FBLN-1在2型糖尿病患者牙槽骨骨髓间充质干细胞中的表达.docx

1、FBLN-1在2型糖尿病患者牙槽骨骨髓间充质干细胞中的表达贾磊梁超李钧【摘要】目的了解腓骨蛋白1(FBLN-1)在2型糖尿病患者牙槽骨骨髓间充质干细胞(BVSCs)中的表达及其对骨髓间充质干细胞的生物学行为影响。方法原代培养口腔种植患者的牙槽骨BMSCs,分为3组：种植成功的糖尿病患者(ttbS组)、种植失败的糖尿病患者(DM-F组)以及非糖尿病种植成功患者(Nor组)。MTT法比较3组细胞增殖能力的差异：划痕实验观察细胞的迁移能力：碱性磷酸酶实验测定3组细胞的细胞活性差异：Western-blot检测FBLN-1在3组BMSCs中的表达差异。结果BMSCs增殖能力，Nor组明显优于DM-S组

2、和DM-F组(P<0.05),但DM-S组和DM-F组无统计学差异：6h细胞迁移能力测定，发现Nor组BMSCs迁移距离明显大于DM-S组(P<0.05),DM-S组BMSCS迁移距离明显大于DM-F组BMSCs(P<005)：在各时间点检测的ALP活性，Nor组BMSCs最高(P<0.05),DM-S组BMSCs次之(P<005),DM-F组BMSCs最低(P<0.05)；FBLN-1表达，与Nor组相比DM-S组和DM-F两组均显著下调(PC0.05)，且与DM-S组相比，DM-F组进一步下调(P<0.05)o结论与非糖尿病患者相比，糖尿病患者牙槽

3、突BMSCs中FBLN-I的表达显著下调。糖尿病种植失败患者的FBLN-1明显低于糖尿病成功患者，表明FBLN-1在种植体愈合过程中可能起重要作用。【关键词】骨髓间充质干细胞：糖尿病：种植：FBLN-1【中图号】R7802【文献标识码】A【文章编号】1006-673X(202"04-0228-04ExpressionofFBIN-iinalveolarbonemarrowmesenchymalstemcellsintype2diabeticpatientsJIALei,LIANGChao,L!Jun.DepartmentofDentalImplantCenter.BeijingSto

4、matologicalIiospital.CapitalMedicalUniversity,Beijing100()50,ChinaAbstractObjectiveToinvestigatetheexpressionofFBLN-iinalveolarbonemarrowmesenchymalstemcellsoftype2diabeticpatients.MethodsBonemarrowstemcells(BMSCs)wereharvestedfrompatientsreceivingdentalimplantaiion.Thethreegroupsweresuccessfullyimp

5、lanteddiabeticpatients(groupone),failedcases(groupiwo),andsuccessfullyimplantednon-diabeticpatients(groupthree).Thegrowthcurveofthethreegroupsofce11swasmeasuredbyMTTmethod,themigrationabilityofthecellswasobservedbythescratchtest.TheexpressionofFBLN-1inthethreegroupsofBMSCswasdetectedbyWestern-blot,a

6、ndtheactivityofalkalinephosphatase(ALP)wasdetectedinthethreegroups.ResultsThereweresignificantdifferencesincellproliferationability,migrationabilityandALPactivityamongthethreegroups(P<0.05).Inaddition,theexpressionlevelofFBLNIingroupiwowassignificantlylowerthanlhaiingroupone.ConclusionsTheexpress

7、ionofFBLN-1inthealveolarbonemarrowmesenchymalstemce11softype2diabeticpatientswithfailedimplantationdecreased,indicatingthatfbln-|mayplayanimportantroleintheprocessofimplanthealing.KeywordsBonemarrowstemcells:Diabetes:Dentalimplantation;FBLN-12型糖尿病是以血浆葡萄糖水平增高为特征的常见代谢紊乱疾病，高糖的体内环境是引发和加重牙周病的重要因素，而牙周病是现阶

8、段造成牙齿缺失的主要因素，临床上，牙列缺损或缺失的2型糖尿病患者种植修复的需求日益增R，但2型糖尿病是种植手术的相对禁忌症，严重影响种植成功率，但机制尚不明确,b料枇体桩入矛精”初虬"彼充洒料'机体叩胴竹可充质干细血<bo<ie基金项目：国家自然科学基金(81371115)作者单位：100050北京首都医科大学口腔医学院种植科通讯作者：李钧，E-mail:lijun3O21,电话arrowmesenchymalstemcells,BMSCs),迁移至间隙，并黏附在植体表面，启动后续细胞增殖及成骨向分化功能，并逐渐形成最终的骨结合If此牙

9、fflftBMSCs在神桩体-什岱合过程中关键作用.本课的徂前阴条口1学降完发现，WfisnI(Fibulin-1.FBLN-1)可能在糖尿病患者的BMSCs中有异常的表达。FBLN-1又称腓骨蛋白3"现的文冗大多生中在村籍方而：4«5】也角册咒表明FBLN在炮性软竹成骨过程中扮演爪要角色.XtKtt形成及背眩蛛员白的形寇fi正向生物孕功能.flttFW.N-I在牙带笑BMSCs中醇武行点及其与糖尿病的关系尚不清楚。本研究拟在了解患者牙槽骨BMSCs中FBLN-1表达的特点及其对BMSCs的生物学特性的可能影响。材料和方法1. 主要试剂和材料-MEM条件培养基，青-链霉素、

10、磷酸盐缓冲液（PBS）、胰蛋白酶（Gibco,美国）；MTT细胞增殖试剂盒、ALP活性测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，中国）；TrizolReagent（LifeTechnologies,美国）:Trizol试剂（Invitrogen,美国）。分离培养种植患者的骨髓间充质干细胞，包括3类患者:种植成功的糖尿病患者（DV-S组）、种植失败的糖尿病患者（DM-F组）以及种植成功的非糖尿病患者（Nor组）。研究已经通过首都医科大学附属北京口腔医院伦理委员会的审核（批号：CMUSH-IRB-KJ-PJ-2018-08）。2. 研究方法BMSCs细胞复苏:-80笆冰箱取出3组BMSCs冻存管，立即投

11、入37°C水浴中，轻轻摇动进行解冻,然后取出冻存管，酒精消毒后开启，将细胞悬液吸至离心管中，加入10倍以上的培养基，1000r/min离心6min。弃上清，a-MEM条件培养基重悬，接种培养皿，37°C、5%C（h孵箱培养。MTT法细胞生长曲线测定：接种细胞：取第4代BMSCs,调整细胞密度为lX10'/ml,分别接种于96孔板（设4个复孔），每孔体积200pl；培养细胞：37°C、5%C0?孵箱培养，培养10天（2、4、6、8、10、12天为测量时间段）；呈色：伽ytlMTT溶液（5mg/ml）20pl继续孵育4h,终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔

12、加150EDMSO,振荡10min,使结晶物充分融解；比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，绘制细胞生长曲线。划痕实验：用记号笔在6孔板背后作垂直横线，每间隔1cm一道，横穿过孔。每孔穿过5条线：在孔中加入5X105个细胞，完全培养基培养过夜；第2天，使用枪头垂直于背后的横线划痕，枪头不能倾斜：PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基；放入37*C5%C02培养箱培养；按0、6、12、24h时间点取样，拍照。使用Image-ProPlus6.0J软件打开图片后,标记划痕区域，迁移距离=划痕区面积/划痕区的长度。BMSCs碱性磷酸酶活性测定：第4代细胞

13、长满80%时，胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，以1X1。'个/孔接种于96孔板内，加入适量的a-MEM条件培养基，培养3、5、7、10、12天，测定细胞碱性磷酸酶（ALP）的活性。每组设6个复孔，先收集上清液，按ALP活性测定试剂盒的操作方法进行ALP活性测定，用金氏单位/ml表示。实时荧光定量PCR（real-timeRT-RP）:使用Trizol试剂提取第4代BMSCs总RNA,按照逆转录试剂盒PrimeScriptRTipfigentKitwithgDNAEraser（TaKaRa）说明书步骤将总RXA反转录合成cDNA,FBIN1引物预先设计合成（SarnBiotech）,随后应用

14、SYBRPremixExTaqII试剂盒（TaKaRa）进行实时荧光定量PCR检测。以GAPDH作为内参照，应用2*法进行分析。引物序列为：1BLN-I:F:AGAGCTGCGAGTACAGCCT；R:OGACATCCAAATCTCCGGTCT；GAH1I:F:AGAA（；GCTGGGGCTCATTTG；R:AaiGOTATOCACAGTCTTC。Western-blot验证FBLNT及相关蛋白在3组BMSCs中的表达差异：分别取第4代DM-F组、DM-S组及Nor组BMSCs,进行蛋白提取并用BCA试剂盒进行蛋白定量。根据日的蛋白的分子量配制10%分离胶，浓缩胶浓度为5%,加入电泳缓冲液，按

15、顺序加样，每孔加入20|ig总蛋白样品，电泳条件：浓缩胶恒压80V,20min,分离胶恒压120V,电泳至溟酚蓝到凝胶底部。转膜方法为湿转，转膜条件：按照电流300mA恒流转膜，PVDF膜选用0.45pm孔径；将膜浸没在5%脱脂奶粉（TBST溶解pH=7.5）中室温轻摇2h（封闭液须覆盖整张膜，且膜在其中能够摇动为宜）。加入按比例稀释的一抗,4°C孵育过夜。TBST洗膜后，经辣根过氧化物酶标记的二抗孵育50min，再次洗膜。8cmX6cmPVDF膜使用1mlECL（500plA液+500plB液）反应3min,曝光1min,显影2min,定影。1统计学处理采用SPSS17.0统计软件

16、进行统计分析。定量数据符合正态分布的采用均数土标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用F检验；不符合正粉布的耕中位数标组间比+1秩和检验。只0.05为差异有统计学意义。结果I.BMSCs培养及增殖情况经过复苏培养，Nor组BMSCs生长情况明显优于DM-S组BMSCs或DM-F组BMSCs,表现为后两者BMSCs体积瘦小、成长缓慢（图1）,Nor组DM-S组BMSCs但无统计学差BMSCs增殖能力最佳（P<0.05）,增殖能力略优于DM-F组BMSCs,均高于同期的DM-S组和DM-F组BMSCs,而DTS高于DM-F:且同一组细胞在3、5、7、1（）天的活性也在逐渐增加，均有统

17、计学意义（P<0.05）图I第3代BMSCs培养光说照片A:组：B：DM-S组；C：Nbr组4.Western-blot验证FBLNr及相关蛋白在3组BMSCs中的表达差异三组细胞之间FBLN-I的mRNA表达存在显著差异，DM-F组BMSCs的FBI.N-1蛋白表达水平显著低于另外两组（图5）。图3三组BMSCs迂移能力A:Nor组；B：DMS组：C：DM-F组注：*:P<0.05图2三组BMSCs12大增殖培养曲线1BMSCs迁移能力通过划痕实验进行细胞迁移能力测定，发现6h后Nor组BMSCs迁移距离大于DM-S组和DM-F组BMSCs,而DM-S组BMSCs迁移距离大于DM

18、-F组（图3）。3. ALP活性测定结果Nor组BMSCs碱性磷酸酶活性在不同时期表1三组细胞不同时间ALP活性（Y土s金氏单位100ml）时间例数NorDM-SDM-F3 天6072±015sO53±O10*0.38+0.08讨论临床发现糖尿病患者牙周炎发生率显著高于正常人，缺牙率较高，这些因素导致需要进行牙齿种植修复的患者人数明显增加枷由M代谢"冲，邮.域成芯邮分思者衿枇矣败率故耳.科机体愈合过印中牙棉什邮&起知8作用.UEHHt为1匕仃关噬即i人的ram；的研觉大多采用在人r隔培船眺血E常畋，捌膈I灿也Aiwscs泄行的册光辞见.实蝌果更岫1味俏况1

19、（,1.FBLN-I属于Fibulin家族，该家族分布广泛，是一类细胞外基质，主要参与调控细胞生长、黏附、细胞迁移和细胞凋亡等过程，参与维持细胞结构和形态'气现有的文献大多集中在肿瘤方面。Hang等&研究表明FBLN1显著增强鼻甲来源间充质干细胞（hTMSCs）粘附活性与hTMSCs的增殖，细胞的碱性磷酸酶活性和矿化活性显著提高，这表明FBLN1可能诱导hTMSCs分化为成骨细胞。Cooley等®研究发现，FBLN-I缺陷的小鼠颅骨茜素红染色显示，在额叶和顶叶间两种膜质骨和软骨内骨矿化降低。同时，在FBLN-1缺失的额骨中显示出16%的骨量减少，FBLN-I可能是骨形

20、成和BMP-2介导诱导所必需的细胞外基质。并旦是一种新的膜性骨和软骨内形成的正调控因子。以往对骨组织中的FBLN-1因子研究很少，本实验通过分离培养糖尿病和正常骨组织中BMSCs,并将各组中的FBLN-1表达量做对比,同时观察糖尿病患者BMSCs的增殖，迁移和成骨向分化的能注：*：PV0.05图4三组细胞在培养不同时间点的ALP活性比较1.5-1图5Western-blot验证FBLN-1及相关蛋白的表达A:三组细胞中FBLN-1的mRNA表达量：B:Western-blot结果与PCR结果对应力，分析表明种植成功的糖尿患者BMSCs增殖能力略强于种植失败的糖尿病患者，但无统计学差异；不过，前

21、者迁移能力优于后者，且而者的ALP活性在各时间点均高于后者，碱性磷酸酶是成骨细胞早期分化的关键且经典指标，在7天内的表达最为显著，结果提示Nor组的成骨潜力更好。PCR及Westernblot实验显示，FBLN-1的mRNA表达量在Nor组和DM-S组明显高于DM-F组，且有统计学意义，PCR的结果和Wcstornblot结果相对应。提示FBLN-1在三组细胞中表达的差异可能与糖尿病相关，并且可能与BMSCs增殖、迁移以及成骨分化能力相关。也有研究认为城珀酸酯及其G-蛋白偶联受体信号转导途径与BMSCs破骨能力有关倾啪虹残酸酒邦的中网代咽产物该研亢发现.(T2型朋尊娴帜型小队的BIKCs!&g

22、t;.的表达水平与正常小鼠比较增加2.4倍，进一步研究发现琥珀酸酯可以与G-蛋白偶联受体结合刺激破骨作用，而抑制该信号转导途径，可减轻破骨作用伸本研充显示FBLN-1在不同实验组的BMSCs中表达水平不同，并且不同实验组BMSCs的增殖，迁移和成骨向分化能力存在明显差异，FBLN-I是否参与上述信号通路有待进一步的深入研充。与高糖诱导模型相比，本研究使用糖尿病患者的牙槽突BMSCs进行研究八底5力的牙带夹BMSCs的伤况.为今后研究提供可靠信息。本研究表明，FBLN-1在糖尿病患者的牙槽突BMSCs中表达异常，且与种植体愈合成功与否密切相关，可能是今后研究糖尿病种植体-骨结合的重要方向。参考文

23、献1 MoraschiniV,BarbozaES,PeixotoGA.Theimpactofdiabetesondentalimplantfailure:asystematicreviewandBeta-analysis.IntJOralMaxillofacSur2OI645)WH23712452 Zeev0,Jona(hanB,ShloaoM,etal.Theeffectofmoderatelycontrolledtype2diabetesondentalimplantsurvivalandperi-inplantboneloss:along-termretrospectivestudy.I

24、ntJOralMaxillofacInplants,?0U8332389394MatteiMG.PanTC,ZhangRZ,etal.ThefibulinFgene(FBLNOislocatedonhumanchromosom22andonmousechromosome!5.Genomics,1994222-43.7438UzzamanA,ZhangX,QiaoZ,etal.Discoveryofsmallextracellularvesicleproteinsfronhunanserumforlivercirrhosisandlivercancer.Biochimic2Q2Q177.1321413 llarikrishna