。HBGAs 主要包括 ABH（ABO）抗原和 Lewis 抗原，是带有多糖链

19、末端结构的碳水化合物，广泛于唾液、肠液等体液中和组织中38。这些抗原由 5 种均为二糖的前体物质在糖基转移酶的作用下，通过逐步加上单糖形成的。首先，H 抗原（即 O 抗原），再在糖基转移酶的作用下在 H 抗原上加入 A，B 表面抗原决定簇，形成 A，B 抗原。如果 FUT2 (fucosyltransferase 2)编码区有部分核苷酸位点发生自然突变，导致相关酶失活，则这些被称为“泌型”（non-secretor），反之则为“型”（secretor）。FUT3(fucosyltransferase 3) 参与 Lewis 抗原，如缺乏该酶活性则表现为 Lewis，反之则为阳性。39诸多研究发

20、现：HuNoV 的性可能与内的组织血型抗原有关，与的遗传因素有关。HBGAs 可能是 NV的受体40。在 1977 年 NV 临床实验中，Parrino等发现部分人群对该具有耐受的现象41。后来，Hutson 等以 rNV VLPs 证明了人对 NV的易感性与 ABO 组织血型有猜想42。他们首次证实宿主的遗传性与 NV 的风险有关，结果发现，O 型血的人群更容易NV，而 B 型血的人NV 的风险较低。基于前期研究，Huang 等将与受体相互作用的研究扩大到 8 种HuNoVs40，研究结果发现：除了型抗原表位外，A，B 和 Lewis 组织血型抗原都与 HuNoVs 的结合有关，由此推测不同

21、的 HuNoVs 可能识别肠上皮细胞中不同的 HBGAs，并将其作为的受体。志愿者NV 的研究43直接证明了在的易感性上，HBGAs 直接作为受体与之识别。之后，陆续毒与不同 HBGAs 受体结合机理研究44-47。毒的 VP1 主要有两个区域（domains）。主要组成二十面体外壳的区开展了对于多种研究发现，域被称为壳区（S domain），延伸到壳外形成锚的突出区域被称为突出区（P domain）33。Pdomain 直接与宿主接触并诱发免疫应答48，也能参与二聚体的交互作用，从而辅助增强衣壳蛋白的稳定性49。P domain 可水解成 P 多肽（P polypeptide），这可能是第

22、2 页 共 25 页毒在宿主人源毒性评价新方法的建立体内、免疫应答的重要一步50。不同组（genogroups）的毒 P domain 末端差异51。P2 区的多样性导致其与 HBGAs 结合的部位虽然 HuNoVs 可将 HBGAs 作为侵染细胞的受体，但是该仍无法体外培养。协助。52 尽HuNoVs的功能性辅助受体在细胞培养中已经不，可能是其中的一个管不同的 HuNoVs 在 HBGAs 识别中高度多样化，但在遗传密切相毒株（strains）之间，只有在 HuNoVs-HBGAs 结合界面上共享的 HBGAs 抗原少量不同的结构蛋白。例如，作为暴发案例最多的 GII.4 HuNoVs，能识

23、别所有 ABO 型中的型的唾液（约占总人口的80%），但 GII.3 组的代表毒株 MxV 仅识别唾液中的 A，B 抗原，对于 O结合力52。型只有轻微的1.4毒检测方法现状1972 年 Kapikian 先生利用免疫电镜（immunoelectron microscopy, IEM）在 4 年前一次肠胃炎的样品中发现 Norwalk3，至今，IEM 成为毒的检测方法之一。该方法一度成为态毒最经典的检测方法。但是，它对操作者的技术要求高、费时费力，需要从形粒子进行区分，检测灵敏度差且只能发病后 23 天检测到53，至少视觉上对10610754。检测抗原的酶联免疫反应（enzyme linked

24、 immunosorbent assays，ELISA)是基于重组病粒子/mL 粪便才能被检出。该方法很少用于检测食品和环境中的 HuNoVs 污染毒衣壳蛋白（recombinantcapsid）产生的免疫抗血清的应用，只能检测特定类型或者毒株群55。商业化的 ELISA 试剂盒不能区分有相同或相似的性粒子、空外壳蛋游离的 HuNoVs 抗原56。ELISA 灵敏度不高，检测限约为每个反应 105 个粒子，不太适合直接检测食品中和环境中的微生物污染54。随着生物学的快速发展，HuNoVs 的检测方法也逐渐发展起来。1995 年，RT-PCR (reverse transcription-pol

25、ymerase chain reaction)被用于检测 HuNoVs57后，该方法便被广泛用于临床检测58。后来在此基础上，建立了 RT-qPCR (real-time quantitative reversetranscription-PCR)方法并用于 HuNoVs 检测59。相比于传统 RT-PCR 中的电泳凝胶、，RT-qPCR 采用荧光标记特定探针，大大缩短了检测周期并提高了灵敏性和特异性，使定量检测环境和食品样本中的 HuNoVs 成为可能。其中，Taqman 探针的方法使用最广泛60。在 RT-PCR 和 RT-qPCR 中，都是基于核酸进行检测，只能扩增和检测小片段核酸序列，

26、这个核酸片段可能来自于具有性的核酸序列，也有可能于有缺陷性的、含有完整或部分组的粒子，或者含有部分降解的 RNA 的失活的粒子，或者游离的 HuNoVs RNA54。即无法区别性和非性的 HuNoVs 粒子。这种检测结果，无疑是夸大了 HuNoVs 的污染水平，从而误导部门风险的政策实施。为了检测到食品和环境中的 HuNoVs，通常都要对进行分离和富集，常用的方法有离心、过滤、萃取、沉淀、免疫磁珠连接分离、酶预处理，以及新型的连接配体（binding ligands）等54。例如，用磁珠-HBGAs 连接可用于样品中的捕捉61，及利用猪肠胃黏膜提取物（porcine gastric mucin

27、, PGM）代替 HBGAs 的相似捕捉方法62。虽然用抗体捕捉、富集在理论上是具有可行性的，但要寻找到广谱的，并能进行商业用途的抗体，还需要进一步摸索。近年，Tulane(TV)被用作 HuNoVs 的替代。与其它常见替代MNV、Feline等）相比，TV 是真正的肠道致病微生物，可识别的 HBGAs63。calici等以B 型血人的唾液（含 HBGAs）作为吸附相，结合 Taqman 探针 RT-qPCR 方法，建立了原位捕捉定量 PCR（in situ capture RT-qPCR，ISC-RT-qPCR）。以热、氯、UV 或处理对 TV进行部分或全部灭活， 利用 TCID50 （ t

28、he 50% tissue culture infectious dose ）方法对第 3 页 共 25 页人源毒性评价新方法的建立ISC-RT-qPCR 方法进行对比评估64，结果显示：两种方法均可对 TVISC-RT-qPCR 方法具有灵敏、简便、检测周期短等优势。以在此基础上，性进行评价，且等又以 PGM（含有 A, H1 和 Lewis b HBGAs）作为 HuNoVs 的受体，结合 RT-qPCR，建立了直接检测HuNoVs 的 ISC-RT-qPCR 方法24。他们以 ISC-RT-qPCR 方法对 HuNoVs 的灭活条件进行了评估。与传统的 RT-qPCR 相比，ISC-RT

29、-qPCR 在区分 HuNoVs 的性上又迈出了一大步；该方法无需提取检测周期。的核酸且可规模化操作，极大地节省了人力，降低了检测成本，缩短了PGM 虽然含有 A 型、H1 型（O 型）和 Lewis b 的 HBGAs，均与人的 HBGAs 相似，能与 GI 和 GII 组的 HuNoVs 结合65。但由于猪缺乏 B 型的 HBGAs，故该方法的 HuNoVs 检(SMV，GI.2)44对 B 型血人群易感，该方法则会出现漏测谱偏窄；如 Snow Mountain检。这对于型多变的 HuNoVs 检测便提出了。1.5 实验目的及意义液中。38的 HBGAs 广泛于唾液、肠液等本实验在已初步建

30、立ISC-RT-qPCR 的研究基础上，直接以不同血清型人群的唾液进行包被，以期建立唾液包被的ISC-RT-qPCR 新方法，并对新方法进行应用探索。相比于 PGM 包被，该方法以唾液包被可扩大 HuNoVs 检测谱。该方法不需要提取工成本。RNA，可以规模化程序化检测，大大降低人本研究建立并完善基于新型受体的 ISC-RT-qPCR 方法，为其在 HuNoVs 检测中包被受体的选择上提供了新思路，也为其在实际检测运用中作出了新的尝试。该方法提高HuNoVs 检测准确率，缩短检测周期，为防控该及其导致食品安全的暴发提供技术支撑。同时，也为其在实际应用中的探索开辟了道路。第 4 页 共 25 页

31、人源毒性评价新方法的建立第二章 唾液样品的收集和处理2.1唾液2.1.1 唾液样本对象唾液对象：中国国籍 2030 岁年轻人，身体健康、无长期和短期疾病。男女比例为1:1。A，B，O 血型为主要的分类依据。按照表 2-1 对志愿者进行信息统计。表 2-1 唾液志愿者信息登记表志愿者编号血型随机每种血型人的唾液样本各 6 份，共计 18 份。其中 A 型血人唾液为 16 号，B型血人唾液为 712 号，O 型血人唾液为 1318 号。2.1.2 唾液样本用蒸馏水漱口，方法，约 5 min 后准备收集唾液。唾液收集采用自然取样法66，主要步骤为：身体前倾，低头，舌抵住上颚，短时间后，唾液便于下唇自

32、然留下。用 50 mL 离心管收集流出的唾液 78 mL，并尽快进行后续处理。2.2 处理唾液参考文献64中的方法，将收集的唾液进行分装后，沸水浴 5 min，10000g （Eppendorf 5424，Eppendorf, Germany）离心 5 min。吸取上清液，分装小份后，-20 oC 下冷冻保存，备用。2.3 本章小结实验的唾液样本对象均为 2030 岁的中国籍身体健康的在校生。其中男女比例相当。共了 18 份唾液样本，A 型、B 型和 O 型血人唾液样本各 6 份。后立即对唾液进行煮沸处理，并置于-20 oC 下冷冻保存。第 5 页 共 25 页人源毒性评价新方法的建立第三章

33、唾液包被的原位捕捉荧光定量 PCR（ISC-RT-qPCR）方法的建立与评估3.1 唾液包被 ISC-RT-qPCR 检测方法可行性验证3.1.1 实验材料（1）试剂经纯化的猪肠胃黏膜提取物（porcine gastric mucin, PGM）（Sigma，St. Louis，MI；cat. no. M-1778）；牛血清蛋白（Albumin from bovine serum, BSA）（上海翊圣生物，cat.no.36101ES25）；0.05 mol/L 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液（pH=9.6）；磷酸缓冲溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS），pH=7.2；

34、含 1% BSA 的磷酸缓冲溶液：将 1.0 g BSA 溶于 100 mL 的磷酸缓冲溶液（pH=7.2）；临床样本（GI 组和 GII 组）：由北京市疾病预防中心高志勇博士提供。（2）实验器材One Step Prime Script TM RT-qPCR kit（TaKaRa，code no. RR064A）；酶标条（Nunc Immuno Module）(VWR，Brisbane，CA)；聚烯烃膜（polyplefin sealing tape）（VWR，West Chester，PA，USA）；37 oC 恒温培养箱（HPP260，Memmert，Germany）；微型离心机（Min

35、i-6K，珠海医学仪器）；荧光定量 PCR 仪器（Eppendorf Mastercycler epgradientS，Eppendorf，Germany）。3.1.2 实验方法参考文献中的方法进行 PGM 包被，作为阳性对照；24 唾液包被作为实验组；且在阳性对照组和实验组中设置（1）HBGAs 包被酶标板对照组，即不加入临床样本。各组之间实验条件均相同。将PGM 用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液稀释为 1.0 mg/mL，于酶标条中每孔中加入 100 L，作为阳性对照组。暂取 1 号（A 型），7 号（B 型），13 号（O 型）唾液样本按照 A:B:O=1:1:1 比例，用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲

36、溶液稀释 1000 倍，并在酶标条中每孔加入 100 L，为实验组。加入含 HBGAs 包被液的酶标板置于 4 oC 下包被过夜。（2）封闭酶标板取出酶标板，将包被液倒尽，每孔加入 120 L 含 1% BSA 的 PBS，置于 37 oC 恒温培养箱中，封闭 1 h。（3）加入临床样本取出酶标板，用 180 L PBS（pH=7.2）对酶标板三遍，倒尽液体。随机选取1000x。除的一个临床样本 3010（GI），用 PBS 进行梯度稀释：10x，100x，对照组外，每加入 100 L 稀释的样本；对照组（NC）加入 100L PBS。酶标板加样顺序如下图 3-1 所示：第 6 页 共 25页

37、人源毒性评价新方法的建立NC：negative control/对照；Saliva：唾液组图 3-1 验证唾液包被 ISC-RT-qPCR 检测方法可行性酶标板加样示意图加样完毕后，将酶标条放入 37 oC 恒温培养箱中孵育 30 min。（4）使具有RNA三遍，尽可能倒尽液体。毒粒子高温裂解，取出酶标板，用 180 L PBS（pH=7.2）对每于每孔中加入 8.5 L DEPC 处理的 dH2O，并用聚烯烃膜封盖。先于 95 oC 孵育 5 min， 4 oC 下冷却。酶标条短暂离心，至管壁上无水珠附着即可。（5）RT-qPCR 反应液配制RT-qPCR 反应采用试剂盒说明书推荐的 25.

38、0 L 反应体系。反应体系如表 3-1 所示。表 3-1 RT-qPCR 反应体系试剂使用量2x One Step RT-PCR Buffer III TaKaRa Ex Taq HS (5 U/L) PrimeScript RT Enzyme Mix II PCR Forward Primer (10 M) PCR Reverse Primer (10 M) TaqMan Probe (10 M)Total12.5 L0.5 L0.5 L0.5 L0.5 L 1 L*216.5 L整个反应液配制需在冰上进行，且应在无核酸区进行操作，谨防体系污染。GI，GII 组毒检测所采用的上下游引物及探针

39、序列，参考 Tsutomu Kageyama 的序列59，如表 3-2 所示。表 3-2 人源毒 GI，GII 组引物及 TaqMan 探针序列组引物或探针序列 (53)GICOG1F COG1R RING1(a)-TPRING1(b)-TPCGYTGGATGCGNTTYCATGA CTTAGACGCCATCATCATTYACFAM-AGATYGCGATCYCCTGTCCA-TAMRAFAM-AGATCGCGGTCTCCTGTCCA-TAMRAPrimerProbeGIICOG2FCOG2R RING2-TPCARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG TCGACGCCATCTTCAT

40、TCACAFAM-TGGGAGGGCGATCGCAATCT-TAMRAPrimerProbe将酶标条贴膜揭下，加入配置好的 RT-qPCR 试剂各 16.5 L，并混合均匀。再用膜重新封盖，短暂离心，至管壁上无水珠附着，并消除酶标孔中气泡。（6）RT-qPCR 检测第 7 页 共 25 页人源毒性评价新方法的建立将酶标条放入荧光定量 PCR 仪中，根据荧光基团的激发光波长，选用 FAM 通道，反应条件如表 3-3 所示。表 3-3 RT-qPCR 反应条件反应步骤反应温度反应时间42 oC95 oC94 oC53 oC60 oCStage1反转录反应10 min30 sStage2PCR 反应

41、15 s15 s30 s40 cycles3.1.3 结果与分析（1）RT-qPCR 结果分析RT-qPCR 结果如图 3-2a 和图 3-2b 所示：1000950900850800750700650600550500450400350300250200150100500-50-10010x100x1000xNC0123456 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40Cycle图 3-2a PGM 包被的 ISC-RT-qPCR 实验结果

42、图1000950900850800750700650600550500450400350300250200150100500-50-10010x100x1000xNC0 1234567 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40Cycle图 3-2b 唾液包被的 ISC-RT-qPCR 实验结果图图 3-2a 显示：PGM 所包被的 RT-qPCR 结果中，对 3010（GI）检验呈阳性。与已有报第 8 页 共 25 页人源毒性评价新方法的建立道

43、的实验事实相符，证明该实验条件下可运用 ISC-RT-qPCR 方法检测 HuNoVs。图 3-2b 显示：唾液包被的 ISC-RT-qPCR 方法与 PGM 结果一致，也呈阳性。证明唾液包被的 ISC-RT-qPCR 方法对检测 HuNoVs 具有可行性。且临床100x，1000x 梯度稀释均有阳性结果。（2）ISC-RT-qPCR 方法分析样本 3010（GI）进行 10x，本实验在 HBGAs 与粒子特异性结合基础上，经实验过程中 PBS 的不断洗脱，使不样本中游离的核酸（在 PCR 中容易造成假阳性结果）和具有性的粒子及样本中部分干扰物质均被洗脱出去，从而减少对后续 RT-qPCR 过

44、程的干扰，使结果更贴近的真实性。高温可使与 HBGAs 结合的便可进行特异性扩增反应。粒子衣壳蛋白破裂核酸；再加入 RT-qPCR 试剂后，本方法中，HBGAs 与并不是百分合，可能未结合或结合力很弱，在实验中被洗脱掉，从而对的定量检测造成了影响，导致测定的量偏低。但在本检测实验中，对于所有的检测样本而言，这属于系统误差，不影响样品间检测效果的比对。但如果要全面评估此方法，核算其检测效率及该方法检测到的量与样本中的真实含量的差一。异，需将此方法与传统通用检测方法作评估时，这就变成必须考虑的因3.2 ISC-RT-qPCR 新方法筛选最佳临床样本采用来自北京市疾病预防中心的毒暴发案例中患者的腹泻

45、样本作为实验的临床样本。其中 GI 组临床样本有 3010 和 1036 两个编号样本；GII 组临床样本较多，有 1021，1029，2021，3009，3014，3035，3143，3148 共 8 个编号样本。已有病毒样本，采用初步建立的唾液包被的 ISC-RT-qPCR 方法进行筛选，筛选出相对检测效果最好的 GI 和 GII 组样本。3.2.1 GI 组（1）实验方法的筛选选用 1 号（A 型），7 号（B 型），13 号（O 型）志愿者唾液按照 A:B:O=1:1:1 进行 1000倍稀释，对酶标板进行包被，4 oC 下放置过夜。PBS后，用含 1% BSA 的 PBS 封闭 1

46、h，再加入 20 倍稀释的 GI 组1036 和 3010。对照组不加入，只加入等量的 PBS即可。每组平行三次。37 oC 孵育 30 min，PBS 洗涤三次后，加入 8.5 L 不含RNA 酶的 dH2O，高温裂解核酸。最后加入 RT-qPCR 反应体系，进行荧光定量 PCR 操作，根据荧光基团的激发光波长，检测 FAM 通道下的荧光量。（2）结果与分析通过 RT-qPCR 实验结果中的 Ct 值的比较，来判定 1036 和 3010 检测效果。表 3-3 ISC-RT-qPCR 新方法筛选临床性*样1036（GI）3010（GI）102110292021样本编号Ct 值36.981.5

47、728.930.28-33.990.1230.760.23样本编号30093014303531433148Ct 值22.120.0928.020.8229.681.0029.510.1136.510.51*：所有样本均采用三平行，计算得出平均 Ct 值。表中未标注样本均属于 GII 组。通过表 3-3 的结果可知，3010 的 Ct 值远远小于 1036。Ct 值越小，说明与唾液结合的病毒粒子越多，即临床故由此推断，临床样本中的含量越高。样本 3010 的滴度较高，检测效果较好。因此选择 3010 作为GI 组代表，作为后续研究基础。第 9 页 共 25 页人源毒性评价新方法的建立3.2.2

48、GII 组（1）实验方法的筛选选用 1 号（A 型），7 号（B 型），13 号（O 型）志愿者唾液按照 A:B:O=1:1:1 进行 1000倍稀释，对酶标板进行包被，4 oC 下放置过夜。PBS后，用含 1% BSA 的 PBS 封闭 1 h，再加入已有 8 个 GII 组临床样本的 100 倍稀释液。对照组不加入，只加入等量 PBS 即可。每组平行三次。37 oC 孵育 30 min 之后，PBS 洗涤三次后，再加入 8.5 L含 DEPC 的 dH2O，高温裂解出核酸释。最后加入 RT-qPCR 反应体系，进行荧光定量PCR 操作，根据荧光基团的激发光波长，检测 HEX 通道下的荧光量

49、。（2）结果与分析GII 组 8 个临床样本的 RT-qPCR 检测结果如表 3-3 所示。通过 Ct 值的比较可以得出：3009 的 Ct 值最小，即该样本中滴度最高，检测效果最好，故选用 3009 作为后续研究中 GII 组的代表。8 个 GII 组临床样本中，虽然 1021 号并未检测出阳性结果，但并不能断定其不是GII 组号的样本过程中，反复冻融导致 1021，决定在后续实验中将临床。造成无阳性结果的，有可能是在保存粒子失去了活性，从而无法检出。基于此样本进行小管分装后，取一小管储存于 4 oC 冰箱待用，避免反复冻融。3.2.3 小结根据 HuNoVs 的流行病学特征：大部分临床病例

50、由 GII 组并且 GII 组中的 GII.4 逐渐成为主导的 HuNoVs67-70。同样，余 GI 组。，GI 组率相对较低，的 GII 组临床样本也多通过已建立的 ISC-RT-qPCR 方法，采用 A:B:O=1:1:1 进行包被，分别对已有的GI 组和 GII 组临床样本进行筛选，通过对最后 RT-qPCR 中 Ct 值的比较，找出 Ct 值最低，即滴度最高，检测效果最好的代表续研究。样本 3010（GI）和 3009（GII），以进行后3.3 筛选亲和性最强的唾液样本3010（GI），3009（GII）来反筛收集的 A，B，O 型运用已经筛出的临床样人的唾液样本，找出每种血型中亲和

51、性最强的唾液样本。要筛选唾液样本的亲和性，首先应该进行预实验，寻找合适的稀释度。3.3.1 用 GI 组样本（3010）筛选唾液样本（1）优化 3010（GI）稀释度为寻找 3010 合适的稀释度，需预实验确定 3010 各稀释度下，Ct 值的大致范围。采用唾液样本 1 号（A 型），7 号（B 型），13 号（O 型），按照 A:B:O=1：1：1 进行 1000倍稀释，于 4 oC 下包被过夜样本 3010 进行 5 个梯度稀释：100x，1000x，10Kx，100Kx，1Mx。同时以添加等量 PBS 溶液组为对照组。每个梯度下平行三次。RT-qPCR 实验结果中 Ct 值，求得平均值，如表 3-4 所示。表 3-4 3010（GI）和 3009（GII）各稀释度下的检测效果*3010 稀释度100x1Kx10Kx100Kx1MxCt 值33.510.7035.960.8239.000.7041.820.06-3009 稀释度50x500x5Kx50KxCt 值24.410.2729.180.48-*：所有样本均采用三平行，计算得出平均 Ct 值。基于表 3-4 中结果及实验对于稀释度的要求（既要有阳性结果，又能表现出亲和性差异），以及对实验操作误差等多方面因素考虑，决定采用 3Kx5Kx 的稀释度，进行唾液样第 10 页 共 25 页人源毒性评价新方法的