大肠杆菌对土壤微生物群落组成与修改

1、大肠杆菌对土壤微生物群落组成与修改摘要：这个实验研究了缩影生存模式的三个大肠杆菌株(起源于土,狗粪和人类排泄物)对土壤微生物群落组成与修改。密度逐步增加(0.05%、0.15%、0.30%和0.50%)的胆汁盐3号(BS3)被添加到砂壤土壤中。实验室培养的大肠杆菌被灌输进土壤并孵化150天来监控他们的生存模式。通过对土壤中BS3的检测来判断细菌群落的多样性。该方法是通过两个栽培和培养为基础的独立的方法。一般来说, 孵化10天和90天，逐步增加BS3浓度都会导致CFU计数的减少。DGGE分析表明只要轻微改变细菌群落组成需10天,但一个明显的变化需90天。生存的大肠杆菌在土壤中显著影响微生物群落的

2、多样性,因为大肠杆菌的死亡速率逐渐下降该土壤中微生物群落多样性也减少。生存的大肠杆菌对不同土壤微生物群落中的多样性都有重要影响,因此结合预测模型对水质管理和微生物源跟踪研究有重要意义。关键词：胆汁盐3号; 大肠杆菌; 微生物群落结构 ； 土壤 ;生存1引言土壤和水体是大肠杆菌的主要来源。起源于农业的大肠杆菌进入土壤通过应用动物肥料或直接沉积或通过放牧牲畜沉淀。土壤绑定大肠杆菌通过雨水径流转入水系统,因此大肠杆菌也影响水的质量。生存的大肠杆菌在土壤中,一个关键问题当考虑到周围的水域污染的风险,是不很好地确定由于缺乏信息的主要影响因素的土壤。非生物因素,如温度、湿度（Byappanahalli和F

3、ujioka,2004,Byappanahalli et al。,2006,Desmarais et al。2002)、土壤质地(Desmarais et al。,2002年)、有机物质含量(泰特,1978),和粪肥介质,已经被证明能够影响生存的大肠杆菌在土壤中,尽管这些因素如何影响大肠杆菌还不清楚。一些生物因素,如捕食,也被报告影响大肠杆菌在土壤中的持久性 (Brettar和Hofle,1992)。理解其他生物因素的影响,例如,土壤微生物群落组成,但是,仍然是很有限的(Bogosian et al。1996和Korhonen和Martikainen,1991)。生存或持久性的大肠杆菌引入土壤

4、后土壤微生物的群落结构改变(Colwell,1997,McGradySteed et al。1997、纳伊·姆和李,1997和Tilman et al。,1997)。一个逆关系之间被发现的存活率铜绿假单胞菌和复杂的小麦根际微生物多样性(Matos et al。,2005)。在另一项研究在人为构造的缩影,invasibility Ralstonia青枯病菌的生化变种被发现逆相关程度的土壤微生物群落多样性(Irikiin et al。,2006)。Van Elsas(Van Elsas et al。,2007年)表明,生存的大肠杆菌是负面影响土壤微生物的复杂性社区。大肠杆菌物种基因多样化

5、(Dykhuizen,1984),它已被证明,致病菌株的大肠大肠杆菌存活不同于非株(Fenlon et al。2000、这里et al。2000和奥格登et al。,2001)。因此要推广环境行为不当的致病菌株其他大肠杆菌种群。作为一个选择性抑制剂,胆汁盐# 3(BS3)广泛应用于微生物培养基浓度,0.15%支持增长的革兰氏阴性细菌肠。BS3已经应用于土壤微观研究降低土壤细菌的数量,进而推动本土生长的自然大肠杆菌数量(Byappanahalli和Fujioka,2004)。在这项研究中BS3是用于构建微观与梯度的土壤微生物群落结构,和那些被用作模型微观土壤生态系统与不同的微生物群落结构来确定生

6、存的接种大肠大肠杆菌菌株。这是假设应用程序在不同浓度的BS3土壤会导致逐渐改良土壤微生物群落组成,这将影响生存的反向接种过的大肠杆菌。1 材料和方法 总结了实验方案在这项研究中的应用，如图1所示。详细的实验设置如下:图12.土壤取样和治疗 收集的沙质土壤是来自表面10厘米层草原在印度河研究和教育中心,佛罗里达州皮尔斯堡。这草地已经十年了,因为它是被从柑橘林和没有有机修正案被应用在转换后。毕竟石头和植物残体被移除,土壤被同质化通过使用2 mm筛,并存储在4°C和使用10天内建立土壤缩影。一部分土壤消毒日常高压灭菌法为2h,在121年连续5天以Unc和戈斯(2006)程序。促进发芽的孢子

7、autoclavings之间的土样在无菌条件下保持室温。蒸发损失的水是通过添加相应的补偿金额无菌去离子水对土壤。Aliquots蒸压土壤的板稀释到营养琼脂板和孵化室温48小时来检查高压灭菌法的有效性。没有增长48小时后被发现。存在/缺乏背景大肠杆菌种群在收集的土壤验证了如下:1 g的均质土壤是悬浮在10毫升的大豆胰蛋白酶的肉汤,动摇和孵化24 h在37°C(一式三份)。在35°C培养2 h,其次是22h孵化为44.5°C。没有观察到蓝色,表明缺乏背景大肠杆菌在土壤样品接种之前。2.1土壤微观设置 新鲜的土壤被放置到一个消毒浴缸。胆汁盐溶液(20%)被喷入土壤和均质

8、化后,最终浓度为0.50%、0.30%、0.15%或0.05%。没有BS3新鲜土壤和无菌土被用来提供积极的和消极的控制。土壤水分含量调整到50%的田间持水量用无菌去离子水,100克的土壤被放置到一个玻璃瓶里覆盖着保鲜膜和在25°C培养在黑暗的总数为90天,建立一系列的土壤生态系统与逐渐改变了微生物群落结构。共有594微观(6×3 E治疗。杆菌菌株×11破坏性抽样事件后接种大肠杆菌×3复制每个)建立。含水量的核心是评估每5天,失去的水量中添加形式的无菌蒸馏水通过滴,以便保持水分状况在治疗。在第10天微观采样和天90监控变化的微生物群落使用这两种文化基础和非

9、文化基础的方法。是否存在大肠在第90天测试杆菌使用上面描述的方法。没有增长的大肠大肠杆菌是明显当时点。土壤微观在90天孵化被用作接收者的大肠杆菌接种。2.2大肠杆菌剂制备和孵化 从土壤中分离株最初来自牛牧场(S),人类排泄物(H)和狗粪便(D)被用作inoculums。简要10 g新鲜粪便或土壤样本稀释95毫升的磷酸盐缓冲盐水(PBS;137毫米氯化钠,2.7毫米氯化钾,100毫米Na2HPO4,2毫米KH2PO4)和动摇280 rpm 30分钟。对粪便样本,200L 10-5稀释的上层,固体物质免费阶段被传播到mFC琼脂;土壤样本200L稀释的土壤自由悬挂被使用。这些盘子是在35°

10、C培养2 h随后在44.5°C的孵化22小时。蓝色飞跑到mFC琼脂和44.5°C培养24小时。单一的在mFC琼脂接种到MacConkey琼脂板,在37°C培养24小时。粉红色或红色属地在MacConkey琼脂被确认为大肠杆菌使用一系列的生化测试(Dombek et al。,2000):增长最小乳糖琼脂板、缺乏增长最小柠檬酸琼脂板和吲哚生产。确认菌株进行使用API20E。3株用于这项研究被认为是大肠通过与优秀的识别API20E杆菌分数。3株生长曲线构造比较他们的生长动力学使用Bioscreen C自动微生物生长曲线分析系统(皮斯卡塔韦,NJ)。非常类似的增长率和动态

11、值观察,表明3株的可比性。一夜之间大肠杆菌在营养肉汤是在3000×g 4°C和30分钟收获而离心,颗粒状细胞被重新悬浮在无菌水,洗两次通过离心3000×4°C g和30分钟,然后重新悬浮在无菌水达到最终浓度的9LogCFU /毫升,是维持在20°C然后4 h接种之前确保所有过量的营养物质被细菌利用了。大肠杆菌接种到土壤微观通过喷雾,轻轻搅拌建立一个细胞密度大约8Log CFU / g干土。被称为发酵剂的使用在如此高的浓度是确保检测大肠随后的DGGE分析大肠杆菌。最后接种密度是由连续稀释和菌落计数。微观世界是在黑暗中孵化在25°C,总共

12、是150天。土壤从微观是狼狈地取样日0(1 h接种后)、7、14、21、28,45岁,60、75、90、120、150年为枚举的可耕种的大肠杆菌。分析了土壤样品的微生物群落的变化使用DGGE在天0、21、45、75、90、120和150。水分损失在孵化是补偿通过添加去离子水维持恒定土壤水分状况。2.3细菌菌落计数和细菌指数计算 土壤样品(5 g)被加载到45毫升的无菌磷酸盐缓冲稀释水(PBW)(0.002米、0.0003米MgCl2 KH2PO4)和30s在冰上使用超声波dismembrator(型号100,费舍尔科学)。粒子自由上清当时用十进制使用无菌PBW稀释。200L合适的稀释扩散到R2

13、A是在重复媒体(Difco)和孵化室温(25°C)长达10天。属地在盘子里被枚举每日第一6天,然后每隔一天为以下4天。描述了细菌群落组成,两个索引进行计算。这个殖民地发展指数(CD)提出Sarathchandra et al。(1997)是计算方式如下:CD =(N1/1 + N2/2 + N3/3 + N4/4 + N5/5 + N6/6 + N8/8 + N10/10)×100,其中N代表比例的细菌菌落出现在天1,2,3,10。它通常假设一个高CD值表示一个大比例的特化种而低价值的建议有更高比例的k-战略家。在这里计算,CD的值范围从100(如果所有的殖民地都出现在第一

14、天)到10(如果所有的殖民地都出现在一天10)。这个生理(EP)指数被描述为DeLeij et al(1993)是改编自香农多样性指数的概念(H),通常用于确定细菌菌落发展在琼脂(De Leij et al。,1993)。EP指数计算为:EP =(Pi×log10Pi),Pi是人口/总人口,对于每种八类(殖民地出现在每个8天)。更高的CD和EP指数表明更均匀分布的殖民地类.2.4枚举的大肠杆菌在孵化土壤 三瓶从每个治疗进行破坏性抽样和枚举的可耕种的大肠在每个时间点大肠杆菌。5克(鲜重)的土壤被添加到一个50毫升锥形离心管包含45毫升的无菌PBW随后使用超声波声处理在冰dismembr

15、ator(型号100,费舍尔科学)在30s成立6组。解决后10分钟粒子自由上层的是用十进制稀释和过滤膜过滤系统根据标准膜过滤协议。简单地说,解决方案是透过一个0.45m膜过滤及孵化改性膜耐热的大肠杆菌琼脂(修改mTEC)琼脂为35°C 2 h在随后在44.5°C的孵化为18 - 22小时。红色或洋红殖民地算为大肠杆菌。随着数量的可耕种的大肠杆菌跌低于侦测极限的薄膜过滤法(3LogCFU)、或然数法与五管每稀释应用为枚举(Clesceri,1989)。3结果3.1 BS3效应对微生物群落组成在这项研究中,治疗后以不同浓度的BS3,板计数进行量化改变土壤中可耕种的细菌10天后,

16、90天孵化。在eco生理结构变化的细菌社区是由EP和CD指数表示。BS3的影响在细菌群落多样性进行了监测通过放大的碎片高度保守16 s rRNA基因使用PCR和异形DGGE的。3.2大肠杆菌菌株在土壤虽然没有明显的增长的大肠杆菌检测,所有三个大肠杆菌菌株可能存在于土壤在一段时间后,一些人甚至仍可检测的末尾的孵化(150 d)(图3)。变异的大肠杆菌随着时间的推移,适应检查动态的菌株接种在土壤缩影。这种方法通常是用于大多数监测实践在农业领域。一般来说,生存的模式为所有三个大肠杆菌菌株配合很好,一个一级动力学模型,最常用的模型来描述肠道细菌死亡在土壤(博尔顿et al。1999、起重机和摩尔,19

17、86,Natvig et al。2002和Reddy et al。,1981),R平方值的范围从0.821到0.937。大肠杆菌数量随着时间逐渐下降与衰减率从0.04到0.12不等LogCFU每天每克土壤(图2)。死亡模式的大肠在土壤杆菌菌株依赖:狗大肠杆菌菌株衰退更加迅速地在土壤比其他两个菌株:在第一个75天孵化,水平的狗应变下降了多达8个数量级,而减少的其他两个只有两到六个数量级,狗应变无法被检测到从所有的治疗120天后孵化,而其他两个菌株展示了更大的持久性和可以探测到在一些微观甚至150天后孵化.感谢这项研究,在一定程度上支持格兰特(合同# )从佛罗里达州南部地区,佛罗里达水资源管理。作

18、者感谢哈伍德博士在南佛罗里达大学的技术援助。我们感谢两个匿名评论者的讲话帮助改善手稿。参考文献: Persistence and differential survival of fecal indicator bacteria in subtropical waters and sedimentsApplied and Environmental Microbiology, 71 (2005), pp. 30413048Aries et al., 1969V. Aries, J.S. Crowther, B.S. Drasar, M.J. HillDegradation of bi

19、le salts by human intestinal bacteriaGut, 10 (1969), p. 575Ben-Jacob, 2003E. Ben-JacobBacterial self-organization: co-enhancement of complexification and adaptability in a dynamic environmentPhilosophical Transactions of the Royal Society of London Series A-Mathematical Physical and Engineering Scie

20、nces, 361 (2003), pp. 12831312Berry and Miller, 2005E.D. Berry, D.N. MillerCattle feedlot soil moisture and manure content: II. Impact on Escherichia coli O157Journal of Environmental Quality, 34 (2005), pp. 656663Berry et al., 1991C. Berry, B.J. Lloyd, J.S. ColbourneEffect of heat-shock on rec

21、overy of Escherichia coli from drinking-waterWater Science and Technology, 24 (1991), pp. 8588Bogosian et al., 1996G. Bogosian, L.E. Sammons, P.J.L. Morris, J.P. Oneil, M.A. Heitkamp, D.B. WeberDeath of the Escherichia coli K-12 strain W3110 in soil and waterApplied and Environmental Microbiolo

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