产气荚膜梭菌ε毒素及其疫苗研究进展.docx

1、产气荚膜梭毒素及其疫苗研究进展王光华】，黄生莲2,周继章1,邱昌庆（1.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃兰州730046,2.青海省大通县朔北兽医站，青海大通810100）摘要：产气荚膜梭菌病是由产气英膜梭菌引起的一种重要的人善共患传染病，可导致山羊、绵羊等动物的肠毒血症或坏死性肠炎，并且可引起动物脑、心、肺和肾组织的水肿。B型和D型产气荚膜梭菌所产生的e毒素是引起动物上述病理变化和死亡的重要因素之一。虽然甲醛灭活的毒素疫苗能对动物产生保护性抗体，但是，灭活苗潜在的安全性原因使其在应用上受到限制。因此，基于E毒素基因的重组疫苗和弱

2、毒疫苗就成为人们研究的目标。关键词：产气荚膜梭菌；&毒素；疫苗中图分类号：S852.616.3文献标识码：A文章编号:1007-5038（2009）05-0073-03产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens）,也称魏氏梭菌（Clostridiumzvelchii）,是一种广泛分布于自然界和动物肠道中的条件性致病菌。根据细菌产生外毒素（主要为a、B、c）的种类差别，可将产气荚膜梭菌分成A、B、C、D、E5型。毒素的编码基因etx位于质粒上，etx基因编码的蛋白&毒素前体在分泌初期是无毒性的，通过蛋白酶去除毒素前体N端的13个氨基酸和C端22个氨基酸后成为有活性的成熟肽，成熟肽

3、分子质量为32ku0e毒素为B型和D型产气荚膜梭菌产生，是D型菌的主要致病因子，可导致山羊、绵羊等动物的致死性肠道疾病,对畜牧业造成很大的经济损失。由于B型和D型产气荚膜梭菌不是从人类分离的病原体，因此作毒素对人类或灵长类动物的危害还不是很清楚，当前的疫苗研究只能以反刍动物和啮齿类动物为研究对象。1 毒素引起的临床症状Uzal和Finnie已将产气荚膜梭菌e毒素对绵羊和山羊产生的临床和神经学上的症状做了详细的阐述。一般而言，绵羊感染D型产气荚膜梭菌后会发生突然死亡，有时并不表现出神经症状家和胃肠炎并发症，而山羊感染后会产生严重的小肠结肠炎或慢性消耗性症状，往往预后不良。啮齿类动物现已作为用于e

4、毒素产生神经病理性损害的研究模型。用&毒素注射小鼠后，临床上表现为癫痫、过度兴奋或抑郁并伴有轻微的肠气，剖检可发现脑水肿，组织学上出现多病灶性的急性肾小管坏死以及肺水肿。该毒素是致死性毒素，给小鼠静脉注射纳克级的e毒素，在30min内即可引起小鼠死亡，并且其毒力仅次于肉毒素和破伤风毒素。将毒素用生理盐水稀释后注入小鼠的胃和结扎的肠段中，比较后发现，除胃部以外小肠和大肠都能吸收该毒素，并且发现从结肠吸收毒素后的致死率高于从小肠吸收后的致死率，可见&毒素能在小鼠的任意肠段吸收。动物试验发现任毒素发挥作用时首先可以使大脑、肾脏和小肠中的血管通透性增高，多种组织器官发生充血和水肿，死于肠毒血症的羔羊也

5、可发生肾脏坏死区。这种毒素可以通过血脑屏障在大脑中蓄积，从而提高了脑血管通透性并导致外周血管水肿，所以，中毒后发生肠毒血症的动物末期会有一些神经症状，如角弓反张、惊厥、濒死期挣扎等口。虽然,A型和C型产气荚膜梭菌（不产e毒素）感染人以后能引起胃肠疾病，但是至今还没有&毒素对人和灵长类动物致病的报道。从小动物试验中推测，e毒素静脉注射人体的致死剂量约为100ng/kgC10气溶胶或口服方式对人的致死剂量主要取决于人体呼吸道和胃肠道与毒素的相互作用，而这方面国内外还未见研究报道。2 e毒素的生物学特点收稿日期:200902-23基金项目:国家科技基础性工作专项（2008FY210200）作者简介：

6、王光华（1978），男（蒙古族），青海大通人.博士研究生，主要从事动物传染病分子免疫学研完。*通讯作者E毒素前体在分泌初期是无毒性的，通过蛋白酶去除毒素前体N端的13个氨基酸和C端22个氨基酸后成为有活性的成熟肽，参与活化的蛋白酶包括产气荚膜梭菌产生的人蛋白酶和消化性蛋白酶如胰蛋白酶、a胰凝乳蛋白酶。这种通过切除N、C末端两段序列且还有菌体自身蛋白参与的活化过程较为少见。MiyataS等口日证明，去除C末端赛基酸残基是活化作用的关键，而且不同的酶切产生的毒素的N、C末端及其活性也不相同。其中以胰蛋白酶加胰凝乳蛋白酶活化的毒素毒力最强，而N末端氨基酸残基去除与否对毒素活性基本没有影响。惟有C末端

7、的切除位点对毒素活性，包括在神经突触膜上形成七聚体的能力有影响。去除C末端氨基酸残基后的成熟毒素其毒性是毒素前体的1000倍。目前对e毒素的作用模型还不十分明确，但基本上认定其是一种成孔毒素，对犬肾细胞（MDCK）具有致死作用；可以在其细胞膜上形成一种复合物进入细胞并导致胞内K+外流；与细胞膜形成的复合物不会被SDS解离；晶体结构显示其主要由p片层构成;这些都是成孔毒素的主要结构特点C12-13OPetitL等I试验证明任毒素在与大鼠突触小体和MDCK膜上的受体结合后可形成七聚体复合物，该复合物并不能被细胞内吞入细胞中，而是在细胞膜表面形成一个大的孔隙，并导致细胞膜通透性改变，使得大量（约90

8、%）的K离子外溢，Na离子和C1离子浓度大幅增高，Ca离子浓度稍微增高，一些有害的物质，如碘化丙锭进入细胞，导致细胞死亡。该毒素的靶位是细胞膜上具有抗去污剂性质的结构域（DMRs）,这种结构域与毒素形成七聚体的能力要强于它与其它成分的作用，所以e毒素的受体主要存在于DMRs上，毒素与之结合后会诱发形成毒素七聚体，毒素从与受体结合到在细胞膜上成孔的过程都在同一个DMRs中完成，而形成七聚体的过程是毒素发挥作用的前提C15-163o此外，亚致死量或致死量的a或0毒素与e毒素同时注射小鼠后的死亡时间比单独注射e毒素的时间短，表明a和。都具有增强毒素对肠毒血症宿主的致死效果成，其机制还有待进一步研究。

9、E毒素与宿主细胞表面的作用机制还不是很清楚，但是现已证明它可以识别小鼠脑细胞和突触小体膜上的唾液糖蛋白受体。目前只有两种细胞系对e毒素敏感，分别为MDCK和人成平滑肌瘤G402细胞,据推测这与这两种细胞表面存在有效结合毒素的受体有关。3 毒素的免疫和疫苗目前，家畜用产气荚膜梭菌灭活苗的免疫效果不一，如果能掌握D型产气荚膜梭菌产生致死毒素的特征以及培养上清中毒素的致死效果，则有可能提高此类疫苗的效果。SayeedS等口刃研究了D型产气荚膜梭菌培养上清中的e毒素水平与小鼠致死率的关系，随后用&毒素的单克隆抗体证明D型产气荚膜梭菌培养上清中的&毒素就是引起小鼠死亡的主要毒素。对于类毒素疫苗在反刍类和

10、啮齿类动物上的免疫效果主要用其产生的抗体评价。用小鼠单克隆抗体已经确定出在&毒素上至少有两个中和表位，并且这些抗原表位和抗体的作用机制已经研究的比较清楚。Pitit等证明抗e毒素多克隆抗体或单克隆抗体能够在体外阻止毒素在MDCK细胞膜上形成七聚体，表明抗体能阻止毒素对组织的破坏。灭活疫苗在反刍动物上的有效性还有质疑，但已经广泛应用于绵羊和山羊2。】。用于人类和灵长类动物的e毒素甲醛灭活苗至今还未见报道，因此，有必要开发一种既能用于人类又能用于动物的e毒素重组、减毒苗。目前已有很多这方面的报道，如对已经确定的对小鼠有致死活性的关键氨基酸残基进行化学修饰,这些氨基酸残基包括组氨酸、色氨酸和酪氨酸。

11、根据这些研究结果，OystenPC等小对e毒素毒性起关键作用的组氨酸、色氨酸等氨基酸残基进行定向突变，共得到10个突变体,其中只有一个突变体H106P,静脉注射小鼠后没有发现毒性。这很可能是由于脯氨酸的替换改变了毒素蛋白的三级构象,从而影响了蛋白的活性位点，因为在相同的位点用丝氨酸替换后毒素蛋白仍然保持生物学活性七由此可见，要想获得更加有效的e毒素位点突变体作为候选疫苗，必须更加全面研究e毒素分子的结构和功能。4结语针对产气荚膜梭菌e毒素在人类和动物上潜在的危害，以及世界范围内生物恐怖袭击的威胁促使科学家们加快对该毒素的疫苗研制。科学的疫苗研制应从以下两个方面去研究：第一，发展重组、减毒（或完

12、全无毒）的疫苗。虽然e毒素的类毒素疫苗在动物上具有保护作用，但是出于安全性考虑这种疫苗不太可能适用于人类。因此将来的疫苗研究必须基于对毒素结构和分子功能的完全理解。第二，必须重视研究毒素与呼吸道和胃肠道表面的相互作用关系。因为产气荚膜梭菌e毒素有可能作为恐怖袭击的生物武器以气溶胶或食品的方式散布。毒素分子基本上是通过以上两种方式引起机体发病，而目前对这两方面研究的还不是很清楚，这主要表现为:与毒素分子结合的细胞表面受体研究；毒素与黏膜表面细胞的相互作用；黏膜免疫在防止毒素吸收中的作用。相信随着对上述两个方面的研究，在不久的将来一定能研制出针对各种毒素的安全疫苗，从而造福于人类和动物。参考文献：

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