微生物检验培养基质量控制

1、微生物检验培养基微生物检验培养基质量控制质量控制概念n细菌的生长繁殖需要一定的营养条件，为细菌的生长繁殖需要一定的营养条件，为获取能力并维持其生长繁殖，细菌必须从获取能力并维持其生长繁殖，细菌必须从外界吸取某些物质，包括水分、碳源、氮外界吸取某些物质，包括水分、碳源、氮源、无机盐和生长因子。不同种类的细菌源、无机盐和生长因子。不同种类的细菌对营养的要求也不同。对营养的要求也不同。概念n培养基具有适合细菌生长需要的各种营养培养基具有适合细菌生长需要的各种营养物质，包括微生物生长所需要的水分、碳物质，包括微生物生长所需要的水分、碳源、氮源、无机盐及某些生长因子（维生源、氮源、无机盐及某些生长因子（

2、维生素、辅酶）等。素、辅酶）等。n除此以外，还具备待培养菌适宜生长的酸除此以外，还具备待培养菌适宜生长的酸碱度。碱度。n培养基是人工配制的微生物生活环境培养基是人工配制的微生物生活环境分类主要用于增菌用于检测动力及保存菌种用于分离鉴定细菌分类双糖铁培养基SS培养基普通琼脂培养基血液琼脂培养基 庖肉培养基概 念n由于不同批次的蛋白胨、浸膏（粉）、琼由于不同批次的蛋白胨、浸膏（粉）、琼脂、胆盐等成分的质量及酸碱度不同等，脂、胆盐等成分的质量及酸碱度不同等，影响了培养基质量的稳定性影响了培养基质量的稳定性 。n适宜的培养基制备方法、储存条件和质量适宜的培养基制备方法、储存条件和质量控制是提高优质培养

3、基的保证控制是提高优质培养基的保证主要内容n培养基购置、贮存、制备、使用注意事项n培养基质量控制n常用菌株保存方法一、培养基购置、贮存、制备、使用注意事项 购置 n依据依据ISO/IEC17025ISO/IEC17025检测和校准实验室能力的通用要检测和校准实验室能力的通用要求求，对培养基的供应企业进行评价后选择合格的供应，对培养基的供应企业进行评价后选择合格的供应商；商；n应选择产品市场信誉度高、有质量保证能力和服务保证应选择产品市场信誉度高、有质量保证能力和服务保证能力的企业；能力的企业；n要求生产企业提供：培养基成分名称及产品编号、批号、要求生产企业提供：培养基成分名称及产品编号、批号、

4、使用前的使用前的pHpH、储藏信息和有效期、性能评价和所用测试、储藏信息和有效期、性能评价和所用测试菌株、技术数据清单、质控证书以及必要的安全菌株、技术数据清单、质控证书以及必要的安全/ /危害危害数据等材料。数据等材料。 验收n购买的培养基到货后，应有专人做好接受和验收购买的培养基到货后，应有专人做好接受和验收工作，应仔细核对生产企业提供的资料、培养基工作，应仔细核对生产企业提供的资料、培养基名称、规格数量、外观特征、批号、保质期是否名称、规格数量、外观特征、批号、保质期是否符合要求。符合要求。n每批培养基到货物后都应对培养基的质量进行检每批培养基到货物后都应对培养基的质量进行检测，满足检测

5、方法规定的要求后方可投入使用。测，满足检测方法规定的要求后方可投入使用。 培养基的储存培养基的储存 n干粉培养基应保存在阴凉干燥处，要避免阳光直干粉培养基应保存在阴凉干燥处，要避免阳光直射；未开瓶的培养基在室温下的最长保存射；未开瓶的培养基在室温下的最长保存2年，年，开瓶后的干粉培养基易吸湿，应注意防潮并在开瓶后的干粉培养基易吸湿，应注意防潮并在6个月内用完。应定期对储存中的培养基进行常规个月内用完。应定期对储存中的培养基进行常规检查，如容器密闭性复查、首次开封日期、内容检查，如容器密闭性复查、首次开封日期、内容物的感官检查，如果培养基发生结块、颜色异常物的感官检查，如果培养基发生结块、颜色异

6、常和其他变质迹象就不能再使用。和其他变质迹象就不能再使用。 培养基的制备培养基的制备 n制备培养基用容器不得为铜锅或铁锅，以防有离制备培养基用容器不得为铜锅或铁锅，以防有离子混入培养基中，影响微生物的生长。子混入培养基中，影响微生物的生长。n所有容器在使用前都要根据不同的情况，经过一所有容器在使用前都要根据不同的情况，经过一定的处理，洗刷干净。有的还要进行包装，经过定的处理，洗刷干净。有的还要进行包装，经过灭菌等准备就绪后，才能使用。灭菌等准备就绪后，才能使用。n容器的大小需大于复水后培养基总体积的容器的大小需大于复水后培养基总体积的2倍以倍以上，避免在加热溶解过程中，培养基溢出。上，避免在加

7、热溶解过程中，培养基溢出。 培养基的制备培养基的制备 n培养基制备用水中不能含有任何抑制或影培养基制备用水中不能含有任何抑制或影响微生物生长的物质。响微生物生长的物质。n使用蒸馏水或与其同质的水。使用蒸馏水或与其同质的水。n最好不使用离子交换器生产的去离子水。最好不使用离子交换器生产的去离子水。 培养基的制备培养基的制备 n每次制备培养基均应有记录，包括培养基每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终最终pH值、消毒的温度和时间制备的日期值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等，记录复制复制一份，原记录和制备者等，记录复

8、制复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。存放、以防发生混乱。培养基的制备培养基的制备 n培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍乱，最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方面军做出记号，并侧，每称完一种成分即在配方面军做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后，还取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后，还应进行一次检查。应进行

9、一次检查。n培养基所用化学药品均应是化学纯的培养基所用化学药品均应是化学纯的 培养基的制备培养基的制备 n在培养基分装灭菌前，各成分应溶解均匀。在培养基分装灭菌前，各成分应溶解均匀。n在锅中溶化时、可先用温水加热并随时扰动、以防焦化、在锅中溶化时、可先用温水加热并随时扰动、以防焦化、如发现有焦化现象、该培养基即不能使用，应重新制备。如发现有焦化现象、该培养基即不能使用，应重新制备。待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所有成分完全待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所有成分完全溶化，迄至煮沸。如为琼脂溶化，用另一部分水溶化其它溶化，迄至煮沸。如为琼脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后将两溶

10、液充分混合。在加热溶化过程中，因蒸成分，然后将两溶液充分混合。在加热溶化过程中，因蒸发而丢失的水分，最后必须加以补足。发而丢失的水分，最后必须加以补足。培养基的制备培养基的制备n因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变化，培养基各成分完全溶解后，应进行PH的初步调正。例如，牛肉浸液约可降低pH0.2，而肠浸液pH却会有显著的升高。因此，对这个步骤，操作者应随时注意探索经验、以期能掌握培养基的最终PH，保证培养基的质量。n一般灭菌前比最终pH高0.2-0.3 。n 用1mol/L Na0H或 lmol/LHCL调整。 培养基的灭菌培养基的灭菌 n已配制好的培养基必须立即灭菌，避免微生物生长繁殖而已

11、配制好的培养基必须立即灭菌，避免微生物生长繁殖而消耗养分，改变培养基的酸碱度。消耗养分，改变培养基的酸碱度。n高温可破坏培养基的营养成分，还会使琼脂的凝胶强度下高温可破坏培养基的营养成分，还会使琼脂的凝胶强度下降，因此必须严格控制灭菌温度和时间，并且不可重复灭降，因此必须严格控制灭菌温度和时间，并且不可重复灭菌。菌。n高压蒸汽灭菌锅的压力表等要定期进行检定，并定期采用高压蒸汽灭菌锅的压力表等要定期进行检定，并定期采用生物指示菌法或化学变色纸片对灭菌效果进行验证。生物指示菌法或化学变色纸片对灭菌效果进行验证。 培养基的灭菌培养基的灭菌 n灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度，避免灭菌以后培养基应

12、该迅速冷却至所需温度，避免长时间保存在灭菌锅内，造成过度灭菌，影响培长时间保存在灭菌锅内，造成过度灭菌，影响培养基的营养成分或选择性效果。养基的营养成分或选择性效果。n每批培养基制备好以后，应仔细检查一遍，如发每批培养基制备好以后，应仔细检查一遍，如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终染等、均应挑出弃去。并测定其最终pHpH。n将全部培养基放入将全部培养基放入36361 1C C恒温箱培养过夜，如恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。发现有菌生长，即弃去。培养基的储存培养基的储存n培养基应存放于冷暗处，最好能放

13、于普通冰箱培养基应存放于冷暗处，最好能放于普通冰箱n放置时间一般不宜超过一周。放置时间一般不宜超过一周。n倾注的平板培养基不宜超过倾注的平板培养基不宜超过3 3天。如果保存时间超天。如果保存时间超过过2 2天，应将其放入密封的塑料袋中保存。天，应将其放入密封的塑料袋中保存。n配好的肉汤类培养基如果保存时间超过配好的肉汤类培养基如果保存时间超过2 2周，应将周，应将其放在带有螺旋盖的试管或其它密闭的试管或容其放在带有螺旋盖的试管或其它密闭的试管或容器中防止蒸发器中防止蒸发培养基的使用培养基的使用n平板在接种使用时，表面必须无明显潮湿水珠。n对于冰箱保存的平板，应待温度回复至室温后再使用n用于沉降

14、菌检测的所有平板必须经无菌试验后才可使用n固体培养基灭菌后再融化只允许一次。培养基质量控制n由于不同批次的蛋白胨、浸膏（粉）、琼由于不同批次的蛋白胨、浸膏（粉）、琼脂、胆盐等成分的质量及酸碱度不同等，脂、胆盐等成分的质量及酸碱度不同等，影响了培养基质量的稳定性影响了培养基质量的稳定性 。因此对购入。因此对购入的干培养基开展质量检验验收是实验室室的干培养基开展质量检验验收是实验室室内质量控制的重要内容之一内质量控制的重要内容之一。现有培养基质控标准nWS/T 232 2003 商业性微生物培养基质量检定规程n卫生部卫监发（1993）7号文件 食品卫生微生物检验用干燥培养基生产质控和质量标准质控参

15、数n1.1.外观：干粉色泽、研细度。外观：干粉色泽、研细度。2.2.溶解后培溶解后培养基色泽、透明度、杂质、沉淀物、硬度养基色泽、透明度、杂质、沉淀物、硬度（凝胶强度）；（凝胶强度）；n3.3.灭菌后灭菌后pHpH值；值；n4.4.菌落形态、菌落大小（菌落形态、菌落大小（直径直径）；）；5.5.生长生长率率计数培养基判断结果计数培养基判断结果n干粉色泽均匀、研细度好，色泽符合要求干粉色泽均匀、研细度好，色泽符合要求n制备好的培养基有相应的颜色，一般的培养基应澄制备好的培养基有相应的颜色，一般的培养基应澄清、无浑浊、无沉淀。清、无浑浊、无沉淀。npHpH值符合、硬度适宜，划线不破、透明无沉淀物。

16、值符合、硬度适宜，划线不破、透明无沉淀物。菌落大小、形态与对照培养基一致。菌落大小、形态与对照培养基一致。%70%100%对照培养基上菌落总数试验培养基上菌落总数）生长率（选择性培养基判断结果选择性培养基判断结果n检查项目：检查项目：n 促生长能力促生长能力n 抑制能力抑制能力n 指示能力指示能力事例1n3批4号培养基质量控制编号编号生生 产产 厂厂 家家批号批号1 市微生物培养基厂市微生物培养基厂0801242 试剂有限公司试剂有限公司0803153市疾病预防控制中心市疾病预防控制中心20070821培养基质控参数培养基质控参数PHPH值值霍乱弧菌生长率霍乱弧菌生长率杂菌抑制能力杂菌抑制能力

17、菌落典型性菌落典型性 结果（一）nPH值：受试培养基均在要求范围内n杂菌抑制能力：采用的4株测试菌株肉汤混和物在四号平板上均无生长。培养基编号O139 小川稻叶 1+/- - + 2 + - + 3+ + +/-编号O139生长率（%） 小川生长率（%）稻叶生长率（%）195.286.693.62 92.884.195.3394.690.892.5结论n3批培养基均为合格产品。事例2n6批SS培养基质量控制培养基理化指标pH值色泽硬度透明度17.10正常（橙红）适宜、划线不破透明、无不溶物26.70偏红适宜、划线不破透明、无不溶物36.90偏红适宜、划线不破透明、无不溶物47.20正常（橙红）

18、适宜、划线不破透明、无不溶物56.80偏红适宜、划线不破透明、无不溶物66.60紫红适宜、划线不破透明、无不溶物对照7.20正常适宜、划线不破透明、无不溶物pH值、色泽、硬度、透明度、沉淀物结果值、色泽、硬度、透明度、沉淀物结果pH值、色泽、硬度、透明度、沉淀物检测结值、色泽、硬度、透明度、沉淀物检测结果果1、硬度、透明度、沉淀物6批培养基均符合要求2、 pH值除1号、4号符合要求外，其他培养基均偏低，尤其是6号更是低至6.603、凝固后的琼脂色泽符合性与pH值相同。24h菌落形态菌落形态 培养基鸭沙门菌鸭沙门菌ATCC50083鼠伤寒沙门菌鼠伤寒沙门菌ATCC50013伤寒沙门菌伤寒沙门菌A

19、TCC50097肠炎沙门菌肠炎沙门菌分离株分离株大肠埃希菌大肠埃希菌ATCC25922ATCC25922形态大小形态大小形态大小形态大小形态大小1无适中H 2S适中无适中H 2S适中挑红适中2H 2S适中无较小无适中无较小挑红适中3H 2S适中无较小无适中H 2S较小挑红适中4H 2S较大H 2S适中无适中H 2S适中挑红适中5无较大无 适中无适中无适中挑红适中6无适中无 适中无较小无适中挑红适中对照对照正常适中正常适中正常适中正常适中正常适中36h菌落形态菌落形态 培养基鸭沙门菌鸭沙门菌ATCC50083鼠伤寒沙门菌鼠伤寒沙门菌ATCC50013伤寒沙门菌伤寒沙门菌ATCC50097肠炎沙门

20、菌肠炎沙门菌分离株分离株大肠埃希菌大肠埃希菌ATCC25922形态大小形态大小形态大小形态大小形态大小1H 2S适中H 2S适中H 2S适中H 2S适中挑红适中2H 2S适中无较小无适中H 2S较小挑红适中3H 2S适中H 2S适中H 2S适中H 2S较小挑红适中4H 2S较大H 2S适中无适中H 2S适中挑红适中5H 2S较大无 适中无适中H 2S适中挑红适中6无适中无 适中无较小H 2S较小挑红适中对对照照正常适中正常适中正常适中正常适中正常适中48h菌落形态菌落形态 培养基鸭沙门菌鸭沙门菌ATCC50083鼠伤寒沙菌鼠伤寒沙菌ATCC50013伤寒沙门菌伤寒沙门菌ATCC50097肠炎沙

21、门肠炎沙门菌菌分离株分离株大肠埃希菌大肠埃希菌ATCC25922形态大小形态大小形态大小形态 大小形态大小1H 2S适中H 2S适中H 2S适中H 2S适中挑红适中2H 2S适中无较小无较小H 2S适中挑红适中3H 2S适中H 2S适中H 2S较小H 2S适中挑红适中4H 2S较大H 2S适中无适中H 2S适中挑红适中5H 2S较大无 适中无适中H 2S适中挑红适中6H 2S适中无 适中H 2S较小H 2S较小挑红适中对对照照正常适中正常适中正常适中正常 适中正常适中菌落形态结果菌落形态结果n1号、4号培养基菌落形成H2S速度较快,大小也适中。n5号、6号、3号培养基菌落大小适中,但形成H2S

22、速度较慢。n2号、3号培养基部分菌落偏小，形成H2S速度较慢。nH 2S形成时间：24h与36h差异明显。36 h与42h 差异不明显。菌落直径和生长率检测结果菌落直径和生长率检测结果培养基大肠埃希菌大肠埃希菌ATCC25922鼠伤寒沙门菌鼠伤寒沙门菌ATCC50013志贺菌志贺菌ATCC51573伤寒沙门菌伤寒沙门菌ATCC50097直径 (mm)生长率(%)直径(mm)生长率(%)直径(mm)生长率(%)直径(mm)生长率(%)12.5048.402.69103.952.4258.331.8871.8622.7011.762.2063.842.2341.671.8098.2032.7013

23、.072.6070.062.3039.581.7073.6542.6031.702.78110.172.4862.501.82104.7052.6213.732.6080.792.4052.081.80111.3862.701.312.6097.742.3233.3331.80100.00对照对照2.90100.002.80100.002.60100.002.20100.00 项目1号 2号 3号 4号 5号 6号 外观符合符合符合符合符合符合pH值符合7.10偏低6.70偏低6.90符合7.20偏低6.80过低6.60色泽符合偏红偏红符合偏红过红硬度、沉淀物符合符合符合符合符合符合菌落形态典

24、型H 2S迟、菌落小H 2S迟、菌落小典型H 2S偏迟H 2S偏迟大肠菌菌落直径2.50mm2.70mm2.70mm2.60mm2.62mm2.70mm生长率48.40%11.76 %13.07 %31.70 %13.73 %1.31% 沙门菌菌落直径2.69mm2.20mm2.60mm2.78mm2.60mm2.60mm生长率103.95%63.84%70.06110.1780.7997.74志贺菌菌落直径2.42mm2.23mm2.23mm2.48mm2.40mm2.40mm生长率58.3341.6739.5862.50%52.0833.33%结论合格不合格不合格合格基本合格基本合格n常见

25、培养基干粉外观要求常见培养基干粉外观要求.doc.docn常见培养基典型菌落形态常见培养基典型菌落形态.doc.docn增菌类培养基的质量要求增菌类培养基的质量要求.doc.doc常用菌株保存方法质控菌株要求n标准菌株：来自国际/国家菌种保藏中心(本标准要求为ATCC菌株)或经ISO9002认证的经销商提供的菌株(有资质)n制备储备菌株和工作菌株时一次制备多份，每株菌原则上不能重复使用n通常工作菌株不能再传代，但处理得当可再次使用标准储备菌株(Reference stock)n标准菌株在实验室经过一次传代获得的一组完全相同的菌株传代菌株应当完全具备标准菌株的所有性状传代时要保证一定的量(减少传

26、代次数)每株菌株尽量避免多次使用采用不同的保存方法保存期限不同n如冻干法,液氮法,穿刺法,液体石蜡法,斜面保存法等(见后)菌种保藏方法n斜面冰箱保藏法斜面冰箱保藏法n液体石蜡封藏法液体石蜡封藏法n半固体保存法n液氮保存法n低温保存法n冷冻真空干燥保藏法冷冻真空干燥保藏法斜面冰箱保藏法斜面冰箱保藏法n：将菌种接在新鲜斜面培养基上，定温培养长：将菌种接在新鲜斜面培养基上，定温培养长出丰满菌苔后，一般形成芽孢的细菌要形成芽出丰满菌苔后，一般形成芽孢的细菌要形成芽孢，形成孢子的微生物要长出孢子，贴上标签，孢，形成孢子的微生物要长出孢子，贴上标签，放在试管架上，在棉塞部位用尼龙紙或防水紙放在试管架上，在

27、棉塞部位用尼龙紙或防水紙包好，放入包好，放入40C冰箱中保藏。一般每隔冰箱中保藏。一般每隔3个月至个月至半年用新鲜培养基移植半年用新鲜培养基移植1次。方法简便，实验次。方法简便，实验室均采用。室均采用。 缺点：移接代数太多，易产生变异、退化缺点：移接代数太多，易产生变异、退化。液体石蜡封藏法液体石蜡封藏法 n在已长好的斜面菌种上加入无菌液体石蜡在已长好的斜面菌种上加入无菌液体石蜡油，高出斜面油，高出斜面1cm直立试管放入冰箱保藏，直立试管放入冰箱保藏，适用保存细菌和放线菌。适用保存细菌和放线菌。 石蜡的处理：石蜡的处理：250mL三角瓶装三角瓶装100mL液体液体石蜡，石蜡，1.05kg/cm

28、3高压灭菌高压灭菌30min，然后，然后放在放在1050C左右的烘箱中左右的烘箱中1h，使水分蒸发，使水分蒸发掉。掉。半固体保存法n将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中，在适宜条件下培养培养结束后，无菌操作在层流台下用无菌吸管吸取无菌液体石蜡至培养好的菌种管内，并使石蜡高出菌种表面约1cm，将试管直立，置于2-8冰箱中或室温下保存。n此法制备简单，不需要其他特殊设备 n一般无芽胞细菌也可保藏1年左右 n缺点是保存时必须直立放置，不便携带；取培养物接种时，当接种环在火焰上灼烷时容易飞溅液氮保存法液氮保存法保存制备细胞悬液，甘油或二甲亚砜作保护剂分装无菌安瓿瓶，每管0.2ml预冻至-40（控制温度下降速率为1min）放入液氮生物贮存罐中气相保存恢复直接浸入38水浴中解冻510min转接于适宜培养基内培养注意：大多数属种适于慢速冻结和快速解冻适用菌种适用菌种病毒支原体各类细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌蓝藻动物细胞 液体石蜡覆盖保