变性梯度凝胶电泳技术的应用

1、变性梯度凝胶电泳技术在废水生物处理领域中的应用*汪文斌第一作者：汪文斌，男，1980年生，本科，工程师，主要从事环境影响评价和工业废水处理设计。#通讯作者。*国家自然科学基金资助项目 (No.30470039)；高等学校博士学科点专项科研基金资助项目 (No.)。 郑 昱2 朱 亮3#（1.湖州市环境科学研究所，浙江 湖州 313000；2.湖州市能源监察支队，浙江 湖州 313000；3.浙江大学环境与资源学院，浙江 杭州 310029）摘要 变性梯度凝胶电泳(DGGE)具有可靠性强、重复性好、操作便捷等特点，已被广泛应用于环境微生物领域群落结构多样性、动态分析以及功能菌群检测等领域。鉴于生

2、物处理是目前废水处理处置中的主体工艺，通过DGGE技术研究来分析废水生物处理系统中的微生物种群多样性与群落结构动态演替，可对废水生物处理系统起到最优化设计与工程调控的指导作用。综述了DGGE技术在废水生物处理领域的研究与应用，并探讨了该技术在实际应用中存在的问题及其发展前景。关键词 变性梯度凝胶电泳 废水生物处理 微生物群落结构Application of DGGE in biological degradation for wastewater treatment Wang Wenbin1，Zheng Yu2，Zhu Liang3 (1.Environmental Science Resea

3、rch Institute, Huzhou Zhejiang 313000；2.Energy Sources Supervision Detachment, Huzhou Zhejiang 313000；3. College of environmental and resource sciences of Zhejiang University, Hangzhou Zhejiang 310029)Abstract: Biological degradation is the important process in wastewater treatment. According to den

4、aturing of gradient gel electrophoresis (DGGE) analyzing of genetic diversity and monitoring the dynamic of microbial community, the proper wastewater treatment processes can be designed and controlled. The application of DGGE in study on biological degradation for wastewater treatment was strengthe

5、ned. In application in microbial ecology, the problems and progresses of the technology were discussed.Keywords: denaturing of gradient gel electrophoresis (DGGE)；biological wastewater treatment；microbial community生物处理是目前废水处理处置中的主体工艺，具有运行成本低、操作简便、出水水质好等优点，已被广泛应用于工业废水和城市污水的处理中。然而，废水生物处理工艺仍存在污泥膨胀、难降解有

6、毒污染物导致处理系统崩溃、运行容易失稳等问题，因此深入了解废水生物处理系统主体活性污泥及生物膜等的微生物生态系统的区系组成、动态变化以及功能菌群，解析群落结构、功能菌群丰度与系统运行性能之间的关系，已成为国内外学者的研究新热点1，2。微生物分离培养和显微镜技术等传统微生物学方法，在研究复杂的微生态系统过程中存在很大的局限性，不能全面、准确地表征微生物多样性、种群结构以及菌群演替等生态特性；而DNA指纹图谱，如变性梯度凝胶电泳（DGGE）3、温度梯度凝胶电泳（TGGE）3、单链构象多态性技术（SSCP）4、末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）5、扩增核糖体DNA限制性酶切片段分析（ARDRA

7、）6等分子生物学技术的应用，大大拓宽了微生物分子生态学的研究视野，将废水生物处理领域的研究带入了一个革命性的新时代。近年来，DGGE技术因其可靠性高、分析速度快、操作简单等特点，广泛用于分析活性污泥、生物膜的微生物遗传多样性以及群落动态演替。本文在简述DGGE技术基本原理的基础上，对该技术在废水生物处理领域的应用研究进行了综述。1 DGGE技术原理DGGE是由FISCHER和LERMAN创立的用于DNA突变检测的一种电泳技术，其原理是基于不同序列的DNA片段具有不同的双螺旋解链温度（Tm），DNA在变性剂浓度呈线性梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳到与Tm值相对应的变性剂浓度点时，双链DNA分子解旋变

8、性导致电泳速度急剧下降，最终停留在凝胶中其相应的变性剂浓度位置，形成分散的条带。该技术可分辨具有相同或相近分子量的DNA片段序列差异，可达到一个核苷酸水平的突变检出率7。通常，DGGE分为垂直和水平两种电泳形式。垂直电泳是指变性剂梯度方向与电泳方向垂直，主要用于确定DNA片段分离的最佳变性剂梯度范围；水平电泳的变性剂梯度方向与电泳方向平行，根据垂直电泳确定的范围可进行多个样品的同时分析。DGGE技术主要步骤如下：总DNA提取及纯化；目标DNA片段PCR扩增；确定最佳变性剂梯度范围、电泳时间和温度8；PCR产物DGGE分析。2 DGGE在废水生物处理微生物生态学研究中的应用进展1993年，MUY

9、ER等9率先报道将DGGE技术用于微生物群落结构研究，此后十多年，该技术广泛应用于微生物分子生态学的研究，笔者就其在废水生物处理领域的应用进展进行简要介绍。2.1 污泥种群多样性分析目前，DGGE技术已广泛应用于环境样品的微生物群落结构或者特异种群多样性分析。LAPARA等10采用DGGE技术对七段法（4个高温处理过程和3个中温处理过程）生物处理制药废水过程微生物种群多样性进行了分析，结果表明，中温池污泥样品的指纹图谱条带丰度要明显高于高温池内的污泥样品，表明反应体系温度的升高会减少微生物多样性。KASONEN等11对处理含硫酸盐废水流化床反应器（FBR）内不同基质条件下的污泥微生物群落结构D

10、GGE图谱分析发现，以乳酸为电子供体的FBR内污泥菌群结构要比以乙醇为电子供体更为复杂。DAR等12应用嵌套式PCRDGGE技术分析活性污泥中硫酸盐还原菌（SRB）多样性发现，该技术可检测丰度较低的功能菌群，使其在环境样品分子生态监测中更具有实际意义。BOON等13采用嵌套式PCRDGGE分析不同废水处理厂活性污泥菌群结构发现，活性污泥形态与易引起泡沫和污泥膨胀的Actinomycetes、氨氧化菌（AOB）及Acidobacterium等菌群的丰度差异和群落组成具有相关性。在此基础上，对DGGE图谱的目标条带进行割胶、回收、克隆测序可以获得更多基因水平上的遗传信息以进行开展系统发育分析，所测

11、得的序列信息可设计寡核苷酸探针来进一步研究功能菌群空间结构。FANG等14首次对产酸反应器中的产氢颗粒污泥（HPG）进行DGGE图谱分析，发现HPG内菌群结构较为单一，基本以低G+C革兰氏阳性菌为主，包括Clostridium、Bacillus、Staphylococcus、Papillibacter cinnamivorans等。ZEIN等15研究生物浓缩反应器(BCR)处理含甲基叔丁基醚(MtBE)废水过程发现，该反应器内微生物种群多样性较丰富，包括-、-、-及-Proteobacteria等菌群，优势菌为Hyphomicrobium、 Methylobacterium、Sphingomo

12、nas、Pseudomonas和Halomonas等，复杂的微生物群落结构保证了反应器稳定的污染物降解效率。JIANG等16应用DGGE研究发现，降解苯酚的活性污泥和颗粒污泥的群落结构相似性较低，共分离到10类苯酚降解优势菌，分属-、- Proteobacteria和高G+C革兰氏阳性菌。JIANG等17应用FISH技术分析降解苯酚好氧颗粒污泥内PG-01菌株空间分布，以FITC标记EUB338、TRITC标记ARCH915和Cy5标记Pand822为探针，结果表明，细菌分布在整个颗粒区域，未检出古细菌，PG-01菌株主要分布在颗粒外表层。2.2 微生物菌群结构动态演替多个样品的同步分析是DG

13、GE技术应用于微生物分子生态研究的一大优势，有助于快速监测反应器启动过程污泥微生物微观生境变化，及时分析菌群结构随时间（季节）变化、环境因子影响等导致的动态演替。BOON等18应用DGGE技术监测了两组生物反应器内活性污泥在氯苯胺冲击负荷下的微生物相动态变化，结果发现接种有3-CA降解菌的生物强化反应器内微生物种群结构稳定，氨氧化菌的活性、丰度至第4天即开始恢复，而对照反应器内至第12天仍未见任何恢复迹象。LIU等19研究发现两相厌氧产酸反应器启动后pH急剧下降，并伴随挥发性脂肪酸（VFA）增加、产甲烷量降低、污泥解体洗出等现象，DGGE图谱显示13 d后反应器内细菌种群结构开始稳定，最终两反

14、应器内群落组成存在着差异，在高温（55 ）条件下细菌种群变化速率更快，厌氧消化反应器在高温条件更易建立。刑德峰等20应用双梯度变性梯度凝胶电泳（DGDGGE）监测生物产氢反应器微生物群落的动态变化和多样性，反应器启动初期微生物种群演替迅速，15 d达到顶峰后逐渐减少趋于零，群落结构的多样性下降，相似性随着演替时间增加而升高，最后趋于稳定。傅以钢等21研究发现，城市污水处理系统在受到高浓度硝酸根离子冲击后微生物生态系统通过种群间协同作用恢复到原有的多样性，认为Bacillales和-proteobacteria等优势菌群在处理过程中起着主要作用。STAMPER等22对可再生废水处理系统的种群结构

15、动态演替研究发现，微生物种群的多样性随着BOD浓度的不同而变化。LAPARA等23探讨不同温度和操作条件对好氧生物废水处理过程中微生物群落结构和功能稳定性的影响，DGGE图谱揭示不同温度条件下均获得了独特的微生物菌群结构，并认为HRT同样是污泥菌群结构变化的调控因子之一。此外，TARTAKOVSKY等24采用HPLC化学分析技术，发现UASB对五氯酚降解菌的快速筛选过程相继将目标污染物转化为3,4,5-三氯酚、3,5-二氯酚、3-氯酚、苯酚，结合DGGE图谱分析发现反应器启动17 d后出现Clostridium acetobutylicum/C.beijerinckii.，TCP对位脱氯伴随有

16、两个条带出现，属于Clostridium和Syntrophomonas/Syntrophobacter，DCP的间位脱氯也伴随有Syntrophomonas和Syntrophus的出现，但这类菌也存在于对照反应器中，由此可推断PCP及其中间产物的还原脱氯应Clostridium作用所致。LI等25在好氧污泥颗粒化过程微生物动态分析实验中发现，污泥颗粒化过程微生物种群结构演替显著，随着污泥颗粒化而出现特异性条带。污泥颗粒化过程微生物群落结构动态演替显著，优势菌群分属-, -Proteobacteria、Flavobacterium等类群。2.3 污泥微生物群落结构研究虽然DGGE技术只能对微生物

17、群落多样性、菌群种类进行分析鉴定，无法获得菌落形态、空间分布等信息，但结合荧光原位杂交（FISH）、点印迹杂交（Dot-blot hybridization ）等分子生物学技术，能够克服DGGE技术的局限性，进一步了解颗粒污泥、生物膜等特殊微生物系统的群落结构与功能。AHN等26研究了3组不同电子受体的SBR反应器（RAA反应器：O2，RAN反应器：O2 、NO3，RNN反应器：NO3）接种聚磷菌（PAOs）后的微生物群落结构变化，结果表明，RNN内污泥种群结构最复杂，而RAA的微生物种类较RAN少，每组反应器内均存在Rhodocyclus sp.和 Dechlorimonas sp.两类反硝

18、化聚磷菌（DNPAOs）。FISH结果表明，Rhodocyclus sp.在3个反应器中均属于优势菌群，且呈葡萄串菌落形态存在，而Dechlorimonas sp.数量较少。厌氧生物反应器效率跟氨氮浓度密切相关，氨氮浓度的不断提高使UASB反应器的COD去除效率下降，DGGE和FISH研究结果表明，产甲烷细菌群落组成和结构均发生明显的变化，Methanosaeta及相关菌群的丰度和活性下降，而Methanosarcina、Methanobacterium及Methanospirillium等菌群在反应器运行过程中能够保持一定的数量级，但Methanosarcina从单一细胞聚集成为细胞群，认为

19、这种存在形态有利于其抵抗高浓度氨氮冲击影响，可维持反应器运行稳定性27。膜好氧生物反应器（MABR）通过膜腔体供氧，实现向反应器的无泡曝气，能够在单一生物膜上完成硝化反硝化反应。有研究表明28，与活性污泥相比MABR具有独特而复杂的微生物群落结构；对目标条带进行克隆和序列分析发现隔膜附近的主要菌群为-和-Proteobacteria，而远离隔膜厌氧区域内主要包括Bacteriodetes及-、-、-和-Proteobacteria等；对氨氧化菌（AOB）和反硝化菌（nirS，nirK）的竞争性定量PCR结果表明，2、14 cm/s流速下生物膜内AOB、nirS和nirK的分布情况不同，由此可推

20、断出流速是影响生物膜内微生物种群结构的重要因素。LANTHIER等29采用厌氧固定膜反应器（FF）降解PCP，DGGE结果表明，反应器启动56 d后微生物群落趋于稳定，与接种污泥相比生物膜内细菌种群结构发生了明显的变化，相似性低于0.3；古细菌种类比细菌少，群落组成变化不明显，表明产甲烷菌在UASB和厌氧FF反应器内的种类基本相同；结合FISH技术发现，由球菌、球杆菌和杆菌组成的细菌群落约占总菌群的70%，而古细菌丰度只有10%左右，大部分为甲烷菌，此外发现PCP降解菌Desulfitobacterium. Hafniense占总菌群的19%左右，分散于整个生物膜内，这种特性有利于保持微生物群

21、落的稳定。3 展 望迄今为止，以基因组DNA或RNA为研究对象的DGGE技术克服了传统微生物方法的各种弊端，可快速表征微生物遗传特性，已成为废水处理过程微生物群落结构分析、动态演替监测方面强有力的常规分子生物学研究手段，但同时还存在只能分析500 bp以下的DNA片段30、只能检测到样品中占1 %以上的优势菌群等局限性，此外细胞裂解是否充分、DNA提取和纯化时的偏差、电泳操作条件的改变等都将影响DGGE的分析结果。尽管DGGE技术存在以上局限性，但其与实时定量PCR（real time and quantitative PCR）、16S rRNA文库构建（16S rRNA gene libra

22、ries）、FISH等分子生物技术相耦合，有望进一步揭示微生物群落的结构与功能，借助于功能基因标记或者信使RNA（mRNA）的PCR扩增可获得微生物群落内部特定的代谢信息，此外结合传统的分离培养、化学分析等方法可进一步了解微生物的功能及其生理生态特性，为建立数学模型、设计处理系统及优化操作等提供理论依据。综上，结合其他分子生物学手段、传统微生物技术和化学分析方法，对于丰富和发展废水生物处理的微生物学理论、加强工程技术的可控性具有重要的意义。参考文献1 WILDERER P A，BUNGARTZ H J，LEMMER H，et al.Moden science methods and their

23、 potential in wastewater science and technologyJ.Water Res. 2002，36：370-393.2 WANGER M，LOY A. Bacterial community composition and function in sewage treatment systemJ.Current Opinion in Biotech.，2002，13：218-227.3 MUYZER G，WAAL E C，UITTERLINDEN A G.DGGE/TGGE a method for identifying genes from natura

24、l ecosystemsJ.Current Opinion in Biotech.，1999，2：317-322.4 SCHWIEGER F，TEBBE C C.A New approach to utilize PCR-single-strand-conformation polymorphism for 16S rRNA gene-based microbial community analysisJ.Appl.Environ. Microbial.，1998，64(12)：4870-4876.5 LIU W T，MARSH T L，CHENG H，et al.Characterizati

25、on of microbial diversity by determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16S rRNAJ. Appl.Environ.Microbial.，1997，63(11)：4516-4522.6 VANEECHOUTTE M，RIEGEL P，BRIEL D C，et al.Evaluation of the application of amplied rDNA restriction analysis (ARDRA) to identificatio

26、n of species of the genus CorynebacteriumJ. Res.in Microbiol.，1995，146(8)：633-641.7 MYERS R M，FISCHER S G，LERMAN L S，et al.Nearly all single base substitutions in DNA fragments joined to a GC-clamp canbe detected by denature gradient gel electrophoresisJ. Nucleic.Acids Res.，1985，13：3131-3145.8 SIGLE

27、R W V，MINIACI C，ZEYER J.Electrophoresis time impacts the denaturing gradient gel electrophoresis-based assessment of bacterial community steuctureJ.Microbiol.Methods，2004，57：17-22.9 MUYZER G，DEWAAL E，UITTERLINDEN A G.Profiling of complex microbial population by denature gradient gel electrophoresis

28、analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rDNAJ.Appl.Environ.Microbial.，1993，59(3)：695-700.10 LAPARA T M，HAKATSU C H，PANTEA L，et al.Phylogenetic analysis of bacterial communities in mesophilic and thermophilic bioreactors treating pharmaceutical wastewaterJ. Appl.Environ.M

29、icrobiol.，2000，66(9)：3951-3959.11 KASONEN A H，PLUMB J J，FRANZMANN P D，et al.Simple organic electron donors support diverse sulfate-reducing communities in fluidized-bed reactors treating acidic metal-and sulfate-containing wastewaterJ.FEMS Microbiol. Ecology，2004，47：279-289.12 DAR S A，KUENEN J G，MUY

30、ZER G. Nested PCR- denature gradient gel electrophoresis approach to determine the diversity of sulfate-reducing bacteria in complex microbial communitiesJ.Appl.Environ.Microbiol.，2005，71(5)：2325 -2330.13 BOON N，WINDT W D，VERSTRAETE W，et al.Evaluation of nested PCR-DGGE (denaturing gradient gel elec

31、trophoresis) with group-specific 16S rRNA primers for the analysis of bacterial communities from different wastewater treatment plantsJ.FEMS Microbiol.Ecol.， 2002，39：101-112.14 FANG H P，LIU H，ZHANG T.CHARacterization of a hydrogen-producing granular sludgeJ.Biotechnol.Bioeng.，2002，78(1)：44-52.15 ZEI

32、N M M，SUIDAN M T，VENOSA A D.MtBE biodegradating in a gravity flow, high-biomass retaining bioreactorJ.Environ.Sci.Technol.，2004，38：3449-3456.16 JIANG H L，TAY J H，MASZENAN A M，et al.Bacterial diversity and function of aerobic granules engineered in a sequencing batch reactor for phenol degradationJ.A

33、ppl.Environ.Microbiol.，2004，70(11)：6767-6775.17 JIANG H L，TAY J H，MASZENAN A M，et al.Bacterial diversity and function of aerobic granules engineered in a sequencing batch reactor for phenol degradationJ.Appl.Environ.Microbiol.，2004，70(11)：6767-6775.18 BOON N，TOP E M，VERSTRAETE W，et al.Bioaugmentatio

34、n as a tool to protect the structure and function of an activated-sludge microbial community against a 3-chloroaniline shock loadJ.Appl.Environ.Microbiol.，2003，69(3)：1511-1520.19 LIU W T，CHAN O C，FANG H H P.Microbial community dynamics during start-up of acidogenic anaerobic reactorsJ.Water Res.，200

35、2，36：3203-3210.20 刑德峰，任南琪，宋业颖，等.DG-DGGE分析产氢发酵系统微生物群落动态及种群多样性J.生态学报，2005，25(7)：1817-1822.21 傅以钢，王峰，赵建夫.高浓度硝酸盐对城市污水活性污泥中微生物种群结构的影响J.环境科学学报，2005，25(3)：372-378.22 STAMPER D M，WALCH M，JACOBS R N.Bacterial population changes in a membrane bioreactor for graywater treatment monitored by denature gradient g

36、el electrophoretic analysis of 16S rRNA gene fragmentsJ.Appl.Environ.Microbiol.，2003，69(2)：852-860.23 LAPARA T M，NAKATSU C H，PANTEA L M.Stability of the bacterial communities supported by a seven-stage biological process treating pharmaceutical wastewater as revealed by PCR-DGGEJ.Water Res.，2002，36：638-646.24 TARTAKOVSKY B，MANUEL M F，BEARMIER D，et al.Enhanced selection of an anaerobic pentachlorophenol-degrading consortiumJ.Biotechnol.Bioeng.，2001，