依赖线粒体通路的凋亡

1、一、一、Bc1-2蛋白家族在细胞凋亡中的调控效应二二、线粒体/细胞色素C介导的凋亡通路的研究进展郭东北郭东北Bcl-2蛋白家族目前已发现的Bcl-2家族成员超过25种,根据其结构和功能可以分为三类:第类具有抑制凋亡的作用,包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、A1/Bfl-1、Boo/Diva/Bcl-B、NR-13、ORF16、LMW5-HL、ELB-19和CED-9等,这些蛋白含有4个Bcl-2同源结构域BH1、BH2、BH3、BH4.第类具有促进凋亡的作用,包括Bax、Bak、Bok/Mtd和Bax-xs.第类只含有BH3结构域,因此被称为BH3-only蛋白,包括Bid

2、、Bad、Noxa、Puma、Bmf、Biml/Bod、Bik/Nbk和EGL-1等. Bcl-2蛋白家族调节细胞凋亡的机制Bcl-2蛋白调节细胞凋亡的确切作用机制尚未阐明，一般认为是多种途径的共同作用：1、Bcl-2蛋白家族与线粒体在体外实验中，Bax促进线粒体通透性转换孔(PTP)开放，PTP可作为线粒体的刺激感受器和接受某些受体有关的信号，它包括位于膜间隙的腺瞟呤核苷酸和外膜的电位依赖性离子通道。PTP的开放可形成正反馈扩大过程，导致线粒体结构和功能的紊乱，线粒体外基质内流，渗透压失衡，细胞器肿胀，线粒体的内、外膜依次裂解，释放出caspase，激活蛋白，诱导细胞凋亡。而Bcl-2、 B

3、cI-X1抑制PTP开放，阻止细胞凋亡。Bcl-2和BcI-X1抑制细胞凋亡的部分原因是阻断了细胞色素C从线粒体释放，cytoc是凋亡蛋白酶激活的关键因素。2、Bcl-2蛋白的相互作用Bcl-2和 Bax既可以以同源 二聚体形式存在，也可以形成异源二聚体。Bcl-2、Bax和 Bcl-x三者形成了一个凋亡调控系统：当Bax同源二聚体形成，诱导细胞凋亡；随着Bcl-2蛋白表达量上升，越来越多的Bax二聚体分开，与Bcl-2形成比Bax-Bax更稳定的Bax-Bcl-2，异源二聚体，从而“中和”了Bax-Bax诱导细胞凋亡的作用，即Bcl-2与 Bax的比例调节了凋亡的发生；而当Bcl-Xs存在时

4、，优先与Bcl-2形成异源二聚体，而使游离的Bax得以形成同源二聚体诱导凋亡。这一模型也许可以解释为什么Bcl-2表达并不一定有抑制细胞凋亡作用。3、Bcl-2蛋白与细胞内Ca2+有研究表明：细胞内Ca2+是细胞凋亡的始动因素。应用转基因方法研究发现：定位于内质网膜上的Bcl-2可能通过阻断Ca2+从内质网向胞质中的流动，使依赖Ca2+的核酸内切酶活性降低，从而阻断细胞凋亡。 4、 Bcl-2蛋白与氧自由基Bcl-2通过抗氧化剂或抑制氧自由基的产生而发挥其抑制细胞凋亡的功能。Hockenbery等发现Bcl-2基因缺陷小鼠可发现两种与氧化还原有潜在的联系的疾病一多囊肾和色素沉着不足，揭示Bcl

5、-2具有抗氧化作用，它可阻止产生的活性氧族通过脂质过氧化反应造成细胞损害，但以后研究发现Bcl-2过表达可阻止cytoc的释放，改变了与 cytoc依赖激活caspase途径相伴的氧化还原信号，减少活性氧族的生成，同时阻止线粒体膜电位的 下降、抑制细胞凋亡。5、其他实验研究结果 verhaegen等在新生鼠心肌细胞的研究中认为Bcl-2基因调控是通过细胞内GMP含量的增加来实现的。近年来人们又发现 Bd-2可参与白细胞介素2R介导的信号传导通路，使抗原特异性T细胞免受射线和地塞米松诱导的凋亡。 小结小结Bcl-2可通过多种途径抑制凋亡，但在某些情况下Bcl-2并不能抑制细胞产生凋亡，Bcl-2

6、不能防止补体、TC（胆固醇）、肿瘤坏死因子，H2O2等介导的细胞凋亡。线粒体/细胞色素C介导的凋亡通路细胞凋亡通路细胞凋亡通路-死亡受体通路、线粒体通路、内质网通路。死亡受体通路、线粒体通路、内质网通路。1、死亡受体信号通路-死亡受体配体主要通过以下几个方面启动信号传导：受体齐聚、特殊衔接蛋白募集和半胱氨酸蛋白酶（caspase） 级联活化，最红导致细胞凋亡。2、线粒体信号通路-细胞内外各种刺激信号引起BH3-only 蛋白激活 ,通过 Bcl-2 家族调控线粒体 ,使线粒体外膜渗透而导致细胞色素 C 及Smac流入胞质与Apaf-1 及caspase-9结合形成复合体。Caspase-9 的

7、激活将引起其下游胱天蛋白酶的级联反应 ,导致该细胞凋亡。3、内质网信号通路-这一信号传导通路包括非折叠蛋白反应和钙离子起始信号等机制, 内质网应激可特异性激活 caspase- 12, caspase- 12裂解 caspase- 3 等下游效应蛋白酶, 最终导致细胞凋亡。1、BH32only 蛋白的激活蛋白的激活BH3-only 蛋白主要受死亡受体非依赖的凋亡刺激而激活 ,如 UV-和 R-辐射、细菌、生长因子缺乏、等。BH3-only 蛋白是一个只含一种BH 结构即 BH3 结构域的家族 ,包括 Bid ,BAD ,Bim 等。BH3-only 蛋白可通过翻译后修饰(如磷酸化) 而激活。2

8、、Bcl-2 家族对凋亡的促进和调控家族对凋亡的促进和调控Bax 需要 BH3-only 蛋白如Bim 和 Bid 的直接激活 。Bim 和 Bid 在胞浆中被 Bcl-2 或Bcl-xL 结合,当 Bim 和 Bid 被激活以后 ,它们会直接对Bax 和Bak 活化而在线粒体膜上形成渗透孔。而其他的BH3-only 蛋白如Bad 对Bax/Bak 的活化过程起调节作用 ,它们会竞争性抑制 Bcl-2 而使 Bim 和 Bid 释出。Bad 等会使细胞对凋亡更加敏感。总之 ,BH3-only 蛋白通过拮抗Bcl-2 而激活Bax/Bak ;另一方面 ,BH3-only 蛋白对 Bax/Bak

9、蛋白的激活过程被其他BH32only 蛋白而加强。3、线粒体上、线粒体上 MOMP 形成及细胞色素形成及细胞色素 C 的释放的释放Bax 含的3个 BH1 、BH2 、BH3 会自动形成一个疏水袋 ,其他蛋白的 BH3 肽可以插入此区并与之形成寡聚体。Bax 在未激活时 ,它的 C 端也与 Bcl-2一起插在疏水袋 ,从而阻止了 Bax 的 C 端与膜或其他蛋白结合。激活的Bax 以 C 端为向导插在线粒体外膜 ,然后线粒体上的Bax 在其他线粒体蛋白的帮助下聚集 ,在线粒体外膜形成多聚Bax 孔道即线粒体外膜通透(MOMP) ,使线粒体内容物流出。现在公认的有两种模式来解释MOMP 形成方式

10、:第一 ，通过Bcl-2家族的促凋亡成员Bax/Bak 造成线粒体外膜中断(如上所述) ，而不影响线粒体内膜或基质的功能：第二 ，其他信号如 Ca 2 + 、反应性氧，触发线粒体内膜上的小孔道开放，水分子进入线粒体基质使之肿胀，导致线粒体外膜破裂，这个反应也叫线粒体膜通透性转运(MPT) 。在线粒体凋亡通路中 ,这两种模式解释了不同背景下的膜开放方式。MPT 的形成以线粒体膜通透性转运孔(MMP) 为中心 ,MMP 是由电压依赖性阴离子(VDAC ) 、腺苷酸移位酶(ANT) 及亲环素 D 复合物在线粒体内、外膜交接处构成的一种孔道复合物。VDAC 位于线粒体外膜中 ,为非专一性孔蛋白 ,其运

11、输作用由专一性的反向转运体来调节。促凋亡的 Bcl-2 家族成员如 Bcl-2 可与 ANT 相互作用而阻断其形成孔通道 ,同样Bcl-2 也能阻碍Bax 与ANT 间的协同作用。在线粒体凋亡通路中两种模式在不同背景中发挥着作用。亲环素 D 对MPT 通路是必要的。因此，很明显，似乎有两方面使细胞死亡：一种是基于形态和没有胱天蛋白酶(caspase) 抑制因子的坏死性细胞死亡 ，通过依赖于亲环素 D的MPT 而引起坏死性细胞死亡 。 另一种是独立于 MPT 的MOMP 诱导的线粒体凋亡通路。故此可以认为 ,不足以引起坏死性细胞死亡的MPT 却可以诱导细胞凋亡。4 、Cyto C 对胱天蛋白酶的

12、激活线粒体体膜形成MOMP 后 ,线粒体膜间蛋白如 Cyto C 和Smac 释放出来。释出的 Cyto C 和三磷酸腺苷(ATP) 作为复合因子与胞液中 Apaf-1 蛋白结合 ,通过 ATP 分解提供能量诱导Apaf-1 自身多聚化 ,形成至少由 8 个亚单位组成的 Apaf-1 多聚物;并暴露 Apaf-1 的 N 端 caspase 募集域(caspase recruitment domain ,CARD) 与 caspase-9 结构域中 CARD 相互作用 ,并募集caspase-9 到多聚物上 ,形成 Cyto c-Apaf1-caspase9 高分子量的复合物 凋亡体。Casp

13、ase-9 被募集形成凋亡体后 ,它会通过改变构象自我激活 , 并引起其下游凋亡效应组 caspase 如caspase-3 ,-7的激活 ,而产生一系列酶联激活反应 ,最后对核内底物进行剪切使受累细胞凋亡。凋亡抑制蛋白家族( IAPs) 和 Smac 在线粒体凋亡通路中的调节IAPs 是一组在许多物种细胞中存在并行使抑制凋亡功能的蛋白。IAPs 家族有8种成员：XIAP、Is-IAP、c-IAP1 、 c-IAP2 、Livin、NAIP、Survivin 及Bruce 。IAP 家族有一个共同单位:杆状病毒 IAP 重复结构域(BIR 结构域) 。BIR 结构域是 IAPs 成员对凋亡抑制

14、功能所必需的。其中BIR3 ,BIR2 及BIR2 与BIR1 之间的连接区(Linker) 对胱天蛋白酶的抑制起主要作用。IAPs 对“启动”和“效应”caspases 的抑制是通过不同的结合位点实现的。晶体衍射发现 caspase-9 分子中小亚基的N 端存在 IAP 结合模体-4 个氨基酸序列（丙氨酸-缬氨酸-脯氨酸-异亮氨酸）。Caspase-9 中 315 天冬氨酸的裂解而暴露此模体 ,并与 X连锁凋亡抑制蛋白( XI-AP) 上的BH3 结构域结合 ,阻止底物进入 caspase-9 的活化位点 ,从而抑制 caspase-9 的活性。XIAP 对caspase-3 ,-7 的抑制

15、通过 BIR2 和 BIR1 之间的 Linker 实现的。三维结构显示 ,Linker 中第 144 ,147 和 148 位氨基酸残基特异地与 Caspase-3 ,-7 底物结合沟通过氢键和范德华力结合 ,产生空间位阻作用 ,占据催化位点 ,与 caspase 酶的底物产生竞争性抑制作用。Smac (second mitochondrial-derived activator of caspase ）的作用是在凋亡启动后 ,从线粒体膜释放入胞液以促进凋亡反应速度和强度 ,使凋亡顺利进行。Smac 的 N 端有一个类似与 Caspase-9 的 IAP 结合模体 ,从而通过氢键及疏水键与 IAPs 的BIR3 和 BIR2 结构域结合,而抑制 IAP 的功能。Smac 通过不同的方式对“启动”caspases 和“效应”caspases 产生作用。首先 ,对“启动”caspase 的激活是通过 Smac 上的 IAP 结合模体与 caspase-9 竞争结合到 XIAP-BIR3 结构域的相同部位 ,形成 Smac-XIAP 复合体 ,使 caspase-9 释出。其次 ,对“效应”caspase 的激活是因为 Smac 与 XIAP-BIR2 有更高亲和力 ,Smac 与 XIAP 结合改