创伤弧菌脓毒症大鼠肺组织脂多糖受体CD14mRNA核因子κB的基因动态表达

1、创伤弧菌脓毒症大鼠肺组织脂多糖受体CD14 mRNA、核因子-B的基因动态表达 作者：郑阿迈，陈玉熹，李萌芳，梁欢，卢中秋【摘要】 目的:探讨创伤弧菌（Vibrio vulnificus，VV）脓毒症大鼠肺组织脂多糖受体CD14 mRNA、核因子-B（NF-B）基因的表达及其动态变化。方法:SD雄性大鼠60只，随机分为6组，每组10只。第1组：正常对照组（NC组）；第26组为VV组: 予大鼠下肢皮下注射VV，造成VV脓毒症模型，以注射VV后2、6、9、12、16 h各时间点分别为26组。取各组大鼠部分肺组织，用RT-PCR法测定大鼠肺组织不同时间点CD14 mRNA、NF-B mRNA的表达。

2、结果: NC组大鼠肺组织有少量CD14、NF-B mRNA表达，分别为0.3920.056和0.3660.179。感染VV后大鼠肺组织CD14 mRNA表达增加，2、6、9、12、16 h的表达量分别为0.9760.180，1.1480.218，1.0260.033，0.9880.129，0.9700.125。大鼠肺组织NF-B mRNA表达量也明显增加，2、6、9、12、16 h的表达量分别为0.7630.215，1.1000.101，1.0680.174，1.0570.076和0.8000.205。与NC组相比，二者均明显升高（P0.05）。结论:VV脓毒症大鼠肺组织CD14、NF-B的基

3、因表达水平在脓毒症中明显升高，其与脓毒症的发生、发展密切相关，动态监测其改变对VV脓毒症发病过程具有一定的预警意义。 【关键词】 创伤弧菌；脓毒症；脂多糖受体CD14；核因子-B；基因 Abstract: Objective: To detect the Gene expression and the dynamic change of pulmonary lipopolysaccharide receptor CD14 and NF-B in rats with Vibrio vulnificus (VV) sepsis. Methods: Sixty male Sprague-Dawley

4、 (SD) rats were equally divided into six groups randomly. The first group was named control group. VV groups include the second to sixth group which were injected VV to make VV sepsis model. Samples were taken from control group and the second group to the sixth group at the timepoint of 2，6，9，12，16

5、 h after injection respectively，the genes of pulmonary lipopolysaccharide receptor CD14 and NF-B in ratslung were measured in the different time by the method of RT-PCR. Results: The Gene expression of pulmonary lipopolysaccharide receptor CD14 and NF-B in the control group was a low level（0.3920.05

6、6，0.3660.179），but they increased significantly at 2 h（0.9760.180，0.7630.215），6 h（1.1480.218，1.1000.101），9 h（1.0260.033，1.0680.174），12 h（0.9880.129，1.0570.076），16 h（0.9700.125，0.8000.205）after VV being injected（P 0.05）. Conclusion: Our data suggest that the Gene expression of pulmonary lipopolysaccha

7、ride receptor CD14 and NF-B elevation are associated with the development of VV sepsis. Monitoring the change of the Gene expression of pulmonary lipopolysaccharide receptor CD14 and NF-B in the lung have the benefit of mastering the VV sepsis progress. Key words: Vibrio vulnificus；sepsis；CD14；NF-B；

8、gene 创伤弧菌（Vibrio vulnificus，VV）是一种高致死性嗜盐性G-弧菌，可引起严重的伤口感染、脓毒症等1。CD14作为脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的重要受体，与脂多糖结合蛋白（Lipopolysaccharide-Binding Protein，LBP）共同作用可明显提高各种细胞对内毒素的敏感性，在炎症反应、脓毒症等病理反应中起重要作用，其在脓毒症中的地位日益受到重视2。核转录因子-B (NF -B) 是细胞内普遍存在的重要转录因子，对许多细胞因子和炎性递质的基因都有调控作用3。我们通过制作大鼠VV脓毒症模型，测定肺组织 CD14、NF-B的基因的

9、表达及其动态变化，并探讨VV脓毒症时肺组织 CD14、NF-B的基因的表达动态变化和规律，为进一步研究创伤弧菌脓毒症发病机制提供资料。 1 材料和方法 1.1 实验动物 清洁级Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠60只，体重为270300 g，由温州医学院动物实验中心提供（许可证为SCXK(沪) 2003- 0003）。 1.2 细菌来源 从VV感染患者下肢血疱中抽取疱液，接种在血平板上，37 、24 h培养分离纯化，细菌鉴定为 VV，菌株编号为812013，按常规方法制作成创伤弧菌悬液，浓度为9108 cfu/ml备用。 1.3 实验材料 Trizol试剂，逆转录试剂盒均由Invit

10、rogen公司提供。PCR试剂盒由Fermentas公司提供。Rat CD14引物（引物序列：Forward 5-GTGCTCCTGCCCAGTGAAAGAT-3，Reverse5-GATCTGTCTGACAACCCTGAGT-3，PCR产物长度: 268 bp），Rat NF-B（引物序列：Forward 5-CCAGATCAATGGCTACACGG-3，Reverse 5-CGCATTCAAGTCATAGTCCC-3，PCR产物长度: 286 bp），Rat -actin引物（引物序列：Forward 5-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3，Reverse 5-GAAGCATT

11、TGCGGTGGACGAT-3，PCR产物长度: 315 bp）由上海生物工程公司合成。酶标仪由BioRAD公司提供。梯度PCR仪由Eppendof公司提供。水平电泳仪由北京六一电泳厂提供。凝胶成像分析系统由Pharmacia公司提供。 1.4 实验方法 1.4.1 建立大鼠VV脓毒症模型。SD雄性大鼠60只，购来后饲养1周以上，实验前禁食12 h，自由进水。随机分为6组，每组10只。第1组：正常对照组（NC组），麻醉后处死。第26组：VV脓毒症组（VV组），予双下肢皮下注射VV，细菌浓度为9108 cfu/ml，剂量为1 ml/100 g，制作 VV 脓毒症模型。大鼠脓毒症模型诊断标准参照文

12、献4。VV组大鼠分别在注射创伤弧菌后2、6、9、12、16 h各时间点分别为26组，麻醉后处死。无菌取部分肺组织，用4 生理盐水冲洗后迅速置于液氮中保存待用。 1.4.2 RT-PCR法测定大鼠肺组织 CD14、NF-B的mRNA表达。取冻存大鼠肺组织约50 mg，按Trizol说明书，提取大鼠肺组织总RNA。用分光光度计检测总RNA的浓度和纯度，要求OD260/OD280比值在1.82.0之间。根据逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应。用1.5%琼脂糖凝进行电泳。同时加合适的DNA ladder。采用凝胶成像分析系统观察电泳结果，并用Quantity One软件进行凝胶扫描分析。以目的基因/-a

13、ctin为该基因表达的相对值。 1.5 统计学处理方法 采用单因素方差分析，并用LSD法进行组间两两比较。 2 结果 2.1 VV脓毒症大鼠肺组织CD14 mRNA的表达 NC组大鼠肺组织有少量CD14 mRNA表达量为（0.3920.056），感染VV后其表达增加，VV组染菌后2、6、9、12、16 h肺组织的CD14 mRNA表达量分别为0.9760.180、1.1480.218、1.0260.033、0.9880.129、0.9700.125，与 NC 组相比，均明显升高（F36.30，P0.05），其中以染菌后6 h的表达量最高，9 h后其表达量较前有所降低，但染菌16 h的表达量仍明

14、显高于正常水平。 2.2 VV脓毒症大鼠肺组织NF-B mRNA的表达 NC组大鼠肺组织NF-B mRNA表达量低（为0.3660.179），感染VV后其表达增加，VV组染菌后2、6、9、12、16 h肺组织的NF-B mRNA表达量分别为0.7630.215、1.1000.101、1.0680.174、1.0570.076、0.8000.205，与NC组相比，均明显升高（F28.58，P0.05），其中以染菌后6 h的表达量最高。 3 讨论 VV是一种嗜盐性G-弧菌，在热带、亚热带环境中，可广泛存在于海水及海产品中，可通过生食海鲜和经过肢体破损创口感染人体，迅速发展为脓毒症，死亡率高达70%

15、以上，是一种沿海地区发生的致命性疾病。脓毒症及其引发的多器官功能障碍综合征（MODS）是VV脓毒症患者死亡的主要原因5。作为急性肺损伤（ALI）或急性呼吸窘迫综合征（ARDS）最常见的致病因素，脓毒症所致的MODS往往最先导致ALI，在此基础上恶化，累及其他脏器，以致发生MODS6。ALI的病理基础是广泛的肺泡-毛细血管膜损伤，这种损伤可原发于侵袭肺的理化或生物性因子的直接作用，但更重要的是炎性反应引起的损伤，它往往是全身性炎症反应的肺部表现。 近年来的研究显示，LPS先与LBP结合，再传递给CD14分子，形成LPS/LBP/CD14复合物，该复合物与TLR4-MD2相互作用，激活胞内的几种信

16、号通路，包括NF-B通路和三种丝裂原活化蛋白激酶通路，可导致NF-B和AP-1(c-fos/c-jun)活化，诱导多种炎性细胞因子活化表达，从而造成组织损害3。 CD14的主要生物学活性是作为LPS受体，识别、结合LPS或LPS/LBP复合物，介导LPS所致的细胞反应。它分为膜性CD14(mCD14)和可溶性CD14(sCD14)两种。mCD14是一种55 kD的糖蛋白，通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚固于细胞膜，mCD14主要分布在单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等细胞表面，对LPS有高亲和力；sCD14无GPI结构，存在于血清、尿液和培养mCD14阳性细胞的上清液中, 由mCD14脱落或细胞分

17、泌产生。sCD14是LPS 作用于CD14阴性细胞的重要途径7。 LPS还可通过mCD14诱导中性粒细胞表面黏附受体的表达以及单核细胞对内皮细胞的黏附作用8。李红云等9的研究发现，大鼠烫伤合并金葡菌感染后，各重要脏器中CD14 mRNA表达均会明显增加，其中以肺组织的CD14 mRNA 表达升高最为显著，这可能与肺组织局部有大量炎性细胞聚集且CD14阳性细胞量较多有关。本实验中NC组大鼠肺组织仅有少量CD14 mRNA表达，注射VV后其各个时间点表达量均增加，与NC组相比，均明显升高（P0.05），其中以染菌后6 h的表达量最高，9 h后其表达量较前有所降低，但染菌16 h的表达量仍明显高于正

18、常水平。本结果表明VV感染可诱导肺组织CD14 mRNA表达上调，进一步刺激机体产生各种炎性递质，介导机体组织器官损伤。 NF-B广泛存在于静止细胞的细胞质中，由 Sen和Baltimoer于1986年发现。其蛋白二聚体与特异性抑制蛋白IB形成三聚体，以非活化形式存在于细胞质中，当细胞受到如细菌、细胞因子等刺激后IB可磷酸化而失活，进而使NF-B活化，进入细胞核内，启动基因转录10。它是多条信号转导途径的交汇点，广泛参与了机体免疫、炎症、应激反应等生理及病理过程，可高效诱导多种前炎性细胞因子（包括TNF-、IL-1、IL-6、IL-8等）、白细胞黏附分子、单核细胞趋化因子等的基因的表达，同时对

19、参与炎症级联及放大效应的多种酶的基因转录也具有重要的调控作用3，11。目前认为脓毒症发生的分子机制在于细胞因子和炎性递质的过度释放，LPS是主要诱导因素，NF-B经 LPS-CD14-TLR传导通路的激活，进入细胞核，调控众多炎性递质的基因表达，尤其是 TNF-和IL-1等原发性递质的增加，进一步作用于巨噬细胞等产生大量的继发性细胞因子和递质，这些炎性递质和细胞因子反过来又可以进一步激活NF-B，从而形成正反馈的级联放大效应，产生过度的炎症反应，引起组织和细胞的损害3，12。Browder等13在鼠盲肠结扎穿孔（CLP）致败血症研究中发现，经过CLP刺激引起多细菌性败血症后NF-B和NF-IL

20、-6核结合活性在肺脏出现迅速而明显的增加，败血症鼠的肺组织中转录因子激活过程与病死率呈正相关。本实验结果显示，正常大鼠肺组织NF-B mRNA表达量低，感染VV后其表达量较NC组明显升高（P0.05），其中以染菌后6 h的表达量最高。说明NF-B在VV脓毒症大鼠肺组织中明显被活化，可能与脓毒症的发生有着密切的联系。 综上所述，VV脓毒症时大鼠肺组织CD14、NF-B mRNA表达均明显上调，它们的变化趋势相近，提示组织CD14 mRNA的表达上调能进一步迅速激活细胞内NF-B。它们与VV脓毒症的发生、发展密切相关，动态监测它们的变化对VV脓毒症的发病过程具有一定预警意义。【参考文献】 1 卢中

21、秋,卢才教,陈雷,等.下肢创伤弧菌感染所致脓毒血症的临床治疗J.温州医学院学报,2003,33(3):327.2 Gegner JA,Ulevitch RJ,Tobias PS. Lipopolysaccharide (LPS)signal transduction and clearanceJ. J Biol Chem,1995,270(10):5320-5325.3 卢中秋,梁欢,李萌芳,等.创伤弧菌脓毒症大鼠肝组织核转录因子-B活性表达及抗菌药物的影响J.中国急救医学,2007,27(12):1090-1093.4 盛志勇,胡森.多器官功能障碍综合征M.北京:科学出版社, 1999:18

22、5-188.5 卢中秋,李秉煦,黄唯佳,等.创伤弧菌败血症的临床和流行病学特点J. 中华预防医学杂志,2003,37(5):378.6 Bi X,Flach CR,Perez-Gil J,et al.Secondary structure and lipidinteractions of the N-terminal segment of pulmonary sur-factant SP-C in Langmuir films: IR reflection-absorptionspectroscopy and surface pressure studiesJ. Biochemistry,2002,41(26):8385-8395.7 卢中秋,梁欢,李