《梨黑斑病的LAMP检测方法》

1、ICS65.020.20B 16 DB安徽省地方标准DB XX/ XXXXXXXXX梨黑斑病的LAMP检测方法Detection of pear black spot using LAMP methodXXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施安徽省质量技术监督局发布DBXX/ XXXXXXXXX前言本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 本文件由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所提出。本文件由安徽省农业农村厅归口。本文件起草单位：安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所、安徽省农业科学院园艺

2、研究所。本文件起草人：杨雪，谷春艳，潘锐，徐会永，臧昊昱，戚仁德，高正辉，齐永杰。7梨黑斑病的LAMP检测方法1 范围本标准规定了梨黑斑病的LAMP检测方法。本标准适用于我省梨黑斑病检测的组织和人员。2 规范性引用文件下列文件中条款，通过在本规程的引用而成为本规程的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规程，然而，鼓励根据本规程达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规程。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3梨黑斑病的基本信息梨黑斑病的病原菌，发病症状参见附录A。4方法原理根据梨黑斑

3、病病原菌的cytb序列设计的特异性引物进行LAMP检测作为判断梨黑斑病的依据。根据梨黑斑病菌的形态特征和对寄主造成的发病症状特征为依据。5 仪器设备 5.1 高速离心机：转速15000r/min5.2 涡旋振荡器5.3 恒温金属浴5.4 显微镜：物镜头10405.5 光照培养箱：20305.6 冰箱：4-20、-805.7 高压灭菌锅5.8 电泳仪5.9 凝胶成像仪5.10 可调移液器:1-10L，10L-100L，100L-1000L5.11 玻璃或一次性塑料培养皿5.12 天平：精度0.001g5.13 玻璃三角瓶5.14 超级工作台6试剂和培养基6.1 CTAB提取液（参见附录B）6.2

4、 Bst DNA聚合酶6.3 无水乙醇6.4 10%SDS6.5 酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）6.6 氯仿6.7 异丙醇6.8 TE（pH8.0）6.9 TAE电泳缓冲液 (pH8.5)6.10 WA培养基（参见附录B）6.11 PDA培养基（参见附录B）6.12 甜菜碱6.13 显色剂SYBR Green I除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T 6682中三级水的标准。7 梨黑斑病的LAMP检测7.1 病原菌分离与纯化将梨病果用75%乙醇表面消毒后，于病健交界处取少量组织置于WA培养基中培养。待长出菌丝后，切取一小块放在PDA培养基中于28 培养7天左右，收

5、集菌丝于4 备用。7.2供试DNA提取取少量菌丝粉，加入900L 2% CTAB提取液和90L 10%SDS，涡旋混匀，于60水浴1h，期间每隔10 min上下颠倒几次，常温条件下12000 rpm离心10 min；取上清，加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，常温条件下12000 rpm离心5 min；将上清转移至新的EP管中，加入等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，常温条件下12000 rpm离心5 min；上清转移至新EP管中，加入1倍于上清体积的异丙醇，-20条件沉淀15 min；常温条件下12000 rpm离心5 min，倾去上清，沉淀用70%乙醇洗涤2次，37条件下待乙醇挥

6、发干；加适量灭菌超纯水或者TE（pH8.0）溶解沉淀（含20 g/ml RNase），37消解30 min后电泳检测，-20保存备用。或采用市售真菌DNA提取试剂盒，按照相应操作说明书提取DNA备用。7.3 引物设计通过对GenBank中的序列信息进行比对分析，选择cytb作为目标基因，并通过在线网站（http:/primerexplorer.jp/e/）设计检测梨黑斑病的LAMP检测特异性引物组。F3：5- GGCTCCTTTGAATGGTAAC -3；B3：5- TGTCTTCAACCAAGCATCA -3；FIP：5- CGCTGCAAGTAATCTATAAATCGGATTCAATAGG

7、CAAATGGGGA -3；BIP：5- AATGGATCAAGAACGTTCAACGAATTGGTTGTGGGGTACTC -3。7.4 LAMP检测体系LAMP扩增反应体系总体积为20 L，由下列浓度体积的组分组成：名称 浓度 加入量F3 10 M 0.6 LB3 10 M 0.6 LFIP 40 M 0.6 LBIP 40 M 0.6LMgCl2 25 mM 3.2 LBetaine 4M 1.6LdNTPs 10 mM 2.0 LBst DNA聚合酶 8 U/L 0.8L10ThermoPol 2.5 LDNA 模板 40 ng /L 1L，用无菌双蒸水补充扩增体系体积至20 L。LA

8、MP 扩增的反应条件为：65 保温60 min。8结果判定LAMP 扩增反应结束按照以下任意一种方式观察结果 ：1) 向扩增产物中加入显色剂SYBR Green I，轻晃混匀，观察颜色变化；2) 取扩增产物在3 %琼脂糖凝胶电泳中低压电泳，观察扩增条带。如果LAMP扩增产物显示黄绿色，电泳图谱为梯状条带，表明含有链格孢菌；如果扩增产物为橙红色，电泳图谱无扩增条带，表明不含有链格孢菌（参见附录C）。同时，根据科赫氏法则，用分离的病原菌接种于健康梨叶或梨果诱导发病后，发病症状与田间梨黑斑病自然发病症状一致，且可分离出相同病原菌，则判定分离的病原菌为梨黑斑病致病菌。9 样品、菌株保存检测鉴定后保存样

9、品，以备复验、谈判和仲裁。由鉴定人标识确认、样品管理员登记，置于超低温冰箱保存。保存期满，需经灭菌后方可处理。附录A（资料性附录）梨黑斑病的基本信息A.1梨黑斑病的病原菌梨黑斑病是由链格孢（Alternaria spp.）类真菌引起的，目前世界上已报道的从梨果实上分离到的链格孢共有9组，已命名的有9个种（张天宇，2003；Roberts，1993；Roberts, 2005；Roberts, 2007）。在中国已报道的有6个种，分别是梨黑斑链格孢（Alternaria gaisen K. Nagan）、链格孢（A. alternata (Fr.) Keissler）、细极链格孢（A. tenu

10、issima）、侵染链格孢（A. infectoria）、鸭梨侵染链格孢（A. yaliinficiens R. G. Roberts）和（A. ventricosa R. G. Roberts）。其中A. gaisen既能侵染梨叶片也能侵染梨果实，被认为是我国梨黑斑病的主要致病种。而根据文献报导以及我们近年来从砀山酥梨果实上分离的梨黑斑病菌的结果表明，A. alternata是梨果实黑斑病上的主要病原菌。A.2 梨黑斑病的病害症状该病主要危害果实、叶和新梢。叶部受害，幼叶先发病、褐至黑褐色圆形斑点，后逐渐扩大，形成近圆形或不规则形病斑，中心灰白至灰褐色，边缘黑褐色，有时有轮纹。病叶即焦枯、畸

11、形，早期脱落。天气潮湿时， 病斑表面产生黑色霉层。即病菌的分生孢子梗和分生孢子。果实受害，果面出现一至数个黑色斑点，渐扩大，颜色变浅，形成浅褐至灰褐色圆形病斑，略凹陷。发病后期病果畸形、龟裂，裂缝可深达果心，果面和裂缝内产生黑霉，并常常引起落果。果实近成熟期染病，前期表现与幼果相似，但病斑较大黑褐色，后期果肉软腐而脱落。新梢发病，病斑圆形或椭圆形、纺锤形、淡褐色或黑褐色、略凹陷、易折断。西洋梨、日本梨、酥梨、雪花梨最易感病，发病严重时会引起早期落叶和嫩梢枯死，致使裂果和早期落果，严重削弱树势，降低树体的生长势和抗病能力，降低树体的生长势和抗病能力。A.3分布在中国主要梨区普遍发生。附录B（资料

12、性附录）试剂和培养基B.1 2CTAB 提取液B.1.1 100mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)B.1.2 20mmol/L EDTAB.1.3 1.4mol/L NaClB.1.4 2%(w/v)CTABB.1.5 40mmol/L 巯基乙醇(用时加入) B.2 TE缓冲液B.2.1 10mmol/L Tris-HCL （pH8.0）B.2.2 1mmol/L EDTA B.3 TAE电泳缓冲液(pH8.5)配方(50 x)B.3.1 Tris 242 gB.3.2 Na2EDTA2H20 37.5 gB.3.3 冰乙酸 57.1 mLB.3.4 水 1000mLB.4 WA培养基：1000毫升体系B.4.1琼脂粉 20gB.4.2水 1000 mL注： 121高压灭菌30分钟。B.5 PDA培养基：1000毫升体系B.5.1 马铃薯（去皮） 200克B.5.2 蔗糖（或葡萄糖） 20克B.5.3 琼脂粉 20克B.5.4水补足至1