A型肉毒神经毒素理化及生物学特性研究.docx

1、.论著A型肉毒神经毒素理化及生物学特性研究李小娟，张若晖，苗承辉，苏娟，何星，崔保峰，张雪平兰州生物制品研究所有限责任公司毒素制剂室甘肃省疫苗工程技术研究中心，甘肃兰州,730046摘要：目的探究A型肉毒神经毒素的理化及生物学特性，为A型肉毒神经毒素制品的研制提供依据。方法采用SDS-PAGE.HPLC测定A型肉毒神经毒素的纯度;采用毛细管凝胶电泳分析其在非还原条件及还原条件下各组分的相对分子质量;采用等电点聚焦电泳测定其等电点;对其N-末端氨基酸序列进行测序，并将测序结果与NCBIblast数据库中A型肉毒梭菌Hall株的氨基酸序列作比对，确证其各组分的成分;对A型肉毒毒素岌合物及A型肉毒神

2、经毒素进行曰服毒性分析，并对3批A型肉毒神经毒素原液和其半成品进行生物学稳定性研究。结果A型肉毒神经毒素纯度99.00%;非还原条件下其相对分子质量约为152000,N-末端氨基酸序列ALNDLQINVN,为完整的A型肉毒神经毒素;还原条件下，由相对分子质最约为101000.N-末端氨基酸序列为ALNDLQINVN的重链和相对分子质量约为101000、N-末端基基酸序列为PEVNKQFNYK的轻链组成;等电点为4.91；口服A型肉毒神经毒素的小鼠LDW为1.50X107U/kg,是其复合物的7.9倍;3批A型肉毒神经毒素原液在28Y放置28d生物学活性无下降,平均比活性为2.13X10U/mg

3、,是其复合物的7.1倍;3批半成品在1826T放置28d生物学活性无下降。结论A型肉毒神经毒素纯度较高,非还原条件下为单链，还原条件下裂解为轻链和重链，其原液及其半成品的生物学稳定性较好。关键词:A型肉毒神经毒素;A型肉毒毒索复合物;理化特性;生物学特性中图分类号：R971文献标志码：A文章编号：1005-5673(2016)04-0007-05DOI：10.13309/ki.pmi.2016.04.002PhysicochemicalpropertyandbiologicalcharacteristicsofbotulinumneurotoxintypeALlXiao-juan,ZHANGR

4、uo-hui,MIAOCheng-hui,SUJuan,HEXing,CUIBao-feng,ZHANGXue-pingDepartmentofToxinPreparation,IxinzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,Ltd.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,GansuProvince,ChinaCorrespondingauthor：ZHANGXue-ping,E-mail:zhangxp_lzAbstract:ObjectiveTostudytheph

5、ysicochemicalandbiologicalcharactrristicsofbotulinumneurotoxintypeA(BoNT/A)(simplifiedasneurotoxin),soastoprovideabasisondevelopmentofneurotoxinpreparation.MethodsThepurity,relativemolecularweight,isoelectricpoint,N-terminalaminoacidsequence,oraltoxicity,andbiologicalstabilityofneurotoxinwereinvesti

6、gatedbyusingofSDS-PAGE,HPI.C,CGE,sequencinganalysisandsoon,andthenincomparasionoftheobtainedsequenceresultofneurotoxinandtheaminoacidsintoxincomplexpreparationfromHallstrain(simplifiedastoxincomplex)publishedinNCBIblasttomakecertaintheformationincomponentofneurotoxin.Thetoxincomplexandneurotoxinprep

7、arationwerecarriedoutanoraladministrationtest.Thebulkandfinalbulkfbrthreebatchesofneurotoxinpreparationwereperformedastabilitytest.ResultsThePhysicalpurityofneurotoxinpreparationwasgreaterthan99.00%.TheprofileofSDS-PAGEandCGEshowedasinglebandundernon-reducingcondition,whichwasconfirmedtobeafull作者简介:

8、李小ifi(1983-),女，医学生物学工程师，主要从事细菌毒素的研究工作。通讯作者：张雪平，研究员,E-mail:zhangxp_kneurotoxinwitharelativemolecularweightabout152000andN-terminalaminoacidsequenceasALNDLQINVN.Underreducingconditionneurotoxinwascleavedtotwofragmentsasoneheavychainwitharelativemolecularweightabout101000andN-terminalaminoacidsequenceA

9、LNDLQINVN,andtheotherlightchainwith51000andN-terminalaminoacidsequencePFVNKQFNYK.Inaddition,isoelectricpointforneurotoxinwas4.91.LDS0ofneurotoxinbyoraladministrationwas1.50x10U/kginmouse,whichwas7.9timesthantoxincomplex.Finallypotencyofneurotoxindidnotdeclinewithin28daysstoredat2-8X.withahighspecifi

10、cactivitya-bout2.13x108U/mgproteinwhichwas7.1timesthantoxincomplex,thepotencyforfinalbulkdidnotdeclinewithin28daysstoredat18-26Y.ConclusionTheobtaindneurotoxinhasahighpurity(99%),theresultshowsthatneurotoxinisanintactdi-chainstructureconsistingofonelightchainandoneheavychainlinkedbya(leastonedisulfi

11、debondinnon-reducingcondition,butbecomestwochainsseparatelyinreducingcondition.Thebiologicalactivityofbulkandfinalbulkmaintainsanexcellentstability.Keywords:BotulinumneurotoxinoftypeA(Neurotoxin)；ToxincomplexpreparationfromHallstrain(Toxincomplex);Physicochemicalproperty;BiologicalcharacteristicsA型肉

12、毒毒素(BotulinumneurotoxinoftypeA)是由A型肉毒梭状芽胞杆(Clostridiumbolulinumtype4)产生的，可阻断神经肌肉接头及神经元突触乙酰胆碱的释放，引起人和动物肉毒中毒，致死率极高在自然状态或人工培养基上，A型肉毒神经毒素与血凝素(Hemagglutinin,HA)和非毒素非血凝素蛋白(Non-loxicnon-HA,NTNH)通过非共价键蛆成A型肉毒毒素夏合物2。目前，国内市售的A型肉毒毒素制品均为A型肉毒毒素复合物，注射后,A型肉毒毒素复合物在偏碱性的体液中非共价键被破坏,解离为独立的A型肉毒神经毒素、HA和NTNH分子:A型肉毒神经毒素随血液到

13、达靶位点发挥其作用;HA和NTNH不具有功能性作用，但具有刺激机体免疫系统产生抗体的风险O因此，研发纯化的A型肉毒神经毒素制品是未来应用及发展的趋势。实验对A型肉毒毒素复合物纯化得到的A型肉毒神经毒素进行理化特性分析及生物学特性研究，现将结果报告如下。1材料与方法11毒素A型肉毒毒素夏合物、A型肉毒神经毒素、A型肉毒神经毒素原液(批号：试B-20131201、试B-20140201.试B-20140302)均由兰州生物制品研究所有限责任公司毒素制剂室制备。1.2 实验动物SPF级昆明鼠(以下简称为小鼠)，雌性,26-30日龄，由兰州生物制品研究所有限责任公司实验动物室提供。1.3 主要试剂及仪

14、器聚丙烯酰氨(SDS-PAGE)预制胶购自Invitrogen公司。AKTAPurifier层析系统购自GE公司；Waters高压液相色谱(HighParss-ureLipuidChromatography,HPLC)购自美国Waters公司；GSKG2000SW分子排阻色谱柱购自日本东洋曹达公司;PA800plus毛细管凝胶电泳仪购自Backman公司理化特性1.4.1 纯度采用4%12%SDS-PAGE对A型肉毒神经毒素进行SDS-PAGE电泳，用Bio-RadImageLab3.0软件对凝胶电泳条带进行占比分析；对A型肉毒神经毒素进行HPLC分析，色谱条件:分析柱为G2000SW分子排阻

15、色谱柱，流动相为0.05mol/L磷酸盐缓冲液，流速为0.5mL/min,以4280nm检测A型肉毒神经毒素样品，峰面积计算方法为归化法Q14.2等电点测定将A型肉毒神经毒素样品送中国科学院上海生命科学研究院蛋白质组研究分析中心进行等电点聚焦电泳，测定其等电点。1.4.3相对分子质量测定采用毛细管凝胶电泳(Capillarygelelectrophoresis,CGE)分析A型肉毒神经毒素在非还原条件和还原条件下测定各组分的相对分子质量。14.4N-末端氨基酸测序将A型肉毒毒素复合物及A型肉毒神经毒素样品送中国科学院上海生命科学研究院蛋白质组研究分析中心进行N-末端10个氨基酸序列的测定，将测

16、序结果与NCBIblast数据库中A型肉毒梭菌Hall株氨基酸序列进行比对,确证各组分的成分。1.5生物学特性151口服毒性将A型肉毒毒素复合物与A型肉毒神经毒素分别等比稀释,4只/稀释度，小鼠通过灌胃途径给药，观察96h,记录小鼠的死亡情况，以Reed-Muench法计算其半数动物致死剂量(l&haldose50%,LDW)o1.5.2生物学稳定性采用小鼠腹腔测定法，测定3批A型肉毒神经毒素原液分别在28T保存0、7、14、21、28、35d的毒力。L5.3比活性根据毒力测定结果及蛋白含量计算3批A型肉毒神经毒素原液的比活性。比活性=毒力/蛋白浓度。1.5.4半成品生物学稳定性将3批A型肉毒

17、神经毒素原液加入冻干保护剂分别制成半成品(批号：试20131205、试20140201、试20140302),于18-26幻分别放置0、7、14、21、28、35d,分别测其毒力，测定方法同1.3.2项。2结果2.1理化特性2.1.1纯度SDS.PAGE图谱结果显示,A型肉毒神经毒素在非还原条件下,SDS-PAGE蛋白条带占比为99.03%,见图1；HPLC图谱结果显示，其峰面积占比为99.27%,见图2。即A型肉毒神经毒素纯轻链51000种径毒素152000就。注：l.Marker；2.A型肉毒神经毒素（非还原）;3.A型肉毒神经毒素（还原）。图1A型肉毒神经毒素SDS-PAGE图谱和N-末

18、端测序结果Fig.1SDS-PAGEanalysisandMterminalsequencetestforBotulinumneurotoxintypeA0.0400.0350.0300.0250.0200.0150.0100.005005.0010.0015.0020.0025.0030.0035.00时间（min）图2A型肉毒神经毒素HPLC图谱Fig.2TheHPLCofneurotoxin2.1.2等电点等电点凝胶电泳图谱结果显示,A型肉毒神经毒素的等电点为4.91,见图3。23注：1.PI;2.Marker；3.神经毒素。图3A型肉毒神经毒素等电点聚焦电泳图谱Fig.3TTiepro

19、fileofisoelectricfocusingelectrophoresisofneurotoxin2.1.3相对分子质量非还原条件下A型肉毒神经毒素的相对分子质量为152000左右，见图4；还原条件下呈现有两种组分，分别为重链（约101000）和轻链（约51000）,见图5。0.10rO0.08%12141618202224时间(min)Fig.4TheCGEchromatographyofneurotoxin(non-reducing)图5A型肉毒神经毒素毛细管凝胶电泳图谱(还原)Fig.5TheCGEchromatographyofneurotoxin(reducing)图4A型肉毒

20、神经毒素毛细管凝胶电泳图谱(非还原)214N-末端氨基酸非还原条件下为完整的A型肉毒神经毒素（约152000）,还原条件下裂解为重链（约101000）和轻链（约51000）,见图1。通过与NCBIblast数据库比对，已确证的A型肉毒毒素复合物组分有：A型肉毒神经毒素（152000）,HA70组分（57000J7000J5OOO）,HA33组分（30000.28000）0由于SDS-PAGE图谱上136000与120000条带距离较近，均未检出氨基酸序列，推测其成分分别为NTNH（136000）、NTNH片段（120000）,见图6。910M,注：lane8.A型肉毒毒素复合物(非还原);la

21、ne9,A型肉毒毒素复合物(还原)；lane10.Marker,图6A型肉毒毒素SDS-PAGE图谱和N-末端测序结果Fig.6SDS-PAGEanalysisandN-terminalsequencetestofBotulinumtoxintypeA(complex)口服样品LDw(U/kg)A型肉毒毒素复合物1.90X106A型肉毒神经毒素1.50X107表1A型肉毒毒素在小鼠中的口服毒性研究Tab.1TheoraltoxicityofBotulinumtoxintypeAinmouse图7A型肉毒神经毒素原液毒力趋势图Fig.7Thebiologicalstabilityofneurot

22、oxin(qlu/wae-R*善2.2生物学特性2.2.1 口服毒性A型肉毒神经毒素小鼠的LD为1.50X107U/kg,是A型肉毒毒素复合物ID#的7.9倍，见表1。2.2.2 生物学稳定性3批A型肉毒神经毒素28T放置28d内毒力无下降趋势,波动范围均未超过0天测定值的10%;2935d毒力均呈现下降趋势，见图7。2.2.3比活性3批A型肉毒神经毒素的比活性分别为2.06x108、2.05xIO、2.27x108u/mg,平均值为2.13xl08U/mg,是A型肉毒毒素复合物比活性（平均值3.00X107U/mg）的7.1倍。2.2.4半成品稳定性3批A型肉毒神经毒素半成品（试201312

23、05、试20140201、试20140302）1826乜放置28d内毒力无下降趋势，波动范围均未超过0d测定值的10%,见图8。3Erae-R99%)。相对分子质量测定结果和N-末端氨基酸序列测定结果均与Inoue等的报道一致。对A型肉毒神经毒素各项理化特性分析结果确证，A型肉毒神经毒素(152000)由轻链(51000)和重链(101000)至少通过一个二硫键连接。等电点为4.91；经口服A型肉毒神经毒素的小鼠LD*为1.50xIO,U/kg,是其复合物的7.9倍，其原因是A型肉毒毒素复合物中的非毒性蛋白可保护神经毒素免受消化系统低pH以及消化酶的降解，HA70和HA33上具有多个糖类结合位

24、点，使复合物通过与糖类的多价连接，在小肠细胞表面富集复合物分子，从而增加其吸收凶。A型肉毒神经毒素在28T放置28d,半成品在18-26T放置28d,生物学活性均无下降，表明其具有良好的稳定性，其结构是否发生变化尚待进一步研究。A型肉毒神经毒素比活性可达到2.13X108U/mg,远高于欧洲药典(8.0)的规定(1.0x108U/mg),是复合物比活性的7.1倍。20092015年生产的A型肉毒神经毒素比活性平均值为1.92xU/mg(0.98x2.86xU/mg)，推算出100U/瓶神经毒素制品的活性药用成分(Activepharmaceuticalingredient,API)平均含量为0

25、.52ng,50U/瓶神经毒素制品的API平均含量为0.26ng。与在售制品注射用A型肉毒毒素(衡力)相比,蛋白载量进一步降低，使抗体产生的概率下降。综上所述，纯化得到的A型肉毒神经毒素纯度和比活性高,成品和半成品的稳定性好。A型肉毒毒素具有广泛的应用前景,不仅在医学美容方面,随着在各种肌张力障碍、手足多汗症、疼痛等领域的临床应用,A型肉毒神经毒素作为一种新的产品，将逐步替代A型肉毒毒素复合物。实验分析了A型肉毒神经毒素的理化及生物学特性，为A型肉毒神经毒素制品的研制提供了有力的依据。参考文献王萌椿，汤晓芙.肉毒毒素临床治疗手册M.北京:人民卫生出版社,2005：9-12.1 何星，苗承辉,李小蛆，等.注射用A型肉毒毒素的生物学特性及质量分析JL生物制品学杂志,2012,25(11):1488-1491,1497.2 李小娟，张若晖，周易，等.不同pH和温度对A型肉毒毒素结构及活性的作用J.微生物学免疫学进展,2015,43(5):23-26.3 KukrejaR,ChangTW,CaiS,elal.Inununologicalcharacterizationofthesubunitsoftyp