基因表达调控及重组DNA技术

1、1 基因表达调控及重组基因表达调控及重组DNADNA技术技术2主要内容主要内容 基因及基因表达调控相关概念基因及基因表达调控相关概念 原核基因表达调控基本原理原核基因表达调控基本原理 真核基因表达调控基本原理真核基因表达调控基本原理 重组重组DNA技术相关概念技术相关概念 重组重组DNADNA技术技术基本原理基本原理3 负载特定遗传信息的负载特定遗传信息的DNA片段，包括：片段，包括：DNA编码序列、非编码调节序列和内含子序列。编码序列、非编码调节序列和内含子序列。 基因基因 （Gene）4基因组基因组（Genome） 来自一个遗传体系的一整套遗传信息来自一个遗传体系的一整套遗传信息原核：单个

2、环状染色体所含的全部基因原核：单个环状染色体所含的全部基因真核：一个生物体的染色体所包含的全部真核：一个生物体的染色体所包含的全部 DNA，又称染色体基因组，又称染色体基因组线粒体基因组线粒体基因组叶绿体基因组叶绿体基因组5Human Genome6人类基因组计划人类基因组计划（Human Genome Project, HGP） 1985年美国提出年美国提出 计划投入计划投入30亿美元，亿美元，15年完成年完成 1990年正式启动年正式启动 英、法、德、日、中国等先后加入英、法、德、日、中国等先后加入中国的任务：中国的任务： 人类人类3号染色体短臂上一个约号染色体短臂上一个约30Mb区域的测

3、序，区域的测序， 该区域约占人类整个基因组的该区域约占人类整个基因组的1。7年年10月月 启动启动2000年年 6月月 完成草图完成草图2001年年 2月月 nature公布草图公布草图 2004年年 10月月 nature公布精度公布精度 99%的测序图的测序图 人类基因数：人类基因数：2 - 2.5万万HGP的进展的进展The post-genome era is coming8谱主为生物学大师谱主为生物学大师耗资耗资200万完成万完成 盼未来降价普及盼未来降价普及 助提早预防疾病助提早预防疾病“ 生命天书生命天书” 首份个人基因图公布首份个人基因图公布 (2007.5.30) James

4、 Waston9 基因表达调控基因表达调控是指细胞生物接受环境信号刺激或适应环境营养供给是指细胞生物接受环境信号刺激或适应环境营养供给状况的变化，在基因表达水平上作出应答反应的分子状况的变化，在基因表达水平上作出应答反应的分子机制。机制。重组重组DNA技术技术本质上是一项生物技术，目的在于通过人工重组本质上是一项生物技术，目的在于通过人工重组DNA的的方法，获得某一目的基因的无性繁殖系方法，获得某一目的基因的无性繁殖系DNA克隆，或克隆，或使目的基因在一定的表达体系表达有特殊意义的蛋白质。使目的基因在一定的表达体系表达有特殊意义的蛋白质。主要研究内容：基因表达方式、规律、调节机理主要研究内容：

5、基因表达方式、规律、调节机理10第一节第一节 基因表达调控基因表达调控11一、基因表达的概念一、基因表达的概念* 在各种调节机制控制下，从基因激活开始，在各种调节机制控制下，从基因激活开始，经历转录、翻译等过程产生具有生物学功能的经历转录、翻译等过程产生具有生物学功能的蛋白质分子，从而赋予细胞一定的功能或表型，蛋白质分子，从而赋予细胞一定的功能或表型，或使生物体获得一定的遗传性状。或使生物体获得一定的遗传性状。12 DNA RNA蛋白质蛋白质转录转录翻译翻译逆转录逆转录简单定义：转录简单定义：转录 翻译翻译广义：包括广义：包括 rRNA、tRNA的表达的表达13二、基因表达调控的意义二、基因表

6、达调控的意义 生物体基因数量很多，但在某一特定时期只有一小部分生物体基因数量很多，但在某一特定时期只有一小部分基因处于活化状态，能进行转录（例如，真核细胞约基因处于活化状态，能进行转录（例如，真核细胞约2 25 5基因具转录活性）。因此，机体内存在着复杂的调节机基因具转录活性）。因此，机体内存在着复杂的调节机制，调节基因的表达。制，调节基因的表达。通过调控基因的表达，使生物体适应环境、通过调控基因的表达，使生物体适应环境、调节代谢、维持其生长与繁殖。调节代谢、维持其生长与繁殖。基因表达调控的意义：基因表达调控的意义：14三、基因表达的规律三、基因表达的规律* 阶段特异性阶段特异性 （时间特异性

7、）（时间特异性） 组织特异性组织特异性 （空间特异性）（空间特异性）15 阶段特异性阶段特异性 （时间特异性）（时间特异性）甲胎蛋白甲胎蛋白 某一特定基因的表达严格按一定的时间顺序发某一特定基因的表达严格按一定的时间顺序发 生，称生，称时间特异性时间特异性* 多细胞生物的不同基因在不同发育阶段按特定多细胞生物的不同基因在不同发育阶段按特定 时间顺序开启和关闭，称时间顺序开启和关闭，称阶段特异性阶段特异性*哺乳类哺乳类nAChR： 胚胎型胚胎型2(烟碱型乙酰胆碱受体烟碱型乙酰胆碱受体) 成年型成年型216 组织特异性组织特异性 （空间特异性）（空间特异性）在个体生长的某一阶段，在个体生长的某一阶

8、段， 不同细胞有不同不同细胞有不同基因表达基因表达胰岛素：胰岛胰岛素：胰岛 细胞细胞血红蛋白：红细胞血红蛋白：红细胞鸟氨酸循环酶类：肝细胞鸟氨酸循环酶类：肝细胞X YX Y AB17四、基因表达的方式四、基因表达的方式 有些基因的产物对于生物体的整个生命过程都是必不可有些基因的产物对于生物体的整个生命过程都是必不可少的，这类基因在生物体的几乎所有细胞中持续表达，少的，这类基因在生物体的几乎所有细胞中持续表达，这类基因被称为这类基因被称为管家基因。管家基因。这类基因的表达称为这类基因的表达称为基本的基本的基因表达基因表达* 。例如：葡萄糖酵解途径中各种酶的编码基因例如：葡萄糖酵解途径中各种酶的编

9、码基因基本的基因表达也是在一定机制控制下进行基本的基因表达也是在一定机制控制下进行（一）基本的基因表达（一）基本的基因表达18（二）可调节的基因表达（二）可调节的基因表达 与管家基因不同，另一些基因表达状况极易受外与管家基因不同，另一些基因表达状况极易受外环境变化的影响，随外环境变化，这类基因表达水平环境变化的影响，随外环境变化，这类基因表达水平可升高或降低可升高或降低,又称又称适应性表达适应性表达；又称；又称奢侈基因奢侈基因。 特点：不是细胞生命必不可少的特点：不是细胞生命必不可少的 表达受外环境的影响较大，不恒定表达表达受外环境的影响较大，不恒定表达 有间断性和空间特异性有间断性和空间特异

10、性 19 诱导诱导 基因表达水平在特定环境中增高的现象基因表达水平在特定环境中增高的现象 这类基因叫这类基因叫可诱导基因可诱导基因阻遏阻遏基因对环境信号应答表现为表达水平降低基因对环境信号应答表现为表达水平降低这类基因叫这类基因叫可阻遏基因可阻遏基因 DNA损伤：损伤：DNA损伤修复酶被诱导损伤修复酶被诱导 色氨酸供应充足：参与合成色氨酸的酶被阻遏色氨酸供应充足：参与合成色氨酸的酶被阻遏20五五.基因表达的多级调控基因表达的多级调控基因表达调控在多级水平上进行基因表达调控在多级水平上进行基因激活基因激活 转录起始转录起始* 转录后加工及转运转录后加工及转运 mRNA降解降解 翻译及翻译后加工翻

11、译及翻译后加工 蛋白质降解蛋白质降解21六、基因表达调控原理六、基因表达调控原理以以mRNA转录为例转录为例DNA元件元件 调节蛋白调节蛋白RNA聚合酶活性聚合酶活性*调控要素调控要素（一）转录起始调节基因表达（一）转录起始调节基因表达22 （1） DNA元件：元件：具有调节功能的特异具有调节功能的特异DNA序列序列操纵子：操纵子：由功能上相关的一组酶或蛋白质基因在染由功能上相关的一组酶或蛋白质基因在染色体上串联一起并共同享用同一表达调控的色体上串联一起并共同享用同一表达调控的DNA组组件所构成的一个转录单位。件所构成的一个转录单位。操纵子操纵子调节序列调节序列编码序列：编码蛋白质编码序列：编

12、码蛋白质启动序列：结合启动序列：结合RNA聚合酶聚合酶操纵序列：结合阻遏蛋白操纵序列：结合阻遏蛋白*1、原核生物、原核生物23 操纵子操纵子结构结构编码序列编码序列 启动序列启动序列 操纵序列操纵序列其他调节序列其他调节序列(promoter)(operator)PO(coding sequence)24 原核生物启动序列（启动子）原核生物启动序列（启动子）RNA转录起始转录起始-35区区-10区区TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrp tRNAT

13、yrlacrecAAra BAD TTGACA TATAAT一致序列一致序列25 （2）调节蛋白调节蛋白特异因子特异因子 决定决定RNA聚合酶特异识别并结合聚合酶特异识别并结合 启动序列的能力启动序列的能力（因子）因子）阻遏蛋白阻遏蛋白 与操纵序列结合，抑制与操纵序列结合，抑制RNA聚合酶活性聚合酶活性 （负性调节）（负性调节）激活蛋白激活蛋白 促进促进RNA聚合酶活性聚合酶活性（正性调节）（正性调节）26 （3） RNA聚合酶活性聚合酶活性 DNA元件元件与与调节蛋白调节蛋白对转录激活的对转录激活的调节作用最终由调节作用最终由RNA聚合酶活性聚合酶活性体现。体现。 启动序列或启动子的结构、调

14、节蛋白启动序列或启动子的结构、调节蛋白的性质对的性质对RNA聚合酶活性影响最大。聚合酶活性影响最大。 272. 真核生物真核生物（1） 顺式作用元件：顺式作用元件：（2） 反式作用因子：反式作用因子： （3） mRNA转录激活及其调节转录激活及其调节28第二节第二节 原核基因表达调控与原核基因表达调控与真核基因表达调控的基本原理真核基因表达调控的基本原理29一、原核基因表达及其调控的特点一、原核基因表达及其调控的特点 1、转录与翻译两过程紧密偶联、转录与翻译两过程紧密偶联 3、操纵子调节机制中普遍存在阻遏蛋白介导、操纵子调节机制中普遍存在阻遏蛋白介导 的负性调节的负性调节*2、普遍存在操纵子调

15、节机制、普遍存在操纵子调节机制阻遏蛋白阻遏蛋白操纵序列操纵序列结合结合阻遏阻遏解聚解聚结合结合去阻遏去阻遏 阻碍阻碍30 4、转录产物为多顺反子、转录产物为多顺反子mRNA 5、转录起始转录起始是基因表达调控的最关键环节是基因表达调控的最关键环节*多顺反子多顺反子mRNA：多个功能相关的基因串联，多个功能相关的基因串联， 转录产物在转录产物在 一条一条mRNA上，翻译产物为多个多肽链上，翻译产物为多个多肽链31二、操纵子理论二、操纵子理论通常一个操纵子含有通常一个操纵子含有一个启动序列及数个编码基一个启动序列及数个编码基因因（26个，甚至更多），还有其它调节序列。个，甚至更多），还有其它调节序

16、列。 编码序列编码序列 启动序列启动序列 操纵序列操纵序列其他调节序列其他调节序列(promoter)(operator)PO(coding sequence)操纵子操纵子结构结构32乳糖操纵子乳糖操纵子调节机制调节机制 阻遏蛋白的负性调节阻遏蛋白的负性调节 CAP的正性调节的正性调节 协调调节协调调节33 乳糖操纵子结构乳糖操纵子结构 CAP结合位点结合位点P IIPOZYA调控区调控区结构基因结构基因I: 阻遏蛋白编码基因阻遏蛋白编码基因PI: 阻遏蛋白基因启动序列阻遏蛋白基因启动序列Z: -半乳糖苷酶半乳糖苷酶Y: 透酶透酶A: 乙酰基转移酶乙酰基转移酶结构基因结构基因O:操纵序列操纵序

17、列（阻遏蛋白结合部位）（阻遏蛋白结合部位）P:启动序列启动序列CAP结合位点结合位点调控区调控区34 1. 阻遏蛋白的负性调节阻遏蛋白的负性调节（无乳糖）（无乳糖） *阻遏蛋白与阻遏蛋白与O序列结合序列结合, 抑制转录抑制转录, lac操纵子关闭操纵子关闭阻遏蛋白阻遏蛋白mRNACAP结合位点结合位点P IIPOZYARNA聚合酶聚合酶 35 诱导剂结合于阻遏蛋白，阻遏蛋白与诱导剂结合于阻遏蛋白，阻遏蛋白与O序列序列解离，转录抑制解除，解离，转录抑制解除，lac操纵子开启操纵子开启乳糖乳糖别乳糖别乳糖CAP结合位点结合位点P IIPOZYAmRNA 阻遏蛋白的负性调节阻遏蛋白的负性调节（有乳糖

18、）（有乳糖） * 36 CAP: 分解代谢基因激活蛋白分解代谢基因激活蛋白 catabolite gene activator protein同二聚体同二聚体cAMP 结合区结合区 DNA 结合区结合区37 2. CAP的正性调节的正性调节（无葡萄糖）（无葡萄糖） *cAMPCAP蛋白蛋白P IIPOZYACAP结合位点结合位点mRNA无葡萄糖，无葡萄糖，cAMP浓度高浓度高cAMP与与CAP结合结合 与与CAP结合位点结合结合位点结合转录活性提高约转录活性提高约50倍倍 38 CAP的正性调节的正性调节（有葡萄糖）（有葡萄糖） *cAMPCAP蛋白蛋白P IIPOZYACAP结合位点结合位点

19、mRNA有葡萄糖，有葡萄糖，cAMP浓度低浓度低cAMP与与CAP结合受阻结合受阻转录活性下降转录活性下降 39 阻遏蛋白阻遏蛋白mRNACAP结合位点结合位点P IIPOZYARNA聚合酶聚合酶 3. 阻遏蛋白与阻遏蛋白与CAP的协调调节的协调调节*（1）无乳糖时）无乳糖时, 阻遏蛋白封闭转录，阻遏蛋白封闭转录， CAP无作用无作用40 （2） 有乳糖时有乳糖时, 乳糖操纵子去阻遏乳糖操纵子去阻遏, 虽可转虽可转 录录, 但活性很低但活性很低, 必须由必须由CAP的正性调节来加强的正性调节来加强P IIPOZYACAP结合位点结合位点mRNA 41 乳糖操纵子乳糖操纵子强强的转录活性的转录活

20、性既需要乳糖存在既需要乳糖存在又需要缺乏葡萄糖又需要缺乏葡萄糖42（一）真核基因结构特点（一）真核基因结构特点 1. 转录产物为单顺反子转录产物为单顺反子 一个基因一个基因 一条一条mRNA 一条多肽链一条多肽链2. 重复序列重复序列 高度重复序列、中度重复序列、单拷贝序列高度重复序列、中度重复序列、单拷贝序列3. 基因不连续性基因不连续性 非编码序列非编码序列 内含子内含子12353三、真核基因表达调控三、真核基因表达调控43 （二）（二） 真核基因转录特点真核基因转录特点活性染色体结构变化活性染色体结构变化 对核酸酶敏感、甲基化程度降低、对核酸酶敏感、甲基化程度降低、 组蛋白乙酰化修组蛋白

21、乙酰化修饰饰2. 正性调节占主导正性调节占主导 真核真核RNA聚合酶对启动子的亲和力极小或根本没有聚合酶对启动子的亲和力极小或根本没有 实质的亲和力，转录起始需依赖多种激活蛋白的作用实质的亲和力，转录起始需依赖多种激活蛋白的作用3转录与翻译分隔进行转录与翻译分隔进行 转录在核内进行，翻译在胞浆进行转录在核内进行，翻译在胞浆进行44 转录（起始）调节实质上是调节蛋白与转录（起始）调节实质上是调节蛋白与DNA的相互作用的相互作用 1、顺式作用元件：顺式作用元件：2、反式作用因子：反式作用因子： 3、mRNA转录激活及其调节转录激活及其调节（三）真核基因转录激活调节（三）真核基因转录激活调节45 1

22、. 顺式作用元件顺式作用元件* 指结构基因两侧或内部具有调节功能的指结构基因两侧或内部具有调节功能的DNA序列，因其作用于自身分子并发挥作用，序列，因其作用于自身分子并发挥作用，所以称所以称顺式作用元件。顺式作用元件。 根据位置、性质及作用方式的不同分为根据位置、性质及作用方式的不同分为启动子、增强子和抑制子。启动子、增强子和抑制子。46 真核生物真核生物 顺式作用元件顺式作用元件结构基因序列结构基因序列 启动子启动子(promoter)P 抑制子抑制子(silencer) 增强子增强子(enhancer) 增强子增强子(enhancer)47RNA聚合酶聚合酶II启动位点周围一启动位点周围一

23、 组转录控制组件组转录控制组件常见组件：常见组件： TATA盒盒（TATAAA） -25bp -30bp GC盒盒 （GGGCGG） CAAT盒盒（CCAATC）CAAT盒盒GC盒盒TATA盒盒转录起始点转录起始点-30bp -110bp启动子启动子 promoter48 增强子增强子* ： 远离转录起始点、决定组织特异性表达、增强启动子转远离转录起始点、决定组织特异性表达、增强启动子转 录活性的特异录活性的特异DNA序列，其发挥作用的方式与方向、距序列，其发挥作用的方式与方向、距 离无关。离无关。 抑制子抑制子* ： 对启动子转录活性起抑制作用的对启动子转录活性起抑制作用的 DNA序列序列

24、负性调节元件负性调节元件49 2、反式作用因子（转录因子）、反式作用因子（转录因子） 转录因子、转录调节因子、转录调节蛋白转录因子、转录调节因子、转录调节蛋白u 基本转录因子基本转录因子u 转录激活因子转录激活因子u 转录抑制因子转录抑制因子 50 绝大多数转录因子属于绝大多数转录因子属于反式作用因子反式作用因子*真核生物：真核生物：由某一基因表达后，通过由某一基因表达后，通过DNA-蛋白质或蛋白质蛋白质或蛋白质-蛋白质相互作用控制另一基因的转录。蛋白质相互作用控制另一基因的转录。51 AB52 RNA聚合酶结合启动子所必须的一组转录因子聚合酶结合启动子所必须的一组转录因子u 基本转录因子基本

25、转录因子FEBDARNA pol TATADNATATA TFD TFA TFB TFF TFERNA pol53 u 转录激活因子转录激活因子 （正性调节因子）（正性调节因子） 通过通过DNA蛋白质、蛋白质蛋白质相互作用起蛋白质、蛋白质蛋白质相互作用起 正性调节作用的转录因子。正性调节作用的转录因子。u 转录抑制因子转录抑制因子 （负性调节因子）（负性调节因子） 通过通过DNA蛋白质、蛋白质蛋白质相互作用起负蛋白质、蛋白质蛋白质相互作用起负 性调节作用的转录因子。性调节作用的转录因子。与增强子结合的转录因子与增强子结合的转录因子与抑制子结合的转录因子与抑制子结合的转录因子54真核真核RNA聚

26、合酶聚合酶II不能单独识别启动子，而是由基本不能单独识别启动子，而是由基本转录因子转录因子TFIID识别并结合启动子，形成识别并结合启动子，形成TFIID启动启动子复合物，然后有一系列的转录因子（如子复合物，然后有一系列的转录因子（如TFIIA、TFIIB、TFIIE、TFIIF等）加入形成前起始复合物，等）加入形成前起始复合物，调节转录的起始。调节转录的起始。3mRNA转录激活及其调节转录激活及其调节55第三节第三节 重组重组DNA技术技术56基因重组（基因重组（genetic recombination） 自然发生的基因重排自然发生的基因重排 真核、原核均会发生真核、原核均会发生 基因变异

27、、物种演变、生物进化的基础基因变异、物种演变、生物进化的基础基因工程（基因工程（genetic engineering）重组）重组DNA技术技术人工进行基因重组人工进行基因重组57 克隆克隆*(名词名词)：就是指来自同一母本的所有副本或就是指来自同一母本的所有副本或 拷贝的集合。拷贝的集合。 克隆化（动词）：克隆化（动词）：获取同一拷贝的过程。获取同一拷贝的过程。二、重组二、重组DNA技术相关概念技术相关概念母本母本克隆克隆clonecloning（一）（一） 克隆与克隆化克隆与克隆化58 细胞克隆：细胞克隆： 从大量群体细胞中分离出某一种类型细胞，从大量群体细胞中分离出某一种类型细胞， 经扩

28、增获得这样一类相同的细胞。经扩增获得这样一类相同的细胞。在分子生物学领域所说的分子克隆专指在分子生物学领域所说的分子克隆专指 DNA克隆克隆(DNA cloning)。 分子克隆：分子克隆： 从众多不同的分子群体中分离到的很多相同分子的集合。从众多不同的分子群体中分离到的很多相同分子的集合。59（二）（二）重组重组DNA技术技术* 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（目的基因或目的（目的基因或目的DNA）与载体）与载体DNA连接成复制子，连接成复制子，然后通过转化或转染等方法导入宿主细胞，生长、然后通过转化或转染等方法导入宿主细胞，生长、筛选出

29、含有目的基因的转化子细胞。转化子细胞经筛选出含有目的基因的转化子细胞。转化子细胞经扩增、提取，获得大量目的扩增、提取，获得大量目的DNA的无性繁殖系，即的无性繁殖系，即DNA克隆，基因工程。克隆，基因工程。 60 目的目的 DNA 载体载体DNA连接连接复制子（重组复制子（重组DNA）导入宿主细胞导入宿主细胞 （转化或转染）（转化或转染）转化子细胞转化子细胞转化子细胞扩增，可获得大量重组转化子细胞扩增，可获得大量重组DNA 61 基因克隆基因克隆DNA 克隆克隆重组重组DNA同一概念同一概念生物技术工程生物技术工程基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程 获

30、得获得DNA的无性繁殖系的无性繁殖系 获得目的基因的表达产物获得目的基因的表达产物重组重组DNA的目的的目的 62（三）（三） 工具酶工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶反转录酶反转录酶多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶63 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶*识别和切割双链识别和切割双链DNA分子内部特异核苷酸序列分子内部特异核苷酸序列的一类核酸酶。的一类核酸酶。限制性核酸内切酶共分三类，基因工程常用限制性核酸内切酶共分三类，基因工程常用II类酶，这类酶常识别类酶，这类酶常识别DNA的回文序列的回文序列 * 。64 Hpa I：5- GTT AAC - 3 3- CA

31、A TTG -5平端平端Pst I： 5- CTGCA G - 3 3- G ACGTC -53突出粘性末端突出粘性末端EcoRI：5- G AATT C - 3 3- C TTAA G -55突出粘性末端突出粘性末端65 （四）目的基因（四）目的基因 target genecDNA (complementary DNA) 在体外以在体外以RNA（通常为（通常为mRNA）为模板，）为模板，经反转录合成的单链经反转录合成的单链DNA。基因组基因组DNA(genomic DNA) 代表一个细胞或生物体整套遗传信息的代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有所有DNA序列。序列。目的基因又称外源目的基因

32、又称外源DNA66 携带外源携带外源DNA，实现外源，实现外源DNA无性繁殖或表达有意义的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些蛋白质所采用的一些DNA分子。分子。 常用载体：常用载体： 质粒质粒 噬菌体噬菌体DNA 病毒病毒DNA质粒质粒 （1）双链环状）双链环状DNA，细菌染色体外，细菌染色体外 （2）2 - 3kb 或或 数百数百kb （3）独立自主复制，稳定遗传）独立自主复制，稳定遗传 （4）遗传标志）遗传标志 (五五) 基因载体基因载体 （克隆载体）（克隆载体）67三、重组三、重组DNA技术技术的原理的原理 与基本过程与基本过程*1. 获取目的基因获取目的基因2. 选择、构建基因载

33、体选择、构建基因载体3. 目的基因与载体连接，形成重组分子目的基因与载体连接，形成重组分子4. 重组分子导入受体细胞重组分子导入受体细胞5. 筛选、扩增筛选、扩增6. 表达目的基因表达目的基因68 +载体载体目的基因目的基因重组重组DNA分子分子细菌细菌转化或转染转化或转染扩增扩增筛选筛选69（1） 化学合成化学合成 （4） PCR（2） 基因组基因组DNA文库文库 （3） cDNA文库文库 1. 获取目的基因获取目的基因70 组织或细胞染色体组织或细胞染色体 限制性内切酶限制性内切酶多个多个DNA片段片段载体载体多种转化子多种转化子 （基因文库）（基因文库）重组重组DNA 导入宿主细胞导入宿

34、主细胞mRNA逆转录逆转录cDNAcDNA文库文库71聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR） 在有特定模板、特异在有特定模板、特异DNA引物及合成引物及合成DNA所需要的所需要的dNTP存在时，向存在时，向DNA合成体系内加入耐热的合成体系内加入耐热的DNA聚合聚合酶（酶（如如Taq DNA聚合酶聚合酶* ），经反复变性、退火及延），经反复变性、退火及延伸的多个循环反应，生成特异伸的多个循环反应，生成特异DNA产物的过程。产物的过程。 72 变性：变性：解开模板双链解开模板双链DNA 95 退火：退火：使引物与单链模板使引物与单链模板DNA结合结合 55 延伸：延伸：DNA链的合成链的合成 72 73 2. 克隆载体的选择与构建克隆载体的选择与构建 目的基因不能自我复制目的基因不能自我复制 3. 目的基因与载体连接（目的基因与载体连接（DNA连接酶连接酶* ）重组重组DNA4. 重组重组DNA导入受体菌导入受体菌安全菌安全菌 感受态感受态导入方式：转化导入方式：转化 转染转染 感染感染74 5. 重组体的筛选重组体的筛选（1）直接选择法）直接选择法 抗药性标志选择抗药性标志选择 ampr tetr kanr 标志补救标志补救 互补互补 分子杂交