热休克反应对内毒素诱导的IP10基因表达的影响

1、热休克反应对内毒素诱导的IP-10基因表达的影响 作者：梁秋娟，张华莉，涂自智【摘要】 目的 探讨在RAW264.7巨噬细胞中热休克反应(HSR)对大肠杆菌内毒素(脂多糖，LPS)诱导的干扰素诱导蛋白10(IP-10)表达的影响。方法 RAW264.7巨噬细胞分别给予不同剂量及不同反应时间的LPS处理，并行HSR后抽提总RNA进行RT-PCR实验。结果 LPS可促进RAW264.7巨噬细胞中IP-10基因的转录，具有剂量依赖性;用浓度为600g/L的LPS刺激2h并行HSR时，IP-10的mRNA表达量最大。结论 HSR能促进LPS诱导的IP-10基因mRNA表达水平。 【关键词】 热休克反应

2、;内毒素类;干扰素诱导蛋白10Abstract: Objective To explore the effects of heat shock response (HSR) on RAW264.7 macrophages interferon induced protein 10 (IP-10) expression induced by lipopolysaccharide (LPS). Methods RAW 264.7 Macrophage cells were exposed to LPS with different doses and for different reaction

3、time, and part of cells were treated with heat shock. Then total RNA were extracted respectively. The expression of IP-10 were detected by RT-PCR. Results LPS could enhance the transcrition of IP-10 in RAW264.7 macrophages, which showed dose reliability. When RAW264.7 macrophages were treated with L

4、PS at concentration of 600g/L and heat shock for 2h, IP-10 mRNA reached to a peak level. Conclusion HSR can promote the level of IP-10 mRNA induced by LPS.Key words: heat shock response; endotoxins; interferon induced protein-10热休克反应(heat shock response，HSR)是生物细胞在高温、毒物、自由基及感染等应激原作用下以基因表达变化为特征的一种防御适应

5、反应。作为机体重要的内源性防御机制，HRS通过激活热休克因子1(heat shock factor 1, HSF1)后直接或间接调控某些炎症介质、细胞因子的表达，如TNF-、IL-6、IL-1等。在以前的实验中1，我们用野生型和HSF1基因敲除小鼠复制内毒素血症动物模型，并进行HSR。小鼠自身免疫与炎症疾病相关基因微阵列结果显示，有多种炎症相关基因在两种小鼠中有差异性表达，其中包括干扰素诱导蛋白10(interferon-inducible protein 10，IP-10)，提示IP-10的表达可能受到HSR、HSF1的影响。在本实验中，我们主要从细胞水平探讨经LPS诱导表达的IP-10是否

6、受到HSR的影响。如果能发现IP-10与HSR之间的关系，并进一步找到其调节机制将可能为全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)的机制研究及防治提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料 RAW264.7巨噬细胞株，购自上海细胞中心;细胞培养箱由美国SHELL LAB生产;新生小牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司;RPMI-1640 培养基购自Gibco公司;大肠杆菌内毒素(O111B4，脂多糖，LPS)购自Sigma公司;Trizol试剂购自美国GIBCO公司;Taq DNA Polymerase、AMV逆转录酶(Tak

7、ara)购自宝生物工程(大连)有限公司; PCR仪由英国Techgene生产;PCR引物甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)和待测基因IP-10由上海博亚生物公司合成，见表1。表1 用于RT-PCR的引物1.2 方法1.2.1 LPS刺激细胞 将细胞按1×106/瓶的密度接种在25cm2培养瓶中，用5ml含10% 小牛血清的RPMI 1640培养。24h后给予LPS刺激并置于37 5%CO2培养箱中，在指定的时间收集标本。1.2.2 热休克处理 将细胞培养瓶口封闭好，置于温度为42的恒温水浴箱内1h，

8、收集标本。(LPS加热休克处理组，于LPS处理的最后1h进行热休克)。1.2.3 总RNA的提取 用Trizol试剂抽提细胞的总RNA，并用DNA 酶1消化除去总RNA中的痕量DNA;1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA。紫外分光光度计测量A(260nm/280nm)比值测定RNA的浓度。1.2.4 逆转录聚合酶链反应 用鸟类成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶合成第一链，反应条件如下：42反应1h，98变性5min;用1l的逆转录产物作为模板，进行PCR扩增：IP-10: 95变性45s，57退火30s，72延伸1min，扩增27个循环;GAPDH：95变性30s，57退火30s，72延伸30s，

9、扩增23个循环;以GAPDH作为内对照，PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。1.3 统计学处理 用Bandleader软件对IP-10基因及GAPDH凝胶电泳条带进行灰度扫描，计算IP-10与GAPDH条带的灰度比值，数据以(±s)表示。采用SPSS 11.0软件进行统计学分析，两组间比较用t检验。2 结果2.1 HSR对不同剂量LPS诱导的IP-10 mRNA表达的影响 检测表明，正常对照组细胞中，IP-10 mRNA表达量很低，单纯热休克处理可增加该基因的表达(lane.2)。用不同浓度LPS(400、600、800、1000g/L)处理RAW264.7巨噬细胞2h，可发现I

10、P-10的表达呈剂量依赖性(lane.3、5、7、9)，其中LPS处理剂量为600、800、1000g/L时，与正常对照组比较差异有显著性(P<0.05)。在LPS处理后1h同时进行热休克处理(42，1h)，与相应浓度单纯LPS处理组比较，热休克可以促进IP-10的mRNA水平，其中LPS剂量为0、400、600g/L时，热休克组的促进作用差异有显著性(P<0.05)，见图1。2.2 HSR对LPS诱导的IP-10 mRNA表达的时效影响 与正常对照组比较LPS(600g/L)处理2h，巨噬细胞中IP-10表达明显增多(lane.3，P<0.05)，4

11、h时表达有所下降。单纯做热休克(lane.6)及用LPS处理后做热休克(lane.2，4)都能促进IP-10 mRNA的表达，且差异有显著性(P<0.05)，见图2。3 讨论IP-10是一种早期炎症细胞因子，属于CXC类趋化因子家族的成员，由IFN-、LPS等诱导产生，在单核细胞、T细胞、内皮细胞等多种细胞中都有表达，在炎症过程中参与调节细胞募集和活化2,3。在本实验中我们发现：在正常RAW264.7细胞中，单纯HSR或LPS处理后进行HSR都能促进IP-10的表达;用不同浓度的LPS进行处理时有一定的剂量依赖性，LPS处理浓度为600g/L时，HSR后能明显促进该基因的表达;以

12、600g/L的LPS处理细胞不同时间点发现：LPS处理2h，IP-10 mRNA增多，同时还发现热休克能明显促进该时间点IP-10的表达，而到了4h，IP-10的表达已有所下降，但热休克仍能促进该基因mRNA水平。以上实验结果提示：IP-10确实是早期炎症基因，HSR能促进早期炎症因子IP-10的转录。HSR长期以来都被公认在SIRS中发挥内源性保护作用。例如：整体动物经亚致死性HSR后，可降低LPS感染后动物的死亡率，减轻内毒素所致的心、肺、肝、肠等组织器官的损伤，并降低微血管通透性4,5;大鼠内毒素血症发生后再诱导HSR，同样具有保护作用6。这些实验结果提示：HSR对炎症所致的损伤有保护作

13、用，发挥抗炎作用。但是在我们的研究中，作为起内源性保护作用的HSR却能促进IP-10这一早期促炎因子的表达，这是否与HSR的抗炎作用相矛盾呢作为统一的整体，机体内环境处在平衡与失平衡的矛盾运动中，机体内在的调控网络非常复杂，这也正是SIRS经长期研究后仍存在很多尚未解决的问题的原因所在。以往的研究也发现，HSR并不总是发挥抗炎作用，也能促进一些促炎因子的表达。例如Marcella等7发现，HSR促进LPS诱导的TNF-的表达;Wan等8发现，一种热休克蛋白热休克蛋白70类似蛋白1(heat shock protein 70 like protein 1， HSP70L1)，能促进IP-10的分

14、泌。因此在本研究中发现的HSR能促进早期炎症因子IP-10的表达并不与HSR的内源性保护作用相违背。虽然，我们尚不能解释HSR促进IP-10表达的原因和机制，但是本研究提示HSR在SIRS中不仅能发挥抗炎作用，也可能通过调控IP-10等炎症相关基因的表达发挥了一定程度的促炎作用，以维持体内的抗炎和促炎反应的平衡，当然这其中的机制仍有待于更深入的研究。此外，即使我们已初步证明HSR能促进IP-10的表达，但是HSR通过什么方式来调控IP-10的表达其调控的机制如何这些问题仍需进一步研究。【参考文献】 1 于凤秀，张华莉，陈广文，等.HSF1调控的炎症相关基因的筛选及SOCS3基因的实验验证J.中

15、南大学学报：医学版，2006,31(2):167-173.2 Vanguri P, Farber JM. IFN and virus-inducible expression of an immediate early gene, crg-2/IP-10, and a delayed gene, I-A alpha in astrocytes and microglia J. J Immunol,1994,152(3):1411-1418.3 Miller MD, Krangel MS. Biology and biochemistry of the chemokines: a family

16、of chemotactic and inflammatory cytokines J. Crit Rev Immunol,1992,12(1-2):17-46.4 Huang SN, Wang YR, Xiao XZ, et al. The role of macrophage in the tolerance to lethal dose of LPS in mice J. Shock,1995,3(supple):4-5.5 Suganuma T, Irie K, Fujii E, et al. Effect of heat stress on lipopolysaccharide-in

17、duced vascular permeability change in mice J. J Pharmacol Exp Ther,2002,303(2):656-663.6 Tjardes T, Neugebauer E. Sepsis research in the next millennium: concentrate on the software rather than the hardware J. Shock,2002,17(1):1-8.7 Ferlito M, De Maio A. Enhance LPS-induced TNF production in heat-shocked human promonoc