人醛糖还原酶基因真核细胞表达模型的构建及中草药醛糖还原酶抑制剂筛选

1、老年医学专业毕业论文 精品论文 人醛糖还原酶基因真核细胞表达模型的构建及中草药醛糖还原酶抑制剂筛选关键词：醛糖还原酶基因 真核细胞 中草药醛糖还原酶抑制剂摘要：糖尿病慢性并发症(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一个慢性病变过程，需要长期用药，因而选择疗效确切、靶点清楚、副作用小的药物来干预DCC的发展，临床意义较大。糖代谢多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被认为是DCC的主要发病机制之一(附录1)，醛糖还原酶(Aldosereductase，AR)为PP的主要限速酶。体外研究和动物实验表明：AR抑制剂(Aldosereductaseinhib

2、itor，ARI)可以有效地改善PP代谢异常，预防与延缓DCC，如眼部病变、肾脏病变、神经病变。多数前期临床资料显示：人工合成的ARI低剂量疗效欠佳，高剂量副作用较大。因此寻找并筛选低毒高效的ARI，对DCC的预防和治疗具有重要的意义。中草药ARI作为天然产物，无明显不良反应，并可经过辨证施治，正确组方研制复方制剂，使抑制AR，降血糖，抗氧化，扩血管等多种功能并存，因而在预防治疗DCC方面显示了良好的应用前景。 本研究是利用基因重组和基因转导技术，将基因AR及携带绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP导入真核细胞(酵母细胞/HEK293细胞

3、)，构建AR表达的蛋白分子模型和AR：GFP的细胞模型，研究AR在代谢中的地位，并应用该模型进行中草药醛糖还原酶抑制剂(ARI)的初步筛选。 研究分为以下三个部分： (1)AR基因酵母细胞表达模型的构建：将含人AR基因的酵母重组质粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期构建并保存)，转化酵母宿主菌INVSC1，分别命名为XAR、XAG菌株。加入CuSO4(记为0hr)诱导目的蛋白表达，通过Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法检测AR、AR：GFP的基因表达、蛋白表达及AR酶活性。结果显示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR细胞模型XAR菌株中A

4、R的mRNA和蛋白均表达较好，AR活性较强(最高约为140U/g)；XAG菌株检测到AR：GFP的mRNA和蛋白较好表达，但融合蛋白AR：GFP几乎无AR活性。 (2)AR基因HEK293细胞表达模型的构建：将目的基因AR，AR：GFP重组克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-HisA中，分别构建重组质粒pHAR、pHAG，瞬时转染HEK293细胞，通过Westernblot、紫外分光光度法观察AR和AR：GFP在HEK293细胞中的表达情况，实验结果与酵母细胞部分基本一致。结果显示AR基因的HEK293细胞蛋白分子模型成功构建，基于GFP探针的AR：GFP细胞模型不太理想。并借助His

5、标签应用Ni-NTA磁珠得到纯化AR蛋白。 (3)中草药ARI的初步筛选：选用经典的ARISorbinil和Zopolrestat分别对上述两个蛋白分子模型表达的细胞总蛋白AR活性进行抑制观察，两药物的抑制结果一致表明：抑制效果呈药物浓度依赖性关系，但对HEK293细胞中AR的抑制效果更佳。随选用HEK293细胞蛋白分子模型进行中草药ARI的初步筛选，筛选出具有潜在ARI作用的中药有效成分黄芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性与经典的ARISorbinil基本相当，为进一步实验研究奠定基础。 本研究通过AR靶点，成功地构建了AR基因的真核细胞(酵母细胞/HEK293细胞)蛋白分子表达模

6、型；借助GFP这一生物活分子探针，建立AR：GFP的细胞模型有待于进一步改进。将蛋白分子模型应用于中草药ARI的简单经济高效筛选，初步筛选出可能具有潜在的防治DCC的几种中草药ARI。此AR蛋白分子模型靶点明确，在中药ARI筛选方面可以发挥积极的作用。正文内容 糖尿病慢性并发症(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一个慢性病变过程，需要长期用药，因而选择疗效确切、靶点清楚、副作用小的药物来干预DCC的发展，临床意义较大。糖代谢多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被认为是DCC的主要发病机制之一(附录1)，醛糖还原酶(Aldosereductase，

7、AR)为PP的主要限速酶。体外研究和动物实验表明：AR抑制剂(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代谢异常，预防与延缓DCC，如眼部病变、肾脏病变、神经病变。多数前期临床资料显示：人工合成的ARI低剂量疗效欠佳，高剂量副作用较大。因此寻找并筛选低毒高效的ARI，对DCC的预防和治疗具有重要的意义。中草药ARI作为天然产物，无明显不良反应，并可经过辨证施治，正确组方研制复方制剂，使抑制AR，降血糖，抗氧化，扩血管等多种功能并存，因而在预防治疗DCC方面显示了良好的应用前景。 本研究是利用基因重组和基因转导技术，将基因AR及携带绿色荧光蛋白(Greenflu

8、orescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP导入真核细胞(酵母细胞/HEK293细胞)，构建AR表达的蛋白分子模型和AR：GFP的细胞模型，研究AR在代谢中的地位，并应用该模型进行中草药醛糖还原酶抑制剂(ARI)的初步筛选。 研究分为以下三个部分： (1)AR基因酵母细胞表达模型的构建：将含人AR基因的酵母重组质粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期构建并保存)，转化酵母宿主菌INVSC1，分别命名为XAR、XAG菌株。加入CuSO4(记为0hr)诱导目的蛋白表达，通过Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法检测AR、AR：G

9、FP的基因表达、蛋白表达及AR酶活性。结果显示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR细胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表达较好，AR活性较强(最高约为140U/g)；XAG菌株检测到AR：GFP的mRNA和蛋白较好表达，但融合蛋白AR：GFP几乎无AR活性。 (2)AR基因HEK293细胞表达模型的构建：将目的基因AR，AR：GFP重组克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-HisA中，分别构建重组质粒pHAR、pHAG，瞬时转染HEK293细胞，通过Westernblot、紫外分光光度法观察AR和AR：GFP在HEK293细胞中的表达情况，实验结果与酵母细胞部分基本一致。结果显示AR

10、基因的HEK293细胞蛋白分子模型成功构建，基于GFP探针的AR：GFP细胞模型不太理想。并借助His标签应用Ni-NTA磁珠得到纯化AR蛋白。 (3)中草药ARI的初步筛选：选用经典的ARISorbinil和Zopolrestat分别对上述两个蛋白分子模型表达的细胞总蛋白AR活性进行抑制观察，两药物的抑制结果一致表明：抑制效果呈药物浓度依赖性关系，但对HEK293细胞中AR的抑制效果更佳。随选用HEK293细胞蛋白分子模型进行中草药ARI的初步筛选，筛选出具有潜在ARI作用的中药有效成分黄芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性与经典的ARISorbinil基本相当，为进一步实验研究奠定

11、基础。 本研究通过AR靶点，成功地构建了AR基因的真核细胞(酵母细胞/HEK293细胞)蛋白分子表达模型；借助GFP这一生物活分子探针，建立AR：GFP的细胞模型有待于进一步改进。将蛋白分子模型应用于中草药ARI的简单经济高效筛选，初步筛选出可能具有潜在的防治DCC的几种中草药ARI。此AR蛋白分子模型靶点明确，在中药ARI筛选方面可以发挥积极的作用。糖尿病慢性并发症(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一个慢性病变过程，需要长期用药，因而选择疗效确切、靶点清楚、副作用小的药物来干预DCC的发展，临床意义较大。糖代谢多元醇通路(Polyolpathway，PP)

12、激活被认为是DCC的主要发病机制之一(附录1)，醛糖还原酶(Aldosereductase，AR)为PP的主要限速酶。体外研究和动物实验表明：AR抑制剂(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代谢异常，预防与延缓DCC，如眼部病变、肾脏病变、神经病变。多数前期临床资料显示：人工合成的ARI低剂量疗效欠佳，高剂量副作用较大。因此寻找并筛选低毒高效的ARI，对DCC的预防和治疗具有重要的意义。中草药ARI作为天然产物，无明显不良反应，并可经过辨证施治，正确组方研制复方制剂，使抑制AR，降血糖，抗氧化，扩血管等多种功能并存，因而在预防治疗DCC方面显示了良好的应

13、用前景。 本研究是利用基因重组和基因转导技术，将基因AR及携带绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP导入真核细胞(酵母细胞/HEK293细胞)，构建AR表达的蛋白分子模型和AR：GFP的细胞模型，研究AR在代谢中的地位，并应用该模型进行中草药醛糖还原酶抑制剂(ARI)的初步筛选。 研究分为以下三个部分： (1)AR基因酵母细胞表达模型的构建：将含人AR基因的酵母重组质粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期构建并保存)，转化酵母宿主菌INVSC1，分别命名为XAR、XAG菌株。加入CuSO4(记为0hr)诱导目的蛋白

14、表达，通过Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法检测AR、AR：GFP的基因表达、蛋白表达及AR酶活性。结果显示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR细胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表达较好，AR活性较强(最高约为140U/g)；XAG菌株检测到AR：GFP的mRNA和蛋白较好表达，但融合蛋白AR：GFP几乎无AR活性。 (2)AR基因HEK293细胞表达模型的构建：将目的基因AR，AR：GFP重组克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-HisA中，分别构建重组质粒pHAR、pHAG，瞬时转染HEK293细胞，通过Westernblot、紫外分光光度法观察A

15、R和AR：GFP在HEK293细胞中的表达情况，实验结果与酵母细胞部分基本一致。结果显示AR基因的HEK293细胞蛋白分子模型成功构建，基于GFP探针的AR：GFP细胞模型不太理想。并借助His标签应用Ni-NTA磁珠得到纯化AR蛋白。 (3)中草药ARI的初步筛选：选用经典的ARISorbinil和Zopolrestat分别对上述两个蛋白分子模型表达的细胞总蛋白AR活性进行抑制观察，两药物的抑制结果一致表明：抑制效果呈药物浓度依赖性关系，但对HEK293细胞中AR的抑制效果更佳。随选用HEK293细胞蛋白分子模型进行中草药ARI的初步筛选，筛选出具有潜在ARI作用的中药有效成分黄芩苷、虎杖苷

16、、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性与经典的ARISorbinil基本相当，为进一步实验研究奠定基础。 本研究通过AR靶点，成功地构建了AR基因的真核细胞(酵母细胞/HEK293细胞)蛋白分子表达模型；借助GFP这一生物活分子探针，建立AR：GFP的细胞模型有待于进一步改进。将蛋白分子模型应用于中草药ARI的简单经济高效筛选，初步筛选出可能具有潜在的防治DCC的几种中草药ARI。此AR蛋白分子模型靶点明确，在中药ARI筛选方面可以发挥积极的作用。糖尿病慢性并发症(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一个慢性病变过程，需要长期用药，因而选择疗效确切、靶点清楚、副作用小

17、的药物来干预DCC的发展，临床意义较大。糖代谢多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被认为是DCC的主要发病机制之一(附录1)，醛糖还原酶(Aldosereductase，AR)为PP的主要限速酶。体外研究和动物实验表明：AR抑制剂(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代谢异常，预防与延缓DCC，如眼部病变、肾脏病变、神经病变。多数前期临床资料显示：人工合成的ARI低剂量疗效欠佳，高剂量副作用较大。因此寻找并筛选低毒高效的ARI，对DCC的预防和治疗具有重要的意义。中草药ARI作为天然产物，无明显不良反应，并可经过辨证施治，正确组方研制复方制

18、剂，使抑制AR，降血糖，抗氧化，扩血管等多种功能并存，因而在预防治疗DCC方面显示了良好的应用前景。 本研究是利用基因重组和基因转导技术，将基因AR及携带绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP导入真核细胞(酵母细胞/HEK293细胞)，构建AR表达的蛋白分子模型和AR：GFP的细胞模型，研究AR在代谢中的地位，并应用该模型进行中草药醛糖还原酶抑制剂(ARI)的初步筛选。 研究分为以下三个部分： (1)AR基因酵母细胞表达模型的构建：将含人AR基因的酵母重组质粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期构建并保存)，转化酵

19、母宿主菌INVSC1，分别命名为XAR、XAG菌株。加入CuSO4(记为0hr)诱导目的蛋白表达，通过Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法检测AR、AR：GFP的基因表达、蛋白表达及AR酶活性。结果显示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR细胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表达较好，AR活性较强(最高约为140U/g)；XAG菌株检测到AR：GFP的mRNA和蛋白较好表达，但融合蛋白AR：GFP几乎无AR活性。 (2)AR基因HEK293细胞表达模型的构建：将目的基因AR，AR：GFP重组克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-HisA中，分别构建重组质粒p

20、HAR、pHAG，瞬时转染HEK293细胞，通过Westernblot、紫外分光光度法观察AR和AR：GFP在HEK293细胞中的表达情况，实验结果与酵母细胞部分基本一致。结果显示AR基因的HEK293细胞蛋白分子模型成功构建，基于GFP探针的AR：GFP细胞模型不太理想。并借助His标签应用Ni-NTA磁珠得到纯化AR蛋白。 (3)中草药ARI的初步筛选：选用经典的ARISorbinil和Zopolrestat分别对上述两个蛋白分子模型表达的细胞总蛋白AR活性进行抑制观察，两药物的抑制结果一致表明：抑制效果呈药物浓度依赖性关系，但对HEK293细胞中AR的抑制效果更佳。随选用HEK293细胞

21、蛋白分子模型进行中草药ARI的初步筛选，筛选出具有潜在ARI作用的中药有效成分黄芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性与经典的ARISorbinil基本相当，为进一步实验研究奠定基础。 本研究通过AR靶点，成功地构建了AR基因的真核细胞(酵母细胞/HEK293细胞)蛋白分子表达模型；借助GFP这一生物活分子探针，建立AR：GFP的细胞模型有待于进一步改进。将蛋白分子模型应用于中草药ARI的简单经济高效筛选，初步筛选出可能具有潜在的防治DCC的几种中草药ARI。此AR蛋白分子模型靶点明确，在中药ARI筛选方面可以发挥积极的作用。糖尿病慢性并发症(Dialbeticchroniccompli

22、cation，DCC)是一个慢性病变过程，需要长期用药，因而选择疗效确切、靶点清楚、副作用小的药物来干预DCC的发展，临床意义较大。糖代谢多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被认为是DCC的主要发病机制之一(附录1)，醛糖还原酶(Aldosereductase，AR)为PP的主要限速酶。体外研究和动物实验表明：AR抑制剂(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代谢异常，预防与延缓DCC，如眼部病变、肾脏病变、神经病变。多数前期临床资料显示：人工合成的ARI低剂量疗效欠佳，高剂量副作用较大。因此寻找并筛选低毒高效的ARI，对DCC的预防和治疗具

23、有重要的意义。中草药ARI作为天然产物，无明显不良反应，并可经过辨证施治，正确组方研制复方制剂，使抑制AR，降血糖，抗氧化，扩血管等多种功能并存，因而在预防治疗DCC方面显示了良好的应用前景。 本研究是利用基因重组和基因转导技术，将基因AR及携带绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP导入真核细胞(酵母细胞/HEK293细胞)，构建AR表达的蛋白分子模型和AR：GFP的细胞模型，研究AR在代谢中的地位，并应用该模型进行中草药醛糖还原酶抑制剂(ARI)的初步筛选。 研究分为以下三个部分： (1)AR基因酵母细胞表达模型的构建：将含人AR基因的酵

24、母重组质粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期构建并保存)，转化酵母宿主菌INVSC1，分别命名为XAR、XAG菌株。加入CuSO4(记为0hr)诱导目的蛋白表达，通过Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法检测AR、AR：GFP的基因表达、蛋白表达及AR酶活性。结果显示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR细胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表达较好，AR活性较强(最高约为140U/g)；XAG菌株检测到AR：GFP的mRNA和蛋白较好表达，但融合蛋白AR：GFP几乎无AR活性。 (2)AR基因HEK293细胞表达模型的构建：将目的基因AR

25、，AR：GFP重组克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-HisA中，分别构建重组质粒pHAR、pHAG，瞬时转染HEK293细胞，通过Westernblot、紫外分光光度法观察AR和AR：GFP在HEK293细胞中的表达情况，实验结果与酵母细胞部分基本一致。结果显示AR基因的HEK293细胞蛋白分子模型成功构建，基于GFP探针的AR：GFP细胞模型不太理想。并借助His标签应用Ni-NTA磁珠得到纯化AR蛋白。 (3)中草药ARI的初步筛选：选用经典的ARISorbinil和Zopolrestat分别对上述两个蛋白分子模型表达的细胞总蛋白AR活性进行抑制观察，两药物的抑制结果一致表明：抑

26、制效果呈药物浓度依赖性关系，但对HEK293细胞中AR的抑制效果更佳。随选用HEK293细胞蛋白分子模型进行中草药ARI的初步筛选，筛选出具有潜在ARI作用的中药有效成分黄芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性与经典的ARISorbinil基本相当，为进一步实验研究奠定基础。 本研究通过AR靶点，成功地构建了AR基因的真核细胞(酵母细胞/HEK293细胞)蛋白分子表达模型；借助GFP这一生物活分子探针，建立AR：GFP的细胞模型有待于进一步改进。将蛋白分子模型应用于中草药ARI的简单经济高效筛选，初步筛选出可能具有潜在的防治DCC的几种中草药ARI。此AR蛋白分子模型靶点明确，在中药AR

27、I筛选方面可以发挥积极的作用。糖尿病慢性并发症(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一个慢性病变过程，需要长期用药，因而选择疗效确切、靶点清楚、副作用小的药物来干预DCC的发展，临床意义较大。糖代谢多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被认为是DCC的主要发病机制之一(附录1)，醛糖还原酶(Aldosereductase，AR)为PP的主要限速酶。体外研究和动物实验表明：AR抑制剂(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代谢异常，预防与延缓DCC，如眼部病变、肾脏病变、神经病变。多数前期临床资料显示：人工合成的A

28、RI低剂量疗效欠佳，高剂量副作用较大。因此寻找并筛选低毒高效的ARI，对DCC的预防和治疗具有重要的意义。中草药ARI作为天然产物，无明显不良反应，并可经过辨证施治，正确组方研制复方制剂，使抑制AR，降血糖，抗氧化，扩血管等多种功能并存，因而在预防治疗DCC方面显示了良好的应用前景。 本研究是利用基因重组和基因转导技术，将基因AR及携带绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP导入真核细胞(酵母细胞/HEK293细胞)，构建AR表达的蛋白分子模型和AR：GFP的细胞模型，研究AR在代谢中的地位，并应用该模型进行中草药醛糖还原酶抑制剂(ARI)的

29、初步筛选。 研究分为以下三个部分： (1)AR基因酵母细胞表达模型的构建：将含人AR基因的酵母重组质粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期构建并保存)，转化酵母宿主菌INVSC1，分别命名为XAR、XAG菌株。加入CuSO4(记为0hr)诱导目的蛋白表达，通过Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法检测AR、AR：GFP的基因表达、蛋白表达及AR酶活性。结果显示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR细胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表达较好，AR活性较强(最高约为140U/g)；XAG菌株检测到AR：GFP的mRNA和蛋白较好表达，但融合蛋

30、白AR：GFP几乎无AR活性。 (2)AR基因HEK293细胞表达模型的构建：将目的基因AR，AR：GFP重组克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-HisA中，分别构建重组质粒pHAR、pHAG，瞬时转染HEK293细胞，通过Westernblot、紫外分光光度法观察AR和AR：GFP在HEK293细胞中的表达情况，实验结果与酵母细胞部分基本一致。结果显示AR基因的HEK293细胞蛋白分子模型成功构建，基于GFP探针的AR：GFP细胞模型不太理想。并借助His标签应用Ni-NTA磁珠得到纯化AR蛋白。 (3)中草药ARI的初步筛选：选用经典的ARISorbinil和Zopolrestat

31、分别对上述两个蛋白分子模型表达的细胞总蛋白AR活性进行抑制观察，两药物的抑制结果一致表明：抑制效果呈药物浓度依赖性关系，但对HEK293细胞中AR的抑制效果更佳。随选用HEK293细胞蛋白分子模型进行中草药ARI的初步筛选，筛选出具有潜在ARI作用的中药有效成分黄芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性与经典的ARISorbinil基本相当，为进一步实验研究奠定基础。 本研究通过AR靶点，成功地构建了AR基因的真核细胞(酵母细胞/HEK293细胞)蛋白分子表达模型；借助GFP这一生物活分子探针，建立AR：GFP的细胞模型有待于进一步改进。将蛋白分子模型应用于中草药ARI的简单经济高效筛选，

32、初步筛选出可能具有潜在的防治DCC的几种中草药ARI。此AR蛋白分子模型靶点明确，在中药ARI筛选方面可以发挥积极的作用。糖尿病慢性并发症(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一个慢性病变过程，需要长期用药，因而选择疗效确切、靶点清楚、副作用小的药物来干预DCC的发展，临床意义较大。糖代谢多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被认为是DCC的主要发病机制之一(附录1)，醛糖还原酶(Aldosereductase，AR)为PP的主要限速酶。体外研究和动物实验表明：AR抑制剂(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代

33、谢异常，预防与延缓DCC，如眼部病变、肾脏病变、神经病变。多数前期临床资料显示：人工合成的ARI低剂量疗效欠佳，高剂量副作用较大。因此寻找并筛选低毒高效的ARI，对DCC的预防和治疗具有重要的意义。中草药ARI作为天然产物，无明显不良反应，并可经过辨证施治，正确组方研制复方制剂，使抑制AR，降血糖，抗氧化，扩血管等多种功能并存，因而在预防治疗DCC方面显示了良好的应用前景。 本研究是利用基因重组和基因转导技术，将基因AR及携带绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP导入真核细胞(酵母细胞/HEK293细胞)，构建AR表达的蛋白分子模型和AR：

34、GFP的细胞模型，研究AR在代谢中的地位，并应用该模型进行中草药醛糖还原酶抑制剂(ARI)的初步筛选。 研究分为以下三个部分： (1)AR基因酵母细胞表达模型的构建：将含人AR基因的酵母重组质粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期构建并保存)，转化酵母宿主菌INVSC1，分别命名为XAR、XAG菌株。加入CuSO4(记为0hr)诱导目的蛋白表达，通过Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法检测AR、AR：GFP的基因表达、蛋白表达及AR酶活性。结果显示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR细胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表达较好，AR活性

35、较强(最高约为140U/g)；XAG菌株检测到AR：GFP的mRNA和蛋白较好表达，但融合蛋白AR：GFP几乎无AR活性。 (2)AR基因HEK293细胞表达模型的构建：将目的基因AR，AR：GFP重组克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-HisA中，分别构建重组质粒pHAR、pHAG，瞬时转染HEK293细胞，通过Westernblot、紫外分光光度法观察AR和AR：GFP在HEK293细胞中的表达情况，实验结果与酵母细胞部分基本一致。结果显示AR基因的HEK293细胞蛋白分子模型成功构建，基于GFP探针的AR：GFP细胞模型不太理想。并借助His标签应用Ni-NTA磁珠得到纯化AR蛋

36、白。 (3)中草药ARI的初步筛选：选用经典的ARISorbinil和Zopolrestat分别对上述两个蛋白分子模型表达的细胞总蛋白AR活性进行抑制观察，两药物的抑制结果一致表明：抑制效果呈药物浓度依赖性关系，但对HEK293细胞中AR的抑制效果更佳。随选用HEK293细胞蛋白分子模型进行中草药ARI的初步筛选，筛选出具有潜在ARI作用的中药有效成分黄芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性与经典的ARISorbinil基本相当，为进一步实验研究奠定基础。 本研究通过AR靶点，成功地构建了AR基因的真核细胞(酵母细胞/HEK293细胞)蛋白分子表达模型；借助GFP这一生物活分子探针，建立

37、AR：GFP的细胞模型有待于进一步改进。将蛋白分子模型应用于中草药ARI的简单经济高效筛选，初步筛选出可能具有潜在的防治DCC的几种中草药ARI。此AR蛋白分子模型靶点明确，在中药ARI筛选方面可以发挥积极的作用。糖尿病慢性并发症(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一个慢性病变过程，需要长期用药，因而选择疗效确切、靶点清楚、副作用小的药物来干预DCC的发展，临床意义较大。糖代谢多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被认为是DCC的主要发病机制之一(附录1)，醛糖还原酶(Aldosereductase，AR)为PP的主要限速酶。体外研究和动物实验表明

38、：AR抑制剂(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代谢异常，预防与延缓DCC，如眼部病变、肾脏病变、神经病变。多数前期临床资料显示：人工合成的ARI低剂量疗效欠佳，高剂量副作用较大。因此寻找并筛选低毒高效的ARI，对DCC的预防和治疗具有重要的意义。中草药ARI作为天然产物，无明显不良反应，并可经过辨证施治，正确组方研制复方制剂，使抑制AR，降血糖，抗氧化，扩血管等多种功能并存，因而在预防治疗DCC方面显示了良好的应用前景。 本研究是利用基因重组和基因转导技术，将基因AR及携带绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基

39、因AR：GFP导入真核细胞(酵母细胞/HEK293细胞)，构建AR表达的蛋白分子模型和AR：GFP的细胞模型，研究AR在代谢中的地位，并应用该模型进行中草药醛糖还原酶抑制剂(ARI)的初步筛选。 研究分为以下三个部分： (1)AR基因酵母细胞表达模型的构建：将含人AR基因的酵母重组质粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期构建并保存)，转化酵母宿主菌INVSC1，分别命名为XAR、XAG菌株。加入CuSO4(记为0hr)诱导目的蛋白表达，通过Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法检测AR、AR：GFP的基因表达、蛋白表达及AR酶活性。结果显示A

40、R酵母蛋白分子模型成功建立：AR细胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表达较好，AR活性较强(最高约为140U/g)；XAG菌株检测到AR：GFP的mRNA和蛋白较好表达，但融合蛋白AR：GFP几乎无AR活性。 (2)AR基因HEK293细胞表达模型的构建：将目的基因AR，AR：GFP重组克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-HisA中，分别构建重组质粒pHAR、pHAG，瞬时转染HEK293细胞，通过Westernblot、紫外分光光度法观察AR和AR：GFP在HEK293细胞中的表达情况，实验结果与酵母细胞部分基本一致。结果显示AR基因的HEK293细胞蛋白分子模型成功构建，基于

41、GFP探针的AR：GFP细胞模型不太理想。并借助His标签应用Ni-NTA磁珠得到纯化AR蛋白。 (3)中草药ARI的初步筛选：选用经典的ARISorbinil和Zopolrestat分别对上述两个蛋白分子模型表达的细胞总蛋白AR活性进行抑制观察，两药物的抑制结果一致表明：抑制效果呈药物浓度依赖性关系，但对HEK293细胞中AR的抑制效果更佳。随选用HEK293细胞蛋白分子模型进行中草药ARI的初步筛选，筛选出具有潜在ARI作用的中药有效成分黄芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性与经典的ARISorbinil基本相当，为进一步实验研究奠定基础。 本研究通过AR靶点，成功地构建了AR基因

42、的真核细胞(酵母细胞/HEK293细胞)蛋白分子表达模型；借助GFP这一生物活分子探针，建立AR：GFP的细胞模型有待于进一步改进。将蛋白分子模型应用于中草药ARI的简单经济高效筛选，初步筛选出可能具有潜在的防治DCC的几种中草药ARI。此AR蛋白分子模型靶点明确，在中药ARI筛选方面可以发挥积极的作用。糖尿病慢性并发症(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一个慢性病变过程，需要长期用药，因而选择疗效确切、靶点清楚、副作用小的药物来干预DCC的发展，临床意义较大。糖代谢多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被认为是DCC的主要发病机制之一(附录1)，

43、醛糖还原酶(Aldosereductase，AR)为PP的主要限速酶。体外研究和动物实验表明：AR抑制剂(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代谢异常，预防与延缓DCC，如眼部病变、肾脏病变、神经病变。多数前期临床资料显示：人工合成的ARI低剂量疗效欠佳，高剂量副作用较大。因此寻找并筛选低毒高效的ARI，对DCC的预防和治疗具有重要的意义。中草药ARI作为天然产物，无明显不良反应，并可经过辨证施治，正确组方研制复方制剂，使抑制AR，降血糖，抗氧化，扩血管等多种功能并存，因而在预防治疗DCC方面显示了良好的应用前景。 本研究是利用基因重组和基因转导技术，将

44、基因AR及携带绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP导入真核细胞(酵母细胞/HEK293细胞)，构建AR表达的蛋白分子模型和AR：GFP的细胞模型，研究AR在代谢中的地位，并应用该模型进行中草药醛糖还原酶抑制剂(ARI)的初步筛选。 研究分为以下三个部分： (1)AR基因酵母细胞表达模型的构建：将含人AR基因的酵母重组质粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期构建并保存)，转化酵母宿主菌INVSC1，分别命名为XAR、XAG菌株。加入CuSO4(记为0hr)诱导目的蛋白表达，通过Northernblot、Wester

45、nblot，紫外分光光度法检测AR、AR：GFP的基因表达、蛋白表达及AR酶活性。结果显示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR细胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表达较好，AR活性较强(最高约为140U/g)；XAG菌株检测到AR：GFP的mRNA和蛋白较好表达，但融合蛋白AR：GFP几乎无AR活性。 (2)AR基因HEK293细胞表达模型的构建：将目的基因AR，AR：GFP重组克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-HisA中，分别构建重组质粒pHAR、pHAG，瞬时转染HEK293细胞，通过Westernblot、紫外分光光度法观察AR和AR：GFP在HEK293细胞中的表达情况，

46、实验结果与酵母细胞部分基本一致。结果显示AR基因的HEK293细胞蛋白分子模型成功构建，基于GFP探针的AR：GFP细胞模型不太理想。并借助His标签应用Ni-NTA磁珠得到纯化AR蛋白。 (3)中草药ARI的初步筛选：选用经典的ARISorbinil和Zopolrestat分别对上述两个蛋白分子模型表达的细胞总蛋白AR活性进行抑制观察，两药物的抑制结果一致表明：抑制效果呈药物浓度依赖性关系，但对HEK293细胞中AR的抑制效果更佳。随选用HEK293细胞蛋白分子模型进行中草药ARI的初步筛选，筛选出具有潜在ARI作用的中药有效成分黄芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性与经典的ARIS

47、orbinil基本相当，为进一步实验研究奠定基础。 本研究通过AR靶点，成功地构建了AR基因的真核细胞(酵母细胞/HEK293细胞)蛋白分子表达模型；借助GFP这一生物活分子探针，建立AR：GFP的细胞模型有待于进一步改进。将蛋白分子模型应用于中草药ARI的简单经济高效筛选，初步筛选出可能具有潜在的防治DCC的几种中草药ARI。此AR蛋白分子模型靶点明确，在中药ARI筛选方面可以发挥积极的作用。糖尿病慢性并发症(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一个慢性病变过程，需要长期用药，因而选择疗效确切、靶点清楚、副作用小的药物来干预DCC的发展，临床意义较大。糖代谢多

48、元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被认为是DCC的主要发病机制之一(附录1)，醛糖还原酶(Aldosereductase，AR)为PP的主要限速酶。体外研究和动物实验表明：AR抑制剂(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代谢异常，预防与延缓DCC，如眼部病变、肾脏病变、神经病变。多数前期临床资料显示：人工合成的ARI低剂量疗效欠佳，高剂量副作用较大。因此寻找并筛选低毒高效的ARI，对DCC的预防和治疗具有重要的意义。中草药ARI作为天然产物，无明显不良反应，并可经过辨证施治，正确组方研制复方制剂，使抑制AR，降血糖，抗氧化，扩血管等多种功能

49、并存，因而在预防治疗DCC方面显示了良好的应用前景。 本研究是利用基因重组和基因转导技术，将基因AR及携带绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP导入真核细胞(酵母细胞/HEK293细胞)，构建AR表达的蛋白分子模型和AR：GFP的细胞模型，研究AR在代谢中的地位，并应用该模型进行中草药醛糖还原酶抑制剂(ARI)的初步筛选。 研究分为以下三个部分： (1)AR基因酵母细胞表达模型的构建：将含人AR基因的酵母重组质粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期构建并保存)，转化酵母宿主菌INVSC1，分别命名为XAR、XAG菌

50、株。加入CuSO4(记为0hr)诱导目的蛋白表达，通过Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法检测AR、AR：GFP的基因表达、蛋白表达及AR酶活性。结果显示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR细胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表达较好，AR活性较强(最高约为140U/g)；XAG菌株检测到AR：GFP的mRNA和蛋白较好表达，但融合蛋白AR：GFP几乎无AR活性。 (2)AR基因HEK293细胞表达模型的构建：将目的基因AR，AR：GFP重组克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-HisA中，分别构建重组质粒pHAR、pHAG，瞬时转染HEK293细胞，通过

51、Westernblot、紫外分光光度法观察AR和AR：GFP在HEK293细胞中的表达情况，实验结果与酵母细胞部分基本一致。结果显示AR基因的HEK293细胞蛋白分子模型成功构建，基于GFP探针的AR：GFP细胞模型不太理想。并借助His标签应用Ni-NTA磁珠得到纯化AR蛋白。 (3)中草药ARI的初步筛选：选用经典的ARISorbinil和Zopolrestat分别对上述两个蛋白分子模型表达的细胞总蛋白AR活性进行抑制观察，两药物的抑制结果一致表明：抑制效果呈药物浓度依赖性关系，但对HEK293细胞中AR的抑制效果更佳。随选用HEK293细胞蛋白分子模型进行中草药ARI的初步筛选，筛选出具

52、有潜在ARI作用的中药有效成分黄芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性与经典的ARISorbinil基本相当，为进一步实验研究奠定基础。 本研究通过AR靶点，成功地构建了AR基因的真核细胞(酵母细胞/HEK293细胞)蛋白分子表达模型；借助GFP这一生物活分子探针，建立AR：GFP的细胞模型有待于进一步改进。将蛋白分子模型应用于中草药ARI的简单经济高效筛选，初步筛选出可能具有潜在的防治DCC的几种中草药ARI。此AR蛋白分子模型靶点明确，在中药ARI筛选方面可以发挥积极的作用。糖尿病慢性并发症(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一个慢性病变过程，需要长期用药，因而选择疗效确切、靶点清楚、副作用小的药物来干预DCC的发展，临床意义较大。糖代谢多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被认为是DCC的主要发病机制之一(附录1)，醛糖还原酶(Aldosereductase，AR)为PP的主要限速酶。体外研究和动物实验表明：AR抑制剂(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代谢异常，预防与延缓DCC，如眼部病变、肾脏病变、神经病变。多数前期临床资料显示：人工合成的ARI低剂量疗效欠佳，高剂量副作用较大。因此寻找并筛选低毒高效的ARI，对DCC的