6A型肺炎链球菌荚膜多糖水解物的制备及其结合物在小鼠体内免疫原性研究.docx

1、论著.6A型肺炎链球菌荚膜多糖水解物的制备及其结合物在小鼠体内免疫原性研究罗树权'，杨英英二张妊奇李献林杜娇'，胡浩'，刘佳二刘月萍李阿妮'，任珍芸I,刘爱萍'，侯亚莉I,谢贵林21.兰州生物制品研究所有限责任公司第一研究室甘谢省疫苗工程技术研究中心，甘肃兰州7300462.中国生物技术股份有限公司，北京100029摘要：目的制备6A型肺炎链球菌英膜多糖（PS6A）水解物及其结合物，研究结合物在小圈体内的免疫原性。方法在60Y水解温度下,筛选出PS6A水解适宜的酷酸水解浓度和水解时间。通过水解物和原糖（PS6A）的核磁共振氢谱（'HNMR）和磷谱

2、（31PNMR）比较验证水解物结构的正确性。以1-景基4二甲胺基毗喘四氟硼酸盐（1-Cyano-4-（dimethylamino）pyridiniumtetrafluoroborate,CDAP）活化水解物的羟基.并与破伤风类毒素己二酸酰麟衍生物（rrAH）结合，制备结合物ps6a-itah；并检测结合物的理化性质。通过抑制elisa分析原糖、水解物和结合物的抗原性。将小鼠分为2组（PS6A组和PS6A-TTah组），分别免疫3剂次,用间接EUSA分析原糖和结合物在小鼠体内的免疫原性。结果多糖经0.2mol/L醋酸60T水解8h后,其相对分子质量大小（、）由0.03升高为0.51,重均相对分子

3、质由8.127x10,"mol降为1.175x10sg/molo核磁共振结果表明,各特征质予的化学位移相比原糖未发生改变。结合物的游离多糖质址分数为4.55%,游离载体蛋白质质最分数为1.08%。抑制EUSA结果显示,水解物、结合物的抑制曲线与原糖基本吻合。PS6A-TTah组有剂次加强效应（P分别为0.001、0.004和0.001）,其第13针免后IgG抗体水平均高于PS6A组，差异均具有统计学意义（P分别为0.001、0.002和0.001）o结论制备的PS6A水解物能有效的保留天然多糖的特异基团，以此水解物制备的结合物在小鼠体内具有良好的免疫应答。关键词：6A型肺炎球菌荚膜多

4、糖;水解物;结合物;免疫原性中图分类号：378.5文献标志码：A文章编号：1005-5673（2017）06.0001-08DOI：10.13309/ki.pmi.2017.06.001Preparationofhydrolysateforserotype6ApneumococcalpolysaccharideandrelatedconjugateimmunogenicityinmiceLUOShu-quan,YANGYing-ying,ZHANGYu-qi,LIXian-lin,DUJiao,HUHao,LIUJia,LIUYue-ping,UA-ni,RENZhen-yun,LIUAi-p

5、ing,HOUYa-ii,XIEGui-lin.TheFirstResearchDepartmentinLanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,Ltd.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,GansuProvince,ChinaCorrespondingauthortXIEGui-lin,E-mail:glxieAbstract:ObjectiveTopreparethehydrolysateandconjugatefortype6Apneumococcalca

6、psularpolysaccharideandtoinvestigatetheimmunogenicityofconjugateinrnice.MethodsChoosethebestconcentrationandtimeofacidichydrolysisinordertodegradethemoleculeoftype6Apneumococcalcapsularpolysaccharideat60幻.Thestructureofhydrolysatewasvalidatedbasedonthe1HNMR,31PNMRbycomparingthepolysaccharidewithhydr

7、olysate.Thehydroxylofhydrolysatewasactivatedby1-Cyano-4-(dimethylamino)pyridiniumtetraHuoroborate(CDAP)andthenconjugatedwithTTAHinpreparationoftheconjugate.Thephysicalandchemicalcharacteristicsoftheconjugatewereanalyzed.TheantigenicityofPS6A,hydrolysate,andconjugatewasanalyzedaninhibitionELISA.Thete

8、stedmiceweredividedintwogroupsPS6Aand0.51,wasdegradedfrom8.127x10sg/molto1.175x10sg/mol.TheNMRresultsshowedthatconformationofhydrolysatedidnotchangecomparedtoPS6A.Thecontentforfreepolysaccharideandfreecarrierproteinfromtheconjugatewas4.55%and1.08%,respectively.Tlieantigenicityofhydrolysateandconjuga

9、temaintainedinsameincomparisonwithPS6AintheinhibitionELISAresults.Therewereboostresponsesinthreeconjugateinjections(P=0.001,0.004,0.001).IgGconcentrationofconjugategroupwashigherthanPS6Agroupforeachinjection(P=0.001,0.002,0.001).ConclusionThespecificnaturalgroupsofthepolysaccharidewereeffectivelymai

10、ntainedafterhydrolysis,onwhichthepreparedconjugatedevelopedhighlyimmuneresponsesinmice.基金项目：甘肃省科技重大专项计划（1602FKDA008）作者简介:罗树权（1982-）,男，助理研究员，主要从事细菌性疫苗的研发。通值作者:谢贵林,研究员，E-mail：glxie,conjugate,andimmunogenicityinmicewasanalyzedbyanindirectEUSAafterthreeinjections,respectively.ResultsThemoleculeoftype6Ap

11、neumococcalcapsularpolysaccharidewaseffectivelydegradedafterhydrolysedby0.2mol/Laceticacidat60X.for8hours,Thevaluewasdegradedfrom0.03toKeywords:Serotype6Apneumococcalcapsularpolysaccharide;Hydrolysate;Conjugate;Immunogenicity肺炎链球ftsl(Streptococcuspneumoniae)简称肺炎球曲(Pneumococcus),以人类为主要宿主，引起肺炎、脑膜炎、中耳炎

12、、败血症等侵袭性疾病。根据其荚膜多糖结构的差异，可分为94个血清型，其中30个血清型的菌株对人类致病，而6型(主要是6A和6B型)是重要的致病菌群。23价肺炎球菌多糖疫苗的应用能有效保护2岁以上(含2岁)儿童及成人免受侵袭性肺炎球曲的感染，但不适用于2岁以下婴幼儿，而该年龄段是肺炎球菌感染的高危人群。这是因为荚膜多糖抗原为T细胞非依赖性抗原，需与蛋白载体结合成为T细胞依赖性抗原才能对婴幼儿提供免疫保护。6A和6B型荚膜多糖为同分异构体，具有免疫学交叉反应性,但并非所有抗6B型抗体都具有功能性交又反应。2000年上市的7价肺炎球菌结合疫苗Prevenar®包含血清型4、6B、9V、14

13、、18C、19F、23F,大大降低了侵袭性肺炎的发病率，但并未明显降低6A型引起的侵袭性肺炎的发病率51o6B型肺炎球菌多糖及结合疫苗的调理吞噬结果显示,6B型多糖抗原诱导的IgG抗体对6A抗原反应很弱a”。同时,6A型菌株具有较高的抗生素耐药性*刃。因此，研发含有6A型肺炎球菌荚膜多糖(type6Apneumococcalcapsularpolysaccharide,以下简称PS6A)的疫苗对于肺炎球菌疾病的预防具有重要的意义。2010年上市的13价肺炎球菌结合疫苗Prevenar13®新增包括6A型在内的其他6种血清型。如图1所示,PS6A由半乳糖、葡萄糖、鼠李糖和。-核糖醇的四

14、糖重复单位构成。其中，鼠李糖与核糖醇的C3位置连接,O-核糖醇残基的C5位置上含有磷酸二酯键停)。图1PA6S基本重复单位化学结构图Fig.1BasicrepeatingunitstructureofPA6S天然的PS6A相对分子质量较大，其结合反应难于控制,且结合物易交联过大,不利于后续的分离纯化。利用过氧化氢能将多糖降解，但在降解过程中也发生了末端基团的富化，且由于过氧化氢性质活泼，导致水解物批间质量一致性不甚理想。研究中选择在较温和的温度(60P)和较低的酸浓度F水解，尽量减少水解过程对多糖重要基团和抗原表位的破坏,通过延长水解时间达到水解多糖的目的。同时，将降解多糖与破伤风类毒素(te

15、tanustoxoid,TT)和己二酸二酰®f(adipicaciddihydrazide,ADH)的衍生物(T1h)结合,结合物免疫小鼠后评估结合物诱导特异性IgG抗体水平。1材料与方法1.1多糖、蛋白、超免血清PS6A、TT、6A型肺炎球菌家兔免疫血清、精制破伤风抗毒素血清,均由兰州生物制品研究所有限责任公司制备。1.2实验动物NIH雌性小鼠，体质量：1214&SPF级，由兰州生物制品研究所有限责任公司实验动物室提供。1.3主要试剂及仪器碱性磷酸酶标记羊抗-鼠、羊抗-兔IgG,均购自美国Southembiotech公司;ELISA和抑制ELISA包被用多糖、血清吸收用C多

16、糖，均购自美国模式培养物保藏所；ADH、3.二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDAC-HC1)J-氤基-4-二甲胺基毗嚏四氟硼酸盐(CDAP)、三乙胺(TEA)、2,4,6.三硝基苯磺酸(TNBS)、乙腊、脱氧胆酸钠(DOC)、意:酮，均购自Sigma公司；冰醋酸、NaCl.NaOH.HCl,均购自国药集团化学试剂有限公司。超滤器、超滤膜和透析袋，均购自Millipore公司；凝胶层析系统购自GE公司；高压液相色谱仪购自美国Waters公司:DAWNHELEOS-口十八角激光散射仪.OptilabT-rEX示差检测器，均购自美国Wy-att公司；SepharoseCL-4B层析柱购自GE

17、公司；TSKG层析柱及其保护柱，均购自日本TOSOH公司;600MHz核磁共振谱仪购自布鲁克公司；SpectraMAX190酶标仪、96孔酶标板，均购自Costar公司。1.4多糖水解物的制备及检测1.4.1水解条件的筛选PS6A反应终质量浓度为5mg/mL,在60弋水浴条件下，分别以醋酸终浓度0.1mol/L水解1.5,2.5h,醋酸终浓度0.2mol/L水解2、4、8h0水解物中和pH后，经SepharoseCL-4B层析柱层析，测定其相对分子质量大小分布，并与水解前多糖分布比较。筛选标准:水解物的相对分子质量大小应介于0.450.55之间，其洗脱峰峰形应为左右对称的正态分布。1.4.2多

18、糖水解物的制备用1.4.1项选定的条件制备PS6A水解物(PS6A-hydrolysate,简称水解物)，比较多糖水解前后相对分子质量大小(谿)及重均相对分子质a(Mw)o1.4.3核磁共振分析通过NMK)和磷谱(叩NMR)分析水解物与原糖(PS6A)的结构。1.5结合物的制备1.5.1破伤风类毒素衍生物的制备采用EDAC缩合法，将TT用0.85%NaCl溶液稀释至终质量浓度为10mg/mL,然后将其加入等体积的0.9mol/LADH(溶于0.85%、aCl溶液)中，调节至pH6.5,加入EDAC使其终浓度为7.5mmoi/L,控制pH在6.5±0.1,反应2h,调节至pH8.0,终

19、止反应，用含0.85%NaCl溶液5000mL超滤至500mL,重复6次收集浓缩液，除菌过滤。1.5.2结合物的制备用0.85%NaCl溶液溶解PS6A水解物至10mg/mL,室温静置过夜.测初始pH并将其调至5.86.0之间。将CDAP以200mg/mL浓度溶于乙腊中，加入多糖降解物一半质量:的CDAP,维持pH5.86.0反应30so用TEA溶液(28|iLTEA+972jjlLWF1)将pH维持在7.3±0.5反应2min。按投入糖蛋白质量比为1:1加入TTah，维持PH8.0±0.2之间反应2ho反应结束后，将pH调至7.0,将反应物装入截留相对分子质量为10000

20、的透析袋中，以0.85%NaCl溶液为透析外液，透析2d,间隔12h置换透析液一次，此结合物称为PS6A-TTaho结合物透析后用Sepharose4FastFlow层析柱纯化，收集KdWO.2的洗脱液，流动相为0.85%NaCl溶液。将收集的洗脱液以0.22膜除菌过滤,收集滤过液。1.6结合物的理化，性质检测1.6.1结合物多糖及蛋白质含最多糖含量:采用慝酮硫酸法测定，蛋白质含量采用Lowry法测定。1.6.2游离多糖及游离蛋白质含量取结合物原液1mL,加入0.1mL1%脱氧胆酸钠(Sodiumdeoxycholate,DOC)溶液混匀后28乞放置30min,再加入501mol/L盐酸混匀后

21、于4X.20(XX)xg离心30min,取1mL上清液,测定上清液中多糖含虽,换算游离多糖含量。游离蛋白质含量用高压液相TSK-G3000S排阻层析测定，该层析柱能有效分离相对分子质是W500000的物质，相对分子质量500000的大分子不能进入凝胶颗粒内部，洗脱体积等于外水体积；而载体蛋白质TV因其相对分子质量为150()00左右，可以进入凝胶颗粒内部，实现结合物分子与载体蛋白质的有效分离。流动相为10mmol/L和pH7.2的磷酸盐缓冲液,进样量0.1mL,流速0.5mL/mino1.6.3分子大小运用SepharoseCL-4B凝胶过滤层析法对PS6A、多糖水解物、结合物的匕进行检测。使

22、用高效液相分子尺寸排阻层析-十八角激光散射仪(HPSEC-MALIS)联用法测定PS6A、水解物、结合物的似将高效液相色谱分离的样品流中的分子进行多个角度的激光照射，得到信号后经软件测算得到财“°PS6A采用TSKG5000PWXL层析柱，水解物采用TSKG4000PW.层析柱，结合物M*分析使用TSKG6000PWxl层析柱。流动相为10mmol/L和pH7.2的磷酸盐缓冲液，进样量0.1mL,流速0.5mL/mino1.7鉴别试验使用琼脂糖免疫双扩散法对结合物进行鉴别试验，方法参照中华人民共和国药典2015版（三部）“免疫双扩散法”执行。1.8抗原性的检测用抑制ELISA检测PS

23、6A、水解物、结合物的抗原性。以110pig/mLPS6A包被酶标板，每孔加入100于37乞放置5h后洗板5次，每孔加入200皿封闭液,37T放置2hc将不同浓度的待测样品溶液（PS6A或水解物，或结合物）60riL加入60J1L稀释后的超免血清中，每个样品浓度重复两孔，充分混合形成抗原-抗血清混合液，室温放置30min后，将此混合液100jiL加入酶标板,37Y放置2h,洗板5次。每孔加入100piL碱性磷酸酶标记羊抗-兔lgG,37T放置1h,洗板5次。每孔加入100jiL碱性磷酸酶底物，避光放置2ho每孔加入50mL3mol/LNaOH终止反应，读取人妣心值。以未吸附的超免血清为阳性对照

24、，未加血清的血清稀释液为阴性对照，吸附的血清为样品，阳性孔的4明烦值应在1-5-2.0之间，按如下公式计算抑制率：抑制率=“-y§X100%V405nm-405nmZ将多糖浓度和相应浓度下的抑制率输入Graph-Padprism软件，绘制抑制曲线。比较各样品EC50,EC50（50%Effectiveinhibitionconcentration）表示的是抑制率为50%时对应的样品浓度。1.9结合物免疫原性的研究1.9.1分组及免疫将小鼠随机分为2组（PS6A组和PS6A-TTah组），每组30只。经腹股沟皮下注射，免疫剂量为0.2口g/只，每隔2周免疫1次，共免疫3次。分别于每次免

25、疫后2周小鼠眼球采血，分离血清（计为第1针、第2针、第3针）。1.9.2抗PS6AIgG含量的检测用间接EL1SA测定血清抗PS6AIgG含量。将PS6A以1.0pig/mL包被于酶标板，每孔加入100|iL,37丁放置5h,洗板5次。向每孔中加入200皿血清后2倍比系列稀释，阳性血清起始稀释倍数为800倍,待测血清稀释后用塑料膜覆盖密封酶标板，放入湿盒,37°C放置2h,洗板5次.每孔加入100|iL碱性磷酸酶标记羊抗-鼠IgG,37°C放置2h,洗板5次。每孔加入100碱性磷酸酶底物，避光放置2h。每孔加入50jiL3mol/LNaOH终止反应，读取A蜘倾值。采用Sof

26、tmax软件分析中提供的四参数拟合法分析数据，阳性血清ELISA单位为800EU/mL,应用分析模板计算各样品的IgG含世。1.9.3统计学方法采用SPSS22.0软件对数据进行统计分析，免疫原性的比较采用单因素方差分析法计算P值,以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1多链水解物的制备().8注：A为PS6A；B为醋酸终浓度0.Imol/L水解1.5h；C为储酸终浓度0.Imol/L水解2.5h；D为艄酸终浓度0.2mol/L水解2h；E为船酸终浓度0.2mol/L水解4h；F为酪酸终浓度0.2mcl/L水解8h图26A型肺炎球菌多糖水解前后SepharoseCL-4B层析图Fi

27、g.2R)fileoftype6Apneumococcalpolysaccharideandthehydrolyzedpolysaccharidel)ySepharoseCL-4Behromatugraphy2.1.1水解条件的筛选及制备如图2所示水解前多糖的K。为0.03,其为8.I27xlO5g/mol,分布范围为3.650x10513.800x1（）5"mol。选择醋酸终浓度0.2mol/L60丁水解8h的水解物分布曲线呈正态分布为0.51,其吃为1.175xlO5g/mol,分布范围为0.240x1()53.777x105g/mol,所以选择此条件制备水解物。2.1.2核磁共

28、振分析如图3A所示,5.62ppm(1ppm=0.001%。)为半乳糖端基质子的化学位移,5.13ppm为葡萄糖端基质子的化学位移,5.05ppm为鼠李糖端基质子的化学位移,1.32ppm为鼠李糖甲基上质子的化学位移。图3B所示，以上3种质子的化学位移与原糖(图3A)完全一致。图3C所7K,0.86ppm的峰吸收值最高，其峰为PS6A的磷峰，同时还有3个小杂峰可见，化学位移分别为1.89ppm,0.30ppm和-0.19ppm,为C多糖峰。水解物的磷谱图(图3D)和原糖的磷谱图(图3C)完全相同。DUUUuluBillfl.|116543210-1-2-3-46543210-1-2-3-4pp

29、mppm注:图A为PS6A'HNMR；图B为PS6A水解物的*HNMR；图C为PS6A的"pNMR；图D为PS6A水解物的*PNMR。图3PS6A及水解物的'HNMR?'PNMR图潜Fig.31HNMRand31PNMRspectraofPS6Aandthehydrolysate2.2结合物的理化性质如表1所列，游离多糖含量为4.55%，游离蛋白质含量为1.08%,多糖蛋白比为0.82o如图4所示，PS6A.PS6A水解物、PS6A-TTah总糖及游离多糖经SepharoseCL-4B分离后的化学分布，表明制备的结合物纯化收取灼为0.2之前的部分可与游离多糖有

30、效分离。表16A型肺炎球菌结合物理化检测结果Tab.1Physicalandchemicaldeterminationoftype6Apneumococcalcapsularpolysaccharide-proteinconjugate结合物多糖质虫浓度(岫ml.)蛋白质质量浓度(jig/mL)游离多糖(%)游离蛋白质(%)虬(g/rnol)虬分布范围(g/mol)PS6A-TTah83.16101.454.551.088.558X1064.134xl06-1.535X107图4PS6A、水解物、结合物过SepharoseCL-4B的化学分布Fig.4ElutionprofilesofPS6A

31、xPS6A-hydrolysate,PS6A-1T<HbySepharoseCI-4B2.3鉴别试脸如图5所示，结合物同时能与PS6A免疫血清和1T免疫血清产生沉淀线，且两条沉淀线发生融合，说明多糖经水解再与蛋白载体结合后抗原性并未发生改变，多糖蛋白成功结合为结合物分子。4注：号乌斯必蓝染色孔I是6A塑肺炎球侑站合物原液:孔2-6A壁肺炎球俏超免清;孔3是档制破伤晚抗母索血清；孔4阴性对照0.85%aCI溶液图5结合物琼脂斯免疫双扩散Fig.5Agaros<*doubh*lininutxMliffusionofs<*n)ty|w6ApiiruiiKM-iwc-iil<*

32、apsularixilysacc'haridtpnihMnconjugah*2.4抗原性如图6所示,PS6A、水解物、结合物的抑制曲线均呈典型S形曲线。从PS6A、水解物及结合物的EC50及M对数值可以看出，水解物和结合物用抑制ELISA所测得抑制曲线均与多糖抑制曲线基本吻合。如表2所列，PS6A、水解物、结合物的EC50差异均不高于|倍，旦均可达到100%抑制说明多糖经水解和结合后抗原性没仃发生改变Igl多糖浓度(p.g/mL)|图6PS6A.水解物及结合物的抑制曲线Fig.6Inhibition<unrofPS6X.|M>ksaclihari<lehy<ln

33、>lysal<*andvonjiig.ih*表2PS6A.水解物及结合物的EC50及.对数伉Tab.2EC50andlogarithmvalueofPS6A.|M)lysa(-hhari(lfhydrolysiilcandconjugate样品E(3()(jig/mlJlgEC50(pig/ml.)PS6A0.3619-0.4414PS6A-hy<ln)lysatr0.27()7-0.5675PS6A-Trui0.2016-0.69552.5免疫原性如表3所列,PS6A组3针免疫无剂次加强效应；PS6A-TTaii组3针之间有明显剂次加强效应（P分别为0.001.0.004和

34、0.001）,免疫后组内3针间比较差异均有统计学意义（F<0.05）。PS6A-TTah组与PS6A组第13针免后IgG抗体水平差异均具有统计学意义（P分别为0.001.0.002和0.001）。表明与PS6A组相比，PS6A-TTah组能够诱导更高水平的PS6A抗体。表3PS6A与结合物免疫小鼠后诱导的血清抗PS6AIgG含量Tab.3Thecontentofanti-PS6AIgGinmiceserunisinducedbyPS6Aandconjugateinjections针次抗PS6AIgG含量PS6A组PS6A-TTah组第1针0.2(0.10.3)3.86(3.0-5.0)第

35、2针0.5(0.31.4)40.81(15.0-107.0)第3针0.4(0.51.7)462.79(119.01792.0)注：（）内为95%置信区间的上下限。3讨论为了尽量减少水解过程对多糖抗原基团的影响，研究中采用相对比较温和的醋酸水解的方法制备PS6A水解物。选用温度60因为过高的温度除了可能改变多糖的抗原性外还不易控制，对后期规模进一步放大有一定的阻碍。研究中选用的酸浓度也较低,分别为0.1mol/L和0.2mol/L,通过延长酸水解反应的时间来达到水解的目的。结果显O）-P-Cho示,终浓度0.2mol/L醋酸60Y水解8h的降解条件可以得到合格的水解物，而旦磷酸二酯键在此过程中未

36、受影响，得以完全保留。'HNMR（600MHz）是根据多糖上氢核在一定磁感应强度下吸收了频率适当的能量而发生跃迁形成核磁共振现象，在仪器中便可记录下其吸收的图谱。氢根据其在多糖分子中所处的化学环境不同，发生共振吸收的频率也稍有差异。在旧NMR图谱中，峰的强度与氢核的数目成正比，由吸收峰的面积可以计算氢的相对比例或数目，因此该方法可以测定多糖化学结构、官能团种类和含量以及杂质分子HNMR（600MHz）上的特征质子的信号反映了不同型多糖化学结构上的氢的化学位移和数量，故根据这些特征性质子位移可以达到对肺炎球菌多糖型鉴别的目的。为了验证研究中制备的6A型水解物结构的正确性,采用了旧NMRL

37、pNMR对原糖和水解物结构进行了比较。'HNMR结果显示,PS6A*HNMR图与其他文献报道的PS6A*HNMR结果完全相同m-E,PS6A与其水解物的旧NMR结果完全相同。3】PNMR结果显示,其峰为PS6A的磷峰，同时还可见3个小杂峰。众所周知，在肺炎球菌多糖的提取及纯化过程中C多糖的存在是一个不可忽略的问题,C多糖具有12个磷脂酰胆碱,1个磷酸重复单位的五糖g,结构如图7所示，具体表现为该图谱的3个小峰:化学位移分别为1.89ppm、0.30ppm和-0.19ppm,与文献15报道的PS6A31PNMR结果相一致。6A水解物的磷谱和原糖的磷谱完全相同，结合相应的氢谱，说明在水解过

38、程中，并未引入新的官能团，且未发生磷酸二酯键的断裂。O）-P-Cho666)-3-Glcp-(1*3)-a-AATGp-(l*4)-a-GalpNAc-(l*3)-g-GalpNAc-(11)-ribitol-5-P-(O图7肺炎球菌C多糖的化学结构Fig.7ChemicalstructureofpneumococcalCpolysaccharide相比直接使用原糖结合，由PS6A水解物制备的结合物更有利于与游离多糖间的分离纯化，且结合物的分子大小更易控制。研究中同时采用Sepha-roseCL-4B和HPSEC-MALLS两种方法测定水解物及结合物的分子大小，能够更直观、更精确的对水解物和结

39、合物的分子大小进行分析。研究中将水解物通过CDAP活化,EDAC缩合与ttah结合，制备成结合物,通过结合物的免疫原性可进一步评估水解物制备条件的正确性。通过抑制ELISA评价从原糖、水解物、结合物的抗原性变化，通过间接ELISA测定结合物免疫小鼠后IgG抗体水平评价结合物的免疫原性。从抑制ELISA结果看，多糖经水解和结合等多个步骤,抗原性并无明显差异，表明多糖上抗原表位未发生变化。间接ELISA显示结合物免疫小鼠能够诱导更高的抗PS6AIgG抗体水平，呈剂次加强，在小鼠体内产生了良好的免疫应答。综上所述，研究中成功制备了6A型肺炎球菌多糖水解物，水解条件较为温和、易放大，且水解过程中无抗原

40、表位的破坏，能有效的保留天然多糖的特异基团；以此水解物制备的结合物在小鼠体内具有良好的免疫原性。为6A型肺炎球菌多糖水解物的制备及肺炎球菌结合疫苗的制备提供参考。参考文献LUDWIGE,BONANNIP,ROHDEG,etal.Theremainingchallengesofpneumococcaldiseaseinadults(J.EurRespirRev,2012,21(123)：57-65.1 LYUS,HUHL,YANGYH.AsystematicreviewaboutStreptococcuspneumoniaeserotypedistributioninchildreninmain

41、landofChinabeforethePCV13waslicensed(J.ExpertRevVaccines,2017,16(10)：997-1003.3王剑虹，江丽君.肺炎链球菌疫苗研究进展J.国际生物制品学杂志，2012,35(1):37-40.4 WHITNEYCG,FARLEYMM,HADLERJ,etal.Declineininvasivepneumococcaldiseaseaftertheintroductionofprotein-pol-ysaccharideconjugatevaccineJ.NF'nglJMed,2003,348(18):1737-1746.5

42、D1NLEYICIEC,YARGICZA.Pneumococcalconjugatedvaccines：impactofPCV-7andnewachievementsinthepostvaccineeraJ.ExpertRevVaccines,2008,7(9)：1367-1394.6 VAKEVAINENM,EKLUNDC,ESKOLAJ,etal.Cross-reactivityofantibodiestotype6Band6ApolysaccharidesofStreptococcuspMumonia,evokedbypneumococcalconjugatevaccines,inin-

43、fantsJ.InfectDis,2001,184(6)：789-793.7 EKSTROMN,KILPIT,LAHDENKARIM,etal.Immuneresponsetocross-reactingpneumococcalserotypes6A/6Band19A/19FintheFinOMvaccinetrialR.Santiago：ThirdWorldofCongressofPediatricInfectiousDiseases,2003.8 WHITNEYCG,FARLEYMM,HADLERJ,etal.Increasingprevalenceofmultidrug-resistantStreptococcuspneumoniaintheU-nitedStalest