核酸适体结构转换荧光法检测黄曲霉毒素B1

1、1 1 / / 7 7核酸适体结构转换荧光法检测黄曲霉毒素班珺,谢岩黎1*（河南工业大学粮油食品学院，郑州）（河南省粮油食品安全检测与控制重点实验室，郑州）（广西崇左市食品药品监督管理局崇左市食品药品检验所，崇左）摘要基于黄曲霉毒素（，）与互补链竞争结合核酸适体的位点使荧光恢复，建立了核酸适体结构转换荧光法 检测。以为工作液，核酸适体与猝灭链反应后加入孵育，利用荧光分光光度计检测到的荧光恢复程度对进行 定量检测，可获得该方法的最佳效果。 在优化条件下， 检测浓度范围为，检出限为。对该检测方法的特异性进行考察，结果表明该法具有良好的特异性。对花生、玉米实际样品进行检测，回收率在一之间。矚慫润厲钐

2、瘗睞枥庑赖賃軔朧。关键词核酸适体曲霉毒素荧光检测中图分类号：文献标志码：聞創沟燴鐺險爱氇谴净祸測樅。*5（,）残骛楼諍锩瀨濟溆塹籟婭骤東。（,）酽锕极額閉镇桧猪訣锥顧荭钯。（,）彈贸摄尔霁毙攬砖卤庑诒尔肤。,.謀荞抟箧飆鐸怼类蒋薔點鉍杂。厦礴恳蹒骈時盡继價骚卺癩龔。黄曲霉毒素是由黄曲霉、特曲霉以及寄生曲霉等产生的一类含有二氢呋喃环结构的次生代谢产物,。在已分离出的余种黄曲霉毒素中，黄曲霉毒素（，）致癌性最强，被认为是诱发恶性肿瘤原发性肝细胞癌（，）的主要因素之一。为保障食品安全及人类健康，对我国食品中的限量规定为：花生、玉米及其制品Wp稻谷、糙米、大米、植物油脂W，谷物类、豆类、坚果类、酿造调

3、味品W。长期以来，科研工作者为的检测探索了许多方法，常见的传统方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、液质联用法、酶联免疫吸附法等，新兴的检测方法有电化学免疫传感器、化学发光免疫法卜太赫兹光谱法、核酸适体法等，这些方法的产生极大丰富了的检测。当前针对的检测方法众多，每种方法各有其优缺点，仪器检测法灵敏度高、结果较为可靠， 但所需仪器昂贵、前处理复杂繁琐，不便于大批量检测；免疫学法检测速度快、操作简单，但所用的抗体制 备成本高，保存条件苛刻，批间质量不一，易出现假阳性。因此，开发高效、便捷、灵敏的检测方法成为当 务之急。茕桢广鳓鯡选块网羈泪镀齐鈞。核酸适体（）是采用指数富集配体系统进化技术（）从体外人

4、工合成的单链核酸文库中筛选出能与靶物质 高特异性、高亲和力结合的寡核苷酸片段,。核酸适体因其靶物质范围广、亲和力高、特异性强等特点，在毒素卜蛋白卜激素卜农药、金属离子卜细胞等的检测领域成为重要工具。目前，基于核酸适体的检 测方法，如纳米金法、化学发光法、电化学法等相继报道。鹅娅尽損鹌惨歷茏鴛賴縈诘聾。本研究根据核酸适体结构转换信号检测靶分子的原理，将标记有羧基荧光素（，）的核酸适体与标记猝灭基团（，）的核酸适体互补链配对杂交，通过竞争结合核酸适体的位点使荧光恢复，建立了基于核酸适体 结构转换荧光法检测的方法。籟丛妈羥为贍债蛏练淨槠挞曉。材料与方法仪器与试剂荧光分光光度计（美国公司），实验测定参

5、数：激发波长，发射波长，激发狭缝，发射狭缝。預頌圣鉉儐歲基金项目：河南省科技厅科技攻关项目（162102310084）;郑州市科技局新兴产业研究计划项目（20XX0503）收稿日期：2018-04-02作者简介：班珺，女，1992 年岀生，硕士，食品安全检测技术通信作者：谢岩黎，女，1971 年岀生，教授，食品营养与安全龈讶骅籴買闥龅。2 2 / / 7 7黄曲霉毒素 （）、 赭曲霉毒素 （）、 雪腐镰刀菌烯醇 （） 标准品 （公司）； 玉米赤霉烯酮 （） 标准品 （北京普 天同创生物科技有限公司）；? ?、 、 、 、 、 、 、三羟甲基氨基甲烷等（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司） 。

6、 实验用水均为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。渗釤呛俨匀谔鱉调硯錦鋇絨钞。实验所用核酸适体及其互补链均由上海生工生物工程有限公司合成并经纯化，序列如下：核酸适体： ；猝灭 链： ；核酸适体： ；猝灭链： 。铙誅卧泻噦圣骋贶頂廡缝勵罴。实验方法 荧光基团标记位置及工作液的选择 以为工作液，比较荧光基团标记核酸适体不同端位对荧光恢复情况的影响，选择荧光恢复率最佳的核酸适体 链，以为工作液测定检测系统的荧光恢复率，比较不同工作液对荧光恢复情况的影响。通过（）（）求荧光增长率，其中为猝灭状态时的荧光强度，为加入毒素后的荧光强度。擁締凤袜备訊顎轮烂蔷報赢无。猝灭链浓度的选择 用工作液将标记的猝灭链配制

7、成、 、，分别与标记核酸适体反应并测定其荧光强度，观察不同浓度互补 链对核酸适体荧光基团的猝灭程度。贓熱俣阃歲匱阊邺镓騷鯛汉鼉。反应时间的优化 将核酸适体与猝灭链反应后，向反应体系加入 并记录其加入反应体系、 、后的荧光强度，选择最适反应 时间。坛摶乡囂忏蒌鍥铃氈淚跻馱釣。的定量检测用缓冲液将核酸适体、猝灭链配制成，将母液稀释成、 、，在优化好的检测体系中进行标准曲线的建立。卩核酸适体与 卩猝灭链反应后，将 卩一系列不同浓度的标准液加入反应体系，充分反应后测定其荧光强度， 以浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标建立荧光法检测的标准曲线。蜡變黲癟報伥铉锚鈰赘籜葦繯。方法特异性考察将赭曲霉毒素（） 、玉

8、米赤霉烯酮（） 、雪腐镰刀菌烯醇（）配制成。以作为工作液，将核酸适体与猝灭链反 应，分别向反应体系中加入 、 ，平衡孵育后采用荧光分光光度计测定荧光强度。通过（）（）对该检测方法的特异性进行分析，其中为猝灭状态时的荧光强度，为加入毒素后的荧光强度。買鲷鴯譖昙膚遙闫撷凄届嬌擻。样品测定将花生、玉米粉碎，过目筛，称取 样品，以 乙腈水（）为提取液高速均质 ，高速离心 后取上清液，氮 吹仪吹干提取液，加入 工作液复溶，采用优化好的检测方法测定样品的初始浓度。回收实验中，向样品加入不同量的，使样品含分别为、卩，采用优化好的检测方法检测加标后的检测浓度，以（）（）加标浓度计算回收率。綾镝鯛駕櫬鹕踪韦辚糴

9、飙钪麦。结果与讨论实验原理 检测原理如图所示，竞争结合核酸适体的位点，导致猝灭基团标记的核酸互补链脱落，核酸适体构象发生改 变，检测体系荧光恢复，根据荧光强度变化对进行定量检测。检测系统初始状态为标记荧光基团（）的核酸 适体与标记猝灭基团（）的互补链通过碱基互补配对结合，由于二者之间距离很近，导致被猝灭，检测体系 处于弱荧光的猝灭状态。当待测物中含，将与核酸适体发生特异性结合，核酸适体结构的改变迫使互补链从 核酸适体上脱落，使荧光基团与猝灭基团的距离变远， 检测体系中荧光强度得以恢复。 当待测物中无存在时， 核酸适体结构不发生变化，荧光强度维持初始的猝灭状态。驅踬髏彦浃绥譎饴憂锦諑琼针。3 3

10、 / / 7 7图检测原理示意图荧光基团标记位置及工作液的选择实验对荧光基团标记核酸适体端位及反应体系的工作液进行了研究。核酸适体为端标记的寡核苷酸序列，核酸适体为端标记的寡核苷酸序列。图为等浓度核酸适体、核酸适体于不同工作液中的荧光强度比较，图为核酸适体、核酸适体在猝灭状态加入后的荧光增长率。由图、图比较可知，工作液为时，等浓度的核酸适体荧光强度高于核酸适体，造成该结果的原因可能为核酸适体末端的鸟嘌呤对荧光基团产生了一定的猝灭作用，荧光强度较标记在端序列的荧光强度弱。当加入猝灭链使猝灭后加入，核酸适体的荧光增长率（）明显高于核酸适体的荧光增长率（），该结果表明标记在端的核酸适体较标记在端的核

11、酸适体更有利于与结合，这 与核酸适体自身形成的空间位阻及有效识别区域有关。猫虿驢绘燈鮒诛髅貺庑献鵬缩。以核酸适体进一步研究工作液对荧光强度的影响，由图可知，等浓度核酸适体下，以为工作液的荧光强度略高于以为工作液的荧光强度，当加入猝灭链使均猝灭后加入，以为工作液的核酸适体荧光增长率（）高于以为工作液的荧光增长率（）（图）。上述结果表明以为工作液更有利于的荧光发生，也更有利于与核酸适体的结合。综合考虑，选择核酸适体并以为工作液进行后续实验探究。锹籁饗迳琐筆襖鸥娅薔嗚訝摈。鷯。猝灭链浓度的选择向核酸适体中加入一系列浓度（、）猝灭链，充分反应后测定荧光强度如图所示。猝灭链在至时，随 着浓度的增加，反应

12、体系中荧光强度迅速降低，当猝灭链浓度为时，反应体系中的荧光强度已被猝灭，继续 加大猝灭链浓度，反应体系的荧光强度仍呈减弱状态，但变化趋势向缓。为防止猝灭链浓度过大对竞争核酸 适体的结合位点造成影响，实验最终选择作为猝灭链最适浓度进行后续研究。輒峄陽檉簖疖網儂號泶蛴镧釃。4 4 / / 7 7400 -度300 -强光200 r荧100 -100150200250猝 灭链浓 度(nmol/L)图猝灭链浓度的优化 反应时间的优化核酸适体与猝灭链反应后，向反应体系加入加入后的至，荧光强度迅速增强，说明随着反应时间的增加，与核酸适体结合越充分，与之间的距离变得越 远，荧光强度越强。加入后，荧光强度较时

13、略微增强但程度趋缓，从检测效率的角度考虑，最终选择为与核 酸适体最适反应时间。尧侧閆繭絳闕绚勵蜆贅瀝纰縭。图反应时间的优化的定量检测在优化好的检测体系中对一系列浓度进行检测，图为.加入反应体系后的荧光光谱图。由图可知，随着浓度的增加，与距离变远，反应体系由猝灭状态开始恢复荧光，浓度越大，荧光强度越强。结果表明，在浓度范围内与反应体系荧光强度具有良好的线性关系，线性方程为()，以空白样品均值的倍标准偏差除以标准曲线斜率计算得到该检测方法的理论检出限为。识饒鎂錕缢灩筧嚌俨淒侬减攙。，图为加入反应体系后的、后的荧光强度。由图看出，在5 5 / / 7 7图方法选择性考察回收率以花生、玉米为样本向其中添加标准品，使浓度分别为、卩，采用本文建立的方法进行检测，实验结果如表所示，花生中的回收率为之间，玉米中的回收率为之间，效果良好。恥諤銪灭萦欢煬鞏鹜錦聰櫻郐。表实际样品的测定样品加标浓度（Q实测浓度（）（）（Q回收率（）花生玉米结论利 用 核 酸 适 体 能 对 靶 物 质 特 异 性 结 合 迫 使 互 补 链 解 离 的 作 用 ， 建 立 了 核 酸 适 体 识 别 荧 光 恢 复 检 测 法 。 该 法 操特异性为考察本方