单克隆抗体多克隆抗体制备修改

1、单克隆抗体多克隆抗体制备班级：03生技6 学号： 姓名：应尧 指导师：郑蔚红摘要 单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具,在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用。本文全面综述了单克隆抗体研究最新进展。通过构建真核表达载体,采用DNA 免疫、细胞免疫、消减免疫和多位点重复免疫等现代分子免疫学方法,快速制备高亲合力的单克隆抗体,改进常规方法制备单抗费时费力且亲合力低的弱点,对后基因时代蛋白质组学等基础研究领域的研究具有巨大的推动作用;同时在生物芯片、临床医学和疾病的诊断与治疗以及空间生命科学等应用领域有着广阔的应用前景。关键词多克隆抗体, 单克隆抗体单克隆抗体指来自一个B淋巴细胞

2、的单克隆杂交瘤细胞株所分泌的、针对同一抗原决定簇的抗体。1975年，英国科学家米尔斯坦和法国科学家柯勒开创了将产生抗体的单个细胞（如B淋巴细胞）和瘤细胞（如骨髓瘤细胞）杂交的技术，形成杂交瘤细胞，成功地获得了化学性质单一、特异性强的单克隆抗体，并因此获得1984年的诺贝尔生理学及医学奖。1 半抗原载体复合物有多种结合位点,免疫系统将会产生具有不同特异性的多种抗体(称为多克隆抗体).多克隆抗体包含不同种类的抗体,所以在免疫检测使用之前抗体必须标准化。2单克隆抗体的化学本质是蛋白质，合成场所是核糖体，它是由基因控制合成的，合成过程包括转录和翻译两个重要步骤。B淋巴细胞中产生抗体的基因转移到了杂交瘤

3、细胞的DNA中，抗体基因在杂交瘤细胞中指挥抗体合成。杂交瘤细胞以有丝分裂的方式大量增殖，所以在杂交瘤细胞的培养过程中，需要定期地用胰蛋白酶处理，然后分装到更多的培养基中。单克隆抗体具有免疫作用，它与血清抗体相比，优越之处在于特异性强、灵敏度高、产量高。 1 单克隆抗体制备1.1单克隆抗体技术的基本原理小鼠骨髓瘤细胞能在体内外无限增殖和分泌无抗体活性的免疫球蛋白,而免疫小鼠脾细胞具有产生抗体的能力,但不能无限增殖。采用融合剂(PEG等) 将这两种细胞融合成杂交瘤细胞。这种杂交瘤细胞具有亲代细胞的主要特征。既能在人工培养下无限增殖,又能产生特异性抗体。可通过有限稀释法选育由单个细胞增殖而成的克隆。

4、31.2 单克隆抗体技术的基本的过程包括给小鼠注射一种抗原，它可以被免疫系统识别，因此诱导小鼠的B淋巴细胞产生相应抗体。然后，在培养基中融合小鼠的B 淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞，产生杂交瘤细胞，经过筛选分离出单个杂交瘤细胞，再使单个杂交瘤细胞扩增，最后分离、纯化抗体。但这种方法产生的是纯粹的小鼠单克隆抗体，它使患者产生免疫排斥反应。为了克服鼠源性抗体的免疫排斥反应，科学家研究各种各样的技术使小鼠的抗体人源化。一种方法是用人的组分取代小鼠单克隆抗体抗原结合区以外的部分。另外一种方案称为抗体的人源化，即利用遗传工程的方法，用人源蛋白尽可能多地、有选择地取代小鼠抗体，包括大部分抗原结合区。经过长达25

5、 年的努力后，研究者最终把人类B 细胞与骨髓瘤细胞融合，形成的杂交瘤细胞可以产生完全人源化的抗体。它使单克隆抗体更接近商品化。也有一些公司转向研究转基因动物和植物，即通过物理、化学或生物学方法，将编码人源性蛋白质的基因转入实验动物（如鼠、羊、牛等）的受精卵中，再将受精卵植入动物子宫，最后培育出可以表达目的蛋白或多肽的转基因动物。转基因哺乳动物在它们的乳汁中分泌单克隆抗体，如表达人胰岛素的转基因羊或牛，这些羊或牛的奶中就含有人的胰岛素，这样，一只羊或一头牛就是一个生物发生器，通过喂养饲料（草）就可以生产胰岛素，大大降低了生产成本，具有巨大的商业价值。但这类产品还没有得到FDA 认证，此外从乳汁的

6、蛋白中分离单克隆抗体需要经过烦琐的步骤，并且遗传学方法改造以及喂养这些动物还需要花费很多年。传统制备单克隆抗体的方法需要融合细胞杂交瘤细胞1.将抗原注射到小鼠体内，产生针对该抗原的抗体。2.a. 从脾脏中分离各种B 淋巴细胞（可以产生抗体的细胞）。2.b. 从骨髓瘤（一种骨髓癌）中获得可以无限繁殖的骨髓瘤细胞。3.融合的细胞形成杂交瘤细胞，未融合的细胞则死亡。4.分离杂交瘤细胞，并在培养基中进行分裂增殖。5.挑选可以与初始抗原结合的杂交瘤细胞。6.在实验室或小鼠腹腔中使杂交瘤细胞增殖。7.从培养基或小鼠腹水中纯化抗体。噬菌体感染细菌的病毒，可以替代杂交瘤细胞1.将编码与抗原结合的各种抗体片段的

7、基因插入细菌细胞，再用噬菌体感染细胞。2.被噬菌体感染的细菌产生新的噬菌体，每个噬菌体的一端携带一个不同的抗体片段。3.从噬菌体混合物中，筛选出携带抗体片段的噬菌体，这些抗体片段仅与目的抗原特异结合。重复上述过程2-3次。4.将筛选出的噬菌体基因放回细菌中，制备大量、特异的抗体片段。5.将抗体片段拼接在抗体骨架上，制备完整抗体。1.3 单克隆抗体优点单克隆抗体有很多优点,如:高度的单一性和均一性;高效价;免疫抗原不需提纯,但可获得纯抗体;可获得不同特异性(组、型、株) 的单克隆抗体 ;产量高,可连续生产等。这些优点中,尤其是均一的高特异性,使单克隆抗体有着极广泛的实用价值,在世界上已形成颇为热

8、门的新兴产业。2多克隆抗体制备用提纯病毒液免疫大耳白兔, 第一次耳静脉注射013mg , 以后为肌肉内多点注射, 每两周注射1次, 每次015mg , 用等体积弗氏不完全佐剂(Sigma) 乳化, 共免疫3 次, 末次注射2 周后从耳静脉取血测定抗血清效价。传统制备大量抗体的方法主要有2 种,一种方法是直接免疫大型动物(如兔、山羊等) 后获取抗血清,该方法制备的为多克隆抗体,具有免疫用抗原需要量高、免疫周期长、购买和饲养大动物成本较高等局限性;第2 种方法是采用杂交瘤技术8筛选获得杂交瘤细胞株后,用癌细胞诱发腹水的方法来获得大量的单克隆抗体. 目前应用最为广泛的主要是鼠源性的单克隆抗体,该方法

9、制备细胞株时间比较长,需经常冻存和复苏细胞株,对实验条件、无菌操作等要求较高,并有细胞株分泌抗体能力丢失的风险. 特异性的抗体制备是很多实验室经常要做的一项工作,采用有限的抗原免疫成本低、容易饲养的小鼠,经济高效地获得特异性的抗体是科技人员的理想选择. 我们以人绒毛膜促性腺激素和人免疫球蛋白作为抗原,通过小剂量、多次免疫Balb/ c鼠,于免疫鼠腹腔内注射石蜡油和NS - 1 骨髓瘤细胞刺激产生腹水的方法,获得了大量高效价的抗hCG和抗人免疫球蛋白的鼠源性多克隆腹水抗体,为研究和应用提供了基础.3 单克隆抗体的应用价值分析3.1 细菌学方面的作用利用单克隆抗体鉴定和分离微生物成分,有助于研制新

10、疫苗,改进现有疫苗。例如:研制出副作用少的破伤风多肽菌苗。3. 2 病毒学方面的作用人类对于由流感病毒抗原性突变产生的病毒突变株缺乏免疫力,往往在其抗原性突变时引起世界性流行。风流感病毒血凝素抗原的单克隆抗体,已检出以前不能检出的毒株之间的差异。这样就能及时监测病毒的抗原变化,遏制流感的世界性流行 。43. 3 传染病学方面的作用3.3.1 传染病的诊断将单克隆抗体制成特异性的诊断试剂盒,能够早期、快速、准确地用于乙型肝炎、流行性出血热,风疹病毒等传染病的诊断。如我国制备的乙型肝炎血凝试验诊断试剂盒达到世界卫生组织认可的标准。3.3.2 传染病的治疗用细胞工程产生的单克隆抗体,着重调节机体的免

11、疫功能而较少副作用,因而在多种疾病的治疗上,具有传统药物所不可替代的作用。如单克隆抗体可取代高效价的人免疫球蛋白制剂,作为抗生素的辅助治疗,降低某些传染病的发病率和死亡率。在我国用单克隆抗体技术治疗乙型脑炎获得突破,已用于乙脑的临床治疗。这在国内外尚属首次。3.4肿瘤学方面的作用3.4.1 有助于研究肿瘤的发生机制如蛋白激酶C(PKC) 于1971 年被发现以来,在生命活动中日益显示出它的重要性,不仅在生命信号系统中起重要作用,而且是肿瘤促进剂佛波脂的细胞内受体,与肿瘤发生有着密切的关系。PKC 单抗的制备,可有助于探讨PKC 在细胞增殖和转化中的作用。53.4.2 肿瘤诊断用同位素标记单克隆

12、抗体,可追踪寻找体内的特异性抗原。如检查肿瘤细胞的转移或扩散;也能制造出具有特殊选择性的单克隆抗体 ,在癌症早期无症状时获得诊断,而这时,癌症大多是可以治愈的。3.4.3 肿瘤的治疗单克隆抗体还用于治疗肿瘤,一种是直接治疗法。第二种是将单抗作为载体,与抗癌药物如:放射性核素、毒素、化疗药物等交联,制成“生物导弹”,直接达到肿瘤内,杀死癌细胞。这样还可减少对正常细胞的杀伤。这种肿瘤生物疗法有可能成为继手术、放疗、化疗之后的第四种肿瘤治疗方法。6例如:用人的抗体GM2 单抗局部注射治疗恶性黑色素瘤已取得较好疗效。最近有报道:美国科学家以单抗为基础制成的“RITUXAN”,用于治疗非何杰金氏淋巴癌,

13、这种治癌新药与化疗不同,不会伤害癌变病灶周围其他种类的细胞。3.5 移植免疫学方面的应用应用抗T 细胞,抗IL - 2R 的单克隆抗体可防治器官移植排斥反应,目前已用于肾移植患者,可延长移植物的存活时间。此外,在生殖免疫学方面,单抗还是寻找精子抗原研究精子表面大分子的结构与功能的最重要的分子探针。迄今为止,人们用单抗已找到不少人和动物的精子抗原。因为精子必须经过获能(CA) 和顶体反应(AR) 才具有受精能力,故利用单抗研究CA 和AR 前后精子细胞内和细胞表面大分子的变化,可探索新的避孕方法和男性不育诊断及治疗的新途径。3.6单克隆抗体帮助学习科学家已为将来开发一种能增强学习效果的药物打下基

14、础。有认知困难,反应迟钝的人将可以接受一种以单抗B6B21 为基础出来的药物的治疗。这种单抗能与大脑的某些受体结合,将其注射到家兔体内后,这些家兔在完成简单任务的时候,速度提高了一倍。3.7生物工艺学方面的应用制成能与特殊细胞反应的单抗,应用于细胞分离。再如:使用能表达人类淋巴细胞表面抗原的昆虫细胞制备的单抗,不激发针对人类细胞的免疫反应,故可使用源于人的建株细胞进行单抗的筛选,可大大减化筛选过程。3.8基因工程方面的应用鼠源单抗用于治疗有一定的困难,一个替代方法是用DNA 重组技术创造人鼠嵌合体,这样构造的抗体既保持了鼠单抗的特异性和亲和力,又大大减少了在人体内的免疫原性。如抗胃癌、抗小细胞

15、肺癌的嵌合抗体已制备出来,抗乙脑病毒单抗轻链可变区基因的被分离和鉴别。7此外,单抗还用于基因目的产物的提纯后处理工艺。3.9基础研究方面的应用对抗原的深入研究。分析细胞表面抗原及形态。血中T 淋巴细胞亚类的鉴定。分析病原菌抗原。抗体结构和功能的进一步研究。鉴定微生物。由此可见,单抗技术已深入到医学和生物学的各个领域,成为一种必不可少的工具,具有极为重要的理论研究价值和实用价值。目前,单抗技术已基本完善,大量的单抗已应用各个领域。当前的研究重点是制备、应用新的单抗,扩大已有单抗的应用范围,特别是临床治疗的单抗和导向药物,尚有较大潜力。4 单克隆抗体研究新进展4.1 DNA 免疫DNA 免疫,也叫

16、基因免疫。1990 年Wolf 等发现小鼠肌肉直接注射纯化的DNA 或RNA 重组表达载体,可使载体上的基因在局部肌细胞内表达持续数月甚至终身,而且没有检出外源核酸与宿主染色体整合。这一发现打开了通往一种新的免疫途径的大门。由于不加任何佐剂或载体,故又称为裸DNA 免疫。以遗传物质方式直接进入机体的DNA 免疫与传统的蛋白免疫及用基因工程技术制备的纯化蛋白免疫相比有很多优点:该技术是将编码目的抗原或病原体的质粒DNA 接种于宿主体内或细胞内。这些目的抗原或病原体在胞内合成,产生可直接与类或类MHC 分子结合的抗原肽以呈递抗原,激起机体广泛的免疫反应,使机体对质粒所编码的抗原产生强烈而持久的细胞

17、和体液免疫应答。用含开放读码框和合适真核转录翻译控制信号的质粒DNA 免疫,可诱发机体合成构象及翻译后加工形式与天然结构相同的蛋白。内源蛋白的合成类似病毒的感染,可以以类途径呈递外源蛋白,而专职APC 摄入可溶蛋白,可以以类途径呈递蛋白。因此免疫反应的两条途径都被激活。此外,DNA 免疫不会引起由活病原体感染引起的细胞死亡及炎症等组织变化。各种因素影响着DNA 免疫后基因的表达,包括使用的质粒、给药方式及器具。目前使用的质粒通常含来自人巨细胞病毒、SV40 病毒及- 肌动蛋白的极早期启动子,它们可以在许多类细胞中引发高水平的基因表达。最近对DNA 表达载体的改进包括增加内含子和有效的转运终止/

18、 加工单元、修饰载体增强抗原表达、改良物理转运方法9,10和佐剂的使用11 。 Briones M1213 等用可生物降解和相容的聚合物制备吸附质粒的阳离子微粒,通过改变微粒上DNA 的载荷,同时转运几种质粒增强免疫反应。增强DNA 反应性的方法包括增加DNA 的稳定性,增加DNA 在被注射组织中的分散性,以及共表达共刺激因子(如B27. 1 、B27. 2 和CD40) 1415 ,增加抗原的呈递或共刺激作用,或者通过共表达细胞因子、免疫刺激因子(如IL22 、IL27 、IL210 、IL218 或GM2CSF) 增强免疫反应16 。IL212 在先天性和获得性免疫中起主要作用,它可诱导静

19、息和激活的T 细胞以及N K 细胞产生大量的IFN2,因此常作为佐剂增强DNA 的反应性;但Chen17等的研究却证实IL212 表达质粒抑制一种日本脑炎病毒DNA 疫苗的保护性免疫反应。另一个途径是使用双顺反子载体,装载抗原和免疫反应增强子的基因。DNA 免疫也可以用来产生针对非病毒病原体的抗体。通过肌肉注射质粒DNA ,已经成功地产生了针对一种原生动物寄生虫(Schistosoma japon2icum) ,原生生物(Leishmania major 和Plasmodiumjoelii ) , 细菌( Mycobacterium tuberculosis ) 和Salmonella typ

20、hi ,Mycoplasma pulmonis 的抗体反应。Tang 等的研究表明用含外源基因的真核表达载体免疫动物,能有效刺激机体产生体液免疫应答,该技术已被成功地应用于单抗的制备,Barry 等用此方法成功制备了高亲合力的抗人生长激素单克隆抗体,能结合天然的生长激素。目前, 运用DNA 免疫的方法, 已成功制备了生长激素、flt318 、凝血因子IX、INF219和血型抗原20等,病原微生物如:prion、Helicobacter pylori 和HIV ,膜分子G- 蛋白偶连受体等的单克隆抗体。最近Li20等采用肌肉组织特异性的启动子来进一步提高DNA 免疫的效果,其基本思想是构建含肌肉

21、组织特异启动子DNA 免疫载体,使抗体的亲合力增加了10 倍。因此,在目的基因前加上肌肉组织特异的启动子或改构表达载体上的调控序列,可提高DNA 免疫抗体的亲合力。DNA 免疫制备单克隆抗体除了上述优点外,由于基因操作简单,对免疫原性较弱的蛋白,通过与免疫原性较强的蛋白构建融合基因载体进行免疫,如HIV 的外壳基因Env 和补体成分C3d DNA疫苗表达融合蛋白可增强HIV 外壳蛋白抗体的亲合力成熟21 ;同时也可以构建含有多种蛋白的融合基因载体进行免疫,产生针对不同蛋白的单克隆抗体。因此,DNA 免疫的研究日益引起学者们的关注,且得到越来越广泛的应用22 。 1 雍占高.何谓单克隆抗体J.

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