H3N8型马流感血凝素核酸疫苗的初步研究.docx

1、DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.03.007H3N8型马流感血凝素核酸疫苗的初步研究许莹*,郭巍,王世霞，黄文强，张璐,卢山，周建华，相文华，黄祖瑚【摘要】目的研发一种具有良好免疫原性的H3N8型马流感血凝素(hemagglutinin,HA)核酸疫苗。方法根据马A型流感病毒A/Equine/Xinjiang/3/08(H3N8)的HA蛋白序列，经密码子优化后化学合成能够表达相应蛋白的基因片段，并将该片段克隆到核酸疫苗载体PJW4303中，构建带有天然信号肽的H3HA核酸疫苗，命名为H3HA/XJ308-wt；进一步对HA基因进行修饰，以人组织纤维

2、蛋白酶原激活剂(humantissueplasminogenactivator,tPA)取代H3HA天然信号肽，命名为H3HA/XJ3-08-IPA,或切除部分HA的基因片段使之只表达HA蛋白的胞外域，命名为H3HA/XJ3-08-dTMo用这3种重组质粒分别转染293T细胞，蛋白表达经蛋白质印迹检测得到确认。来用电转录法免疫新西兰白兔。ELISA方法检测免疫后兔血清中抗H3HA抗体滴度，血凝抑制实验(hemagglutinationinhibition,HI)检测保护性抗体水平。结果3种H3HA核酸疫苗均可在293T细胞中高效表达，并能够在新西兰白兔体内诱导产生特异性抗H3HA抗体，HI检测

3、到不同水平的保护性抗体。其中以H3HA/XJ3-08-tPA的免疫原性最强。结论新构建的H3N8型马流感血凝素核酸疫苗具有良好的免疫原性，为此类疫苗的进一步研发奠定了基础。【关疑词】流感病毒A型，H3N8亚型：血凝素类：疫苗，DNAwh中国医药生物技术,2010,5(3):196-201近年来，A型流感在不同物种中广泛流行，如高致病性禽流感H5N1、新型猪来源H1N1流感等。A型流感同样在马属动物中频繁爆发。国际上根据流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)的不同，将HA分成了16个亚型，NA分成9个亚型。其中马流感病毒包括H7N7和H

4、3N8亚型。近30年来，H7N7型马流感病毒未再分离到，而H3N8型马流感在世界范围内常有爆发，提示现有疫苗还不能有效地控制该病毒的流行山气血凝素分子是流感病毒的主要保护性抗原。研究表明，动物接种流感病毒血凝素DNA疫苗后，中和抗体效价很高，并对致死剂量流感病毒攻击的小鼠有完全保护作用同。本研究根据马A型流感病毒Aquine/Xinjiang/3/08(H3N8)的HA氨基酸序列，设计并人工合成了能够表达相应蛋白质的基因片段，构建了三种经密码子优化的核酸疫苗，并研究了其免疫原性。本实验为H3N8型马流感疫苗的进一步开发研究奠定了良好的基础。1材料和方法1.1材料1.1.1试剂A/Equine/

5、Xinjiang/3/08的HA基因序列信息由哈尔滨兽医研究所马病研究室提供；H3HA基因序列经密码子优化后人工合成，由德国Geneart公司完成：核酸疫苗载体pJW4303及293T细胞由美国马萨诸塞州大学医学院提供：HB101由本实验室保存；限制性内切酶BamHKPstKNhel及连接酶购自美国Promega公司；HRP标记的羊抗兔抗血清购自联科生物技术有限公司；质粒大量提取试剂盒购自德国Qiagen公司；质粒小量提取试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；TMB片剂购自美国Sigma公司；Westpico购自美国Pierce公司。1.1.2实验仪器水平电泳仪为北京东方特力公司产品；凝胶图象分析

6、系统为美国Pharmacia公司基金项目：黑龙江省自然科学基金改点项目(ZD200812；罟医生物技术国家重点实验室基本科研业务费项目(NKLVBP200815)；江苏省自然科学基金(BK2006728)作者单位：210029南京医科大学第附隔医院感染耕科Tit苏省人民医院中美疫苗中心(许莹、王世霞、张现、卢山、黄祖瑚)；150001哈尔滨，中国农业科学院哈尔滨售医研究所曾医生物技术国家重点实乾室大动物病研究室(郭说、黄文强、周建华、相文华)；01605涯斯特，美国麻省大学医学院内科学系(王世霞、卢山)通讯作者：相文华，xiangwcnhual；黄祖瑚，Email：huangzh收稿日期：2O

7、1O-O1-18第一、二作者同等贡献产品；U-2001型紫外可见分光光度计为日本Hitach公司产品；Model680型酶标比色仪、聚丙烯酰胺凝胶电泳仪均为美国Bio-Rad公司产品；WJ-2002活体基因导入仪为宁波新芝生物科技股份有限公司产品。1.1.3实验动物新西兰白兔，雌性，体重3kg,由上海斯莱克试验动物有限责任公司提供。1.1.4测序公司上海英骏生物技术有限公司。1.2方法1.2.1H3HA核酸疫苗的构建及鉴定根据马A型流感病毒A/Equine/Xinjiang/3/08的基因序列，经密码子优化后人工合成相应的基因片段。虽然密码子优化后的HA基因序列不同于天然HA基因，但其编码的H

8、A蛋白质氨基酸序列不变。在基因片段两端分别引入PstI和BamHl酶切位点，将经此位点双酶切所得的基因片段克隆到核酸疫苗载体pJW4303中，构建了含天然信号肽的H3HA核酸疫苗,命名为H3HA/XJ3-08-wt：进一步对HA基因进行修饰，以人组织纤维蛋白酶原激活剂（humantissueplasminogenactivator,tPA）取代H3-XJ天然信号肽或切除部分HA基因片段使之只表达HA蛋白的胞外域，并在其两端分别引入Nhel和BamHl酶切位点，将经此双酶切所得的基因片段克隆到核酸疫苗载体PJW4303中，得到另外两种表达H3HA蛋白的核酸疫苗，分别命名为H3HA/XJ3-08t

9、PA和H3HA/XJ3.08-dTM（图1）。构建的上述核酸疫苗均经过限制性内切酶酶切和测序鉴定。核酸疫苗以及空载体质粒pJW4303分别转化大肠杆菌HB101,经大量扩增后，提取制备高纯度质粒，用生理盐水稀释成1姒囚，-20°C保存备用。118532567H3-HA.wtlZE_.AB_JH3-HA1PA二ZZZ二:二二二.HH二!H3-HA.dTM.口血凝塑分子天然信号肽HAnaturalleadersequence血凝塑分子跨膜区HAtransmenbranedomain人组织纤维蛋白陂原激活剂信号肽tPAleadersequence图1H3HA核酸疫苗的设计Figure1Th

10、edesignofH3HADNAvaccines1.2.2马流感H3HA核酸疫苗的体外表达及检测将以上构建好的核酸疫苗以及空载体pJW4303分别用PEI（polyethylenimine）法转染293T细胞，转染后72h收集培养上清和细胞裂解液。用Westernblot法检测马流感HA抗原，观察核酸疫苗在真核细胞内表达以及向细胞外分泌的情况。具体步骤如下：灌制10%SDS-PAGE电泳胶；取培养上清和细胞裂解液各20分别加入5pl的上样Buffer,煮沸5min后上样，电泳：转膜，100V,1h；封闭，5%脱脂奶粉，4°C过夜；1%脱脂奶粉1:500稀释H3HA/XJ3-08-tP

11、A核酸疫苗的兔免疫血清，室温摇床上慢摇孵育1h；PBST漂洗滤膜6次，每次10min；1%脱脂奶粉1:5000稀释HRP标记的羊抗兔IgG抗血清，室温摇床上慢摇孵育1h；PBST漂洗滤膜6次，每次10min；显影以及定影后观察结果。1.2.3动物实验通过活体基因导入仪进行DNA免疫。12只3kg新西兰白兔随机平均分成4组，分别接受空载体质粒pJW4303、核酸疫苗H3HA/XJ3-08-wt、H3HA/XJ3-08-tPA或H3HA/XJ3-08-dTM免疫，程序为0、2、4、8周各一次，每次每兔四点注射共200gg质粒DNA（图2）o注射后立即于注射部位用WJ-2002活体基因导入仪进行体内

12、电转染（技术参数：电压100V,脉冲次数正反各6次，波宽60ms,频率60Hz）,兔腿部肌肉发生抖动视为电转录有效。首次免疫前以及每次免疫后2周耳中动脉采血10ml,分离血清，-70°C保存备用。组别GroupsAB核酸疫苗DNAvaccinesH3-HA.wtH3-HA.IPACH3-HA.dTMDpJW4303空栽体核酸免疫和血清采集时间表Scheduleforimmunizationandbloodcollecting&十*核酸免疫|Vaccinesimmunizating0246810周weeksAAAAAA血清采集Bloodcollecting图2实验动物的分组及H

13、3HA核酸疫苗免疫程序Figure2RabbitsgroupingandImmunizationscheduleforH3HADNAvaccines1.2.4马流感H3HA核酸疫苗抗体应答的检测采用酶联免疫吸附试验（ELISA）间接法检测抗马流感H3HA抗体"°）。具体步骤如下：包被抗原：H3HA/XJ3-O8-dTM转染293T细胞收获的上清，用1xPBS按照1:5稀释作为抗原包被ELISA板，100"孔，4°C过夜；PBST洗3次，5%脱脂奶粉封闭，200叫/孔，37°C,2h；PBST洗3次，加入1%脱脂奶粉1:500稀释的待检血清，10

14、0叫孔，37°C,1h；PBST洗5次，加入1%脱脂奶粉1：2000稀释的生物素标记的羊抗兔IgG；100"孔；37C,1h：PBST洗5次，加入1%脱脂奶粉1:5000稀释的HRP标记的链亲和素，100pl/孔；37°C,1h；PBST洗5次，TMB显色，100pl/孔，3.5min。最后用酶标仪检测吸光度值。1.2.5血凝抑制试验（HD血清处理方法：采用胰蛋白酶-高碘酸盐处理方法，具体如F：加入1/2体积的胰蛋白酶溶液于1体积的血清中，56C灭活30min后取出并冷却至室温。加3体积的O.llmol/L过碘酸钾，混匀，室温孵育15min,其后加3体积的1%甘油

15、溶液，室温孵育15min。最后加2.5倍体积的0.85%生理盐水并混匀。该处理后血清的终稀释度为l：10o胰蛋白酶溶液：将200mg的胰酶溶于25ml0.1mol/LpH8.2的lxPBS中，过滤除菌后小量分装，-20C保存。采用血凝抑制实验检测实验动物中HI抗体水平。具体步骤如下：标记96孔微量板，每孔加25Hl1xPBS；第一行每孔加25gl待测血清，混匀（1:2）,最后一孔不加作为对照；吸取第一孔中血清25讯到下一孔，混匀，依次进行倍比稀释（1:4）,以此类推到其他孔，弃掉最后一孔中吸取的25叫液体；每孔加上25叫的4单位标准化抗原，22°C孵育30min：每孔加入50gl标准

16、化红细胞，如前混匀，22#C孵育30min；判定并记录结果。阴性对照为免疫前的混合血清。2结果2.1马流感H3HA核酸疫苗的构建及表达将构建好的质粒测序，结果显示其核酸序列与本研究原先设计的核酸序列完全一致。将H3HA-wt、H3HA-tPA、H3HA-dTM转染293T细胞72h后，获取细胞培养上清和细胞裂解液，以H3HA-IPA的免疫兔血清行Westernblot检测。结果显示，所设计的密码子优化后的血凝素基因均有目的蛋白的表达（约72kD）0其中H3HA-dTM在上清中也能检测到蛋白的表达（约90kD）,而空载体PJW4303转染后，细胞培养上清及裂解液中均检测不到H3HA蛋白的表达，如

17、图3所示。提示H3HA-wt、H3HA-tPA、H3HA-JTM转染293T细胞后均可在细胞内表达，H3HA-dTM还可以将表达产物分泌到细胞外。2.2马流感H3HA核酸疫苗的抗体应答用构建好的马流感H3HA核酸疫苗免疫新H3血凝素DNA疫苗H3HADNAvaccinesVectorHA,wtHA.dTMkDSLSLSLSS：细胞上清；L：细胞裂解S:Cellsupernatant;L:Celllysate图3三种核酸疫苗在293T细胞中的表达Figure3TransientexpressionofDNAvaccinesin293TcelllineTimeofbloodcollectionat

18、weeks0、2、4、6、8、10,arrowsindicatingtimeofimmunizations图4各组新西兰白兔免疫血清抗H3HA抗体水平的动态变化Figure4Temporalchangesofserumanti-H3HAIgGindifferentrabbitgroups西兰白兔。结果表明：第2次免疫后2周，三组核酸疫苗免疫的动物血清中均可检测到特异性抗H3HA抗体；第3次免疫后2周，特异性抗H3HA抗体水平明显升高。随着免疫次数的增加，H3-tPA免疫血清特异性抗体水平上升的速度最快，显著高于H3HA-wt和H3HA-dTM免疫组（F<0.01）o而H3HA-W1和H3

19、HA-dTM两组免疫血清，特异性抗体水平上升情况无明显差异。阴性对照组无抗体反应（图4）。第4次免疫后2周，三组免疫动物血清中特异性抗H3HA抗体的平均滴度分别为：H3HA-tPA组：1:56300；H3HA-wt组：1:13500；H3HA-dTM组：1:6500（图5）。2.3免疫动物血清HI抗体的检测血凝抑制试验结果显示：第4次免疫后2周，各组新西兰白兔均产生了HI抗体，其中H3HA-tPA组血凝抑制效价最高，达到1:320；H3HA-wt组次之，平均血凝抑制效价为1:90；H3HA-dTM组血凝抑制效价最低，只有1:16。免疫前血清血凝抑制效价小于1：8（图6）o1：8（图6）o100

20、（XX）80000600004000020000°H3-HA.wtH3-HA.tPAH3-HA.dTMVector核酸疫苗免疫血清Immunizationsera图5各组新西兰白兔免疫血清抗H3HA抗体的终点滴度Figure5Scrumend-pointanti-H3HAIgGtitersindifferentrabbitgroups图6各组新西兰白兔免疫前后血清HI水平Figure6SerumHItitersindifferentrabbitgroups3讨论在很多物种中都已经证明，运用DNA疫苗免疫可以诱导较强的特异性免疫保护反应。DNA疫苗因其能够同时激起机体的体液以及细胞免疫

21、而优于传统的灭活疫苗，加上其生产成本低廉、可规模生产、易于保存而具有广泛的市场前景UM2,o到目前为止，已经有4种运用于动物的DNA疫苗取得上市许可，分别为运用亍马的西尼罗病毒DNA疫苗、运用于酷鱼的传染性造血组织坏死病DNA疫苗、运用于狗的黑色素瘤DNA疫苗和降低幼猪致病率及致死率的生长激素释放激素DNA疫制5。我国的马流感疫苗研究工作相对迟滞。20世纪70年代研制成马流感灭活疫苗，目前国内未见有新疫苗的开发研究。国际上对于H3N8马流感疫苗已经进行较为深入的研究，也包括DNA疫苗。Soboll等以马流感病毒A/equine/Kentuchy/1/81的血凝素基因片段为依据，构建了马流感HA

22、核酸疫苗，以基因枪免疫马，共免疫3次，多位点注射，间隔60d一次。免疫结束后的同型流感病毒攻毒试验表明，疫苗的保护效果较好1，5'16,0证明了HA核酸疫苗在抗马H3N8流感方面的成功运用。在此基础上，我们对H3HA基因序列进行了优化和修改，设计了3种表达H3HA抗原的核酸疫苗。其中以tPA组的效果最理想。说明在插入完整H3HA基因的情况F,以tPA信号肽取代原始信号肽后，核酸疫苗在体外的表达增强，免疫原性增强。一般认为血凝抑制效价大于64即可产生临床保护I。据此标准，tPA组及wt组免疫后产生了具有保护作用的中和抗体，而dTM组尽管产生了一定的结合抗体，但未产生中和抗体。在既往H1H

23、A流感DNA疫苗的研究过程中也曾发现：完整的H1HA产生中和抗体的能力远远大于去掉跨膜区的H1HA,8,o可能是去掉跨膜区及胞内区基因的马H3HA核酸疫苗在表达成HA抗原的过程中分子构象发生改变，或关键抗原表位隐藏、消失或改变，免疫原性降低，不能产生中和抗体。流感疫苗最大的问题是流感血凝素通过抗原漂移和抗原转换发生频繁的变异，这对于研发广泛适用性的HA疫苗增加了难度。香港1992年爆发马流感过程中，有75%的免疫马不能抵抗感染，英国和意大利等也有过类似报道"4。可见由于病毒的变异，原有疫苗往往不能提供良好的保护力：对于不同谱系的毒株，单价疫苗只能提供有限的保护”9)。解决的方法包括：

24、根据流行的毒株不断更新现有疫苗；制成多价疫苗等。Kodihalli等I?仞发现，在HA1亚型氨基酸序列同源性有11%13%差异的变异株致死剂量攻击时，HADNA疫苗仍然具有交叉保护性作用。故如采用不同来源的HA基因制成二价或多价疫苗，可能其免疫后产生的交又保护性更强，所针对的流感毒株范围更广，效果更好。在后续工作中，我们将着重研究不同毒株HA基因制成的多价DNA疫苗，期望研制开发出具有较强免疫原性、能够对多种毒株感染产生确切保护的抗H3N8型马流感核酸疫苗。参考文献1PaillotR,HannantD,KyddJH,elal.Vaccinationagainstequineinfluenza:

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35、LUShan,ZHOUJian-hua,XIANGWen-hua,HUANGZu-huAbstractObjectivelbdevelopahiglyimmunogenicDNAvaccineagainstequineinfluenzaH3N8.MethodsAccordingtotheaminoacidssequenceofHAantigenfromequineinfluenzaAstrainA/Equine/Xinjiang/3/08(H3N8),acodonoptimizedH3HAgeneswaschemicallysynthesized.Itwasthensubclonedintov

36、ectorpJW4303toexpressthewildtypeHAinsert(H3HA/XJ3-08-wt).ThecodonoptimizedHAgenewasfurthermodifiedtoeitherreplacetheoriginalHAleadersequencewithahumantissueplasminogenactivator(tPA)leader(H3HA/XJ3-O8-tPA)ortruncatetheHAcodingsequencetoexpressonlytheextracellularportionoftheHAprotein(H3HA/XJ3-O8-dTM)

37、.TheexpressionoftheabovethreeHADNAvaccineswasverifiedin293TcellsbyWesternblotanalysis.NewZealandWhiterabbitswerevaccinatedwiththreeversionsofHADNAvaccinesorvectorindividuallybyelectroporation.H3HAspecificantibodyresponsesinrabbitserawereanalyzedbyELISAandtheprotectiveantibodyactivitiesweremeasuredby

38、HIagainstequineH3N8vims.ResultsTheH3HADNAplasmidscouldexpressHAantigensuccessfullyin293Tcellsinvitro,andinducedhighlevelprotectiveanti-H3HAantibody.AmongthreeH3HADNAvaccines,HADNAvaccinedesignwithatPAleadershowedthebestimmunogenicity.ConclusionOptimalHADNAvaccinesagainstH3N8equineinfluenzahavebeensuccessfullyconstructed,affordinganewwaytodevelopequineH3N8vaccineinthefuture.【KeywordsInfluenzaAvirus,H3N8subtype;Hemagglutinins;Vaccines,DNAAuthorAffiliations:DepartmentofInf