反向遗传学策略及其在寄生虫研究中的应用

1、本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载反向遗传学策略及其在寄生虫研究中的应用本文从网络收集而来，上传到平台为了帮到更多的人，如果您需要使用本文档， 请点击下载按钮下载本文档（有偿下载），另外祝您生活愉快，工作顺利，万事 如意！反向遗传学（eversegenetics是从基因的结构出 发，认识基因的功能的学科。在遗传学的杂交分析时 代，人们从生物体的性状改变来认识基因，称为正向 遗传学（orwa_dgenetics随着人们对基因的研究和认 识的深入， 如今更多情况下是运用物理和化学的原理 以及计算机

2、技术和实验技术直接剖析基因的物质结 构，在分子水平上揭示基因的结构和功能。当人类基 因组计划（humangenomeprojectHGP完成，并进入后 基因组时代之后，大量已测序基因的功能有待进一步 阐明。因此，运用与发展分析基因功能的反向遗传学 的方法和技术已日渐成为生物研究领域的热点。1反向遗传学策略正向遗传学的思路是从表型开始，确定相关的基 因;而反向遗传学正好相反，是从一个新基因开始，希 望确定相关的表型。一旦基因序列得到确定，接下来就是阐明其功能。 判定未知基因的功能可以通过计算机分析和实验研 究。计算机分本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载本文为网络

3、收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载析基因功能最有力的工具之一是同源性 检索(homologysearch),同源性检索可提供整个基因或 基因片段的功能信息。但同源性检索并不能确定所有 新基因功能，需要用实验方法来补充和扩展同源性检 索的结果，这才是基因功能研究中最大的问题。传统研究的基本原则是通过确定突变体中的失活 基因来确定对应于表型的基因。如果从基因而不是表 型出发，那么相应的策略就是进行基因突变，确定该 基因所导致的表型改变，这就是用于确定未知基因功 能的实验技术基础。下面是实验室中常用的几种反向 遗传学方法。通过灭活基因确定未知基因功能采用实验技术在分子水平上灭

4、活特定基因，然后 从整体上观察表型改变，可以推测相应基因的功能。 灭活特定基因的方法有以下几种。基因敲除(geneknockout)早期，人们用基因敲除将一个结构已知但功能未 知的基因剔除，或用其他顺序相近基因取代，然后从 表型改变推测相应基因的功能。比如Mota等通过基因敲除技术研究TRAP基因在伯氏与约氏疟原虫中的 功能及其差异。 传统的基因敲除方法虽然可以确定一 些基因的功能，但存在技术要求高、操作过程烦琐、 花费大等方面的弱点，本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载在一定程度上限制了它的广

5、泛 应用。反义RNA(antisenseRNA)反义RNA作为反向遗传学的另一种方法，曾广 泛应用于研究基因功能， 至今在基因功能鉴定上仍发 挥着作用。Yao等利用反义RNA下调基因表达，分析 了利什曼原虫表面蛋白水解酶的重要作用。但是用反 义RNA关闭基因表达具有作用较弱等缺点。干扰(RNAinteferenceRNAi)外源和内源性双链RNA(double-stra ndedRNA，dsRNA)在细胞内诱导同源序列的基因表达受到抑制 的现象称为RNA干扰，是1998年由Fire首次发现并 命名的转录后水平的基因沉默， 是 Sci-enee?和Nature) 评出的2002年度最重要的科技成

6、果之一， 以其简单有效的特点正成为替代其他基因灭活方法的 重要的反向遗传学研究工具。基因过表达(geneoverexpression)Simonet等利用此技术研究小鼠，用含有仅在肝 细胞中表达的高活性启动子使小鼠过表达OPG(osteoprotegeii n基因，得到的转基因小鼠的骨密 度明显高于正常小鼠，说明该基因参与骨质合成。其 他研究基因功能的方法定点诱变(site-directedmutagenesis或体夕卜诱变(invitromutagenesis)可以用来探索基因的具体功能。使 用各种定点诱变或体外诱变可以缺失或改可合成蛋白 质，并保留本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他

7、应用文档，如需本文，请下载本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载主要活性。通过这种方法可以研究基因中 某些序列编码的氨基酸在整个蛋白质中所起的作用， 如可能是控制蛋白质在细胞中的定位或者负责蛋白质 对化学信号的反应等；利用定点诱变还可以产生基因 的突变体比较突变体与原基因的功能差异，可进一步 认识基因的功能。如黄长晖等通过体外定点诱变生成 抑癌基因P16的P48L和D74N突变体来研究该基因的功能5此外，基因功能的线索可以通过研究基因表达的 时间和空间来获得。如果基因的表达限制在多细胞生 物的特定器官或组织，或者器官或组织中的某类细胞， 那么这种定位信息就可以用来

8、推测基因产物的一般功 能。2以RNAi为基础的反向遗传学在寄生虫研究中 的应用概述RNAi作为反向遗传学的一种方法，为后基因组 时代的基因功能分析提供了一个可靠而又快速的应用 平台。RNAi克服了传统的基因剔除、转基因等方法的弱点，以其快速、可靠、经济的特点受到越来越多 生物学家的重视。RNAi正广泛应用于基因功能研究。Kiehl等将在秀丽隐杆线虫(Cae norhabditisele-ga ns肌肉和神经组织中高度表达 的未知功能的atx-2基因和fox-1基因的双链RNA分 别导入本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他

9、应用文档，如需本文，请下载L4期幼虫体内触发产生RNAi,发现atx-1基因 表达被干扰后，幼虫的下一代胚胎发育受到抑制；当fox-基因表达受到干扰时， 成虫的产卵率明显下降。 从而得知atx-1基因和fox-1基因的表达分别与胚胎发 育和成虫生殖有关61。Fraser和Conczy等合成了大量 与开放读框相对应的特异性的dsRNA以及表达这些dsRNA的细菌克隆，结合子代分析和时间推移差异干 扰 比较 显 微 分 析(time-lapsediffere ntiali nterfere ncec ontrastmicroscopyas say)的方法，成功地在基因组水平上大规模地筛选了 功能基

10、因，证明了秀丽隐杆线虫一号、三号染色体上 与早期胚胎细胞分裂及细胞代谢等相关基因的功能。Vayssie等在溶组织内阿米巴中通过RNAi证明了7-微管蛋白对于微管成核作用(microtubule nu cleati on)的重要性。Levashina等用dsRNA敲除蚊虫的一种补 体样蛋白基因，证明了它在昆虫与脊椎动物免疫吞噬 作用中的功能具有保守性。Blandin等用除蚊虫的防御素基因（祝細本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载gene证明了它的功能。Bettencourt等通过注射dsRNA到c

11、ecropiapupae来沉默其Hemolin基因揭示了它对下 一代的胚胎正常生长具重要作用。分子机制Fiie等将dsRNA导入线虫体内观察到RNA干扰 现象。然而将dsRNA(长-bp)导入到较高级的哺乳动物 培养细胞，出现的不是特异的RNA干扰，而是细胞 的基因表达全面受抑制和细胞凋亡等现象；Zamoie等发现诱导产生干扰时dsRNA被切成2125个碱基的RNA片段这种小片段的RNA也存在其他生物的RNA干扰模型中，被称为小干扰RNA(smalli nteferi ngRNA,siRNA),RNA干扰可能正是 由siRNA诱导。研究表明，RNA干扰可能的机制和 过程是:外源dsRNA进入细

12、胞后， 与一些蛋白质RNA依 赖 的RNA聚 合 酶(RNA-depe ndentRNApolymerase,RdRP等结合，在螺 旋酶等的协同下，dsRNA被大量复制；然后在一种类 似核酸酶II的RNA内切酶Dicer作用下，dsRNA被 降解成2125nt大小的小片段dsRNA,即卩siRNA;siRNA和某些尚不确定的蛋白质结合形成复合物-RNA诱导 沉默复合物(RNA-inducingsilencecomplex,RISC)在RISC形成过程中，已知起作用的酶蛋白有Dicer酶和AGO(argonaute蛋白家族中的AG02Dicer与AG02通 过本文为网络收集精选范文、公文、论文、

13、和其他应用文档，如需本文，请下载本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载二者都具有的PAZ结构域(Piwi，Argo naute,Zwille/pineheadPAZ)相互作用，从而促进了RISC形成。RISC特异性地识别、结合mRNA,并且RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA,切割位点就是与siRNA中反义链互补的mRNA序列;被 切割后的断裂mRNA随即降解，从而使蛋白质合成失 去了所依赖的mRNA模板，产生了转录后的基因沉默(post?transcriptiongenesilencingPTGS。研究 显示，RNAi具有放大效应，被降解的mRNA片

14、段及未被降 解的完整mRNA均可作为引物， 在RdRP作用下， 合 成更多的dsRNA,新合成的dsRNA再进入新一轮的RNAi循环;在这种类似正反馈的作用方式下， 靶mRNA逐渐减少， 呈现基因沉默现象。特点与意义RNA干涉对基因功能的研究具有许多传统方法 无法比拟的特点与优势，因此越来越受到研究者的关 注。首先，特异性地只抑制目的基因是RNAi最显著的特征;其次，抑制基因表达的高效性与抑制效应在细 胞之间的可传播性也是RNAi的重要特点。当进入后 基因组时代，人们需要大规模高通量地研究基因功能。 传统的方法可能需要花费6个月的时间关闭某个基 因，RNAi技术却可以在一周中关闭10个基因的表

15、达。 正是因为RNAi能高效特异地抑制基因表达，RNAi已逐渐成为替代其他基因功能研究方法本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载不可缺少的工 具。美国麻省理工大学医学中心的PhillipZamore预言：“RNAi将在哺乳动物细胞遗传学上引起革命性的变 化。 ”3可遗传的反向遗传学在寄生虫研究中的进展 最初的RNAi技术是通过注射或浸泡等方法直接 将dsRNA导入到线虫的性腺或早期胚胎中，虽然观察 到RNA干扰现象，产生表型变化，但这种变化却不 能遗传或遗传效应不强。在蠕虫的小肠内注入dsRNA,

16、能引起蠕虫各部位的RNAi效应，也能下传一代至数 代，但只在第一代中比较稳定。为解决RNAi效应不可遗传的问题，Tav-ema akis等对RNAi技术进行了改进，将目的基因靶序列以反 向重复方式插入热激蛋白启动子Hsp16-2的下游，然 后将其转入宿主菌中，热激处理后，反向重复序列(IR)在细胞内开始转录并产生具有发夹环结构的RNA(hairpin-loopRNA),这种发夹样的dsRNA进行RNA干扰，则能获得稳定的遗传，即建立了可遗传的RNAi技术f2021。改进后的RNAi技术运用了转基因 技术，与传统的RNAi相比具有明显的优点，除了可 以遗传外，dsRNA可以被诱导产生，使得RNA

17、i能够 在发育特定阶段出现，从而可以研究发育早期必需基 因在发育晚期的功能；此外，如果用细胞特异性启动子 控制dsRNA的表达，就可以研究特定基因在不同器官 中的功能。这种可遗传本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载和可诱导的基于转基因的RNAi技术将进一步推动反向遗传学向前发展。建立dsRNA可遗传和可诱导的表达需要选择合 适的可诱导启动子。常用的启动子如热激蛋白启动子(heatshockprotein,Hsp直接作用较弱且短暂，并且在生 物体生长过程可能产生不必要的作用。为避免此类问 题发生，

18、Kennerdell和Ca thew用GAL4/UAS二分系 统控制dsRNA在果蝇中的表达，实现了稳定的诱导性 或细胞特异性控制RNAi的发生。他们的做法是将目 的基因与UAS相连转入一果蝇体内，热激启动子或其 他组织和阶段特异性启动子与GAL4连接转入另外一 只果蝇，当二者作为亲本杂交后，产生的后代体内可 以通过GAL4/UAS系统激活目的基因，出现相应的表 型。在构建dsRNA的反向重复序列中插入短的内含子 序列就可以进一步提高RNA干扰作用的效率。同样， 在GAL4/UAS系统的基础上建立的可诱导可遗传的dsRNA表达策略也可运用于蚊虫及其他寄生虫基因 功能的研宄。在蚊虫的可遗传RNA

19、i可选用Vg(vitel-Iogenin)启 动子。Vg基因可以启动蚊防御素(dfi-frnsins)的表达。Vg基因的上游包含3个调节区域：近侧区(121/-619)负责低水平的组织和阶段特异性的表达，中间区 (619/-1071)负责Vg表达的阶段特异性激素的增强， 远侧区(-1071/-2015)对Vg高水平表本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载达是不可缺少的。布氏锥虫的RNAi效应持续时间较短，不能传递 到子代细胞。研究发现主要因为dsRNA在布氏锥虫易 被降解所致，降解dsRNA的酶对

20、转基因寄生虫保持稳 定的RNAi效应至关重要。对于布氏锥虫的可遗传的 反向遗传学研究已经构建了两种RNAi载体:一种是采 用四环素诱导的启动子载体将反向重复的基因序列插 入到启动子的下游，生成发夹环结构的dsRNA,需要三 步克隆构建载体；另一种是利用四环素诱导的一对反 向的T7RNA聚合酶启动子载体在两启动子中间插入 目的基因序列，然后在体内产生dsRNA,仅需一步克隆。因此，双T7启动子系统适用于大规模基因功能 分析。4常用于反向遗传学的模式生物通过了解较为简单的模式生物(modelorga n-ism)的基因组，可为哺乳动物和人类的基因功能鉴定提供 线索；并且可以通过从简单的基因组分析入

21、手建立技术、积累经验。秀丽隐杆线虫1998年由Fire命名的RNAi正是在秀丽隐杆线虫 中发现的。这种线虫已成为生物学中一个非常重要的 模式生物。此线虫所有的基因序列已知，适合于反向 遗传学研究，许多实验室选择它作为研究和发展反向 遗传学技术的材料。 目前，本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载用RNAi技术分析这种线 虫全部19000个基因的研究正在进行中。此外，秀丽 隐杆线虫基因组功能分析也弄清了许多保守的生物过 程和分子途径。而且，从秀丽隐杆线虫到人类的进化 保守性十分明显，其许多已知基因都

22、与人类基因有明显的配对，其中包括与人类疾病有关的基因。布氏锥虫学实验的寄生虫。Ngo等用a彳微管蛋白dsRNA使 布氏锥虫的细胞微管蛋白mRNA表达下调，从而使表 型发生改变。Bastin等构建了一种可诱导反向表达副 鞭毛杆蛋白(paraflagellarrodproteinPFRA)的锥虫细胞 系snl-2。通过诱导，PFRA基因的dsRNA表达，PFRA蛋白迅速消失，使副鞭毛的构造也受到影响，导致细 胞不能运动。Wang等用RNAi研究布氏锥虫的拓扑异 构酶II的功能，发现它在线粒体DNA的网络式调节 中起重要作用31。在锥虫中已用RNAi抑制了许多mRNA的表达，然而大约一半的实验研究中

23、，虽然下 调了表达，表型并没有发生改变，可能因为有一些具 有抵抗性的细胞通过重组取消了插入的反向重复序列的作用，使细胞中总有剩余的mRNA,基因合成的产物 并未完全消失。尽管如此，RNAi已为布氏锥虫的反 向遗传学研究提供了一个新颖有力的工具，并将继续 进行下去。弓形虫弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫。与其他多数 寄生虫本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载相比，弓形虫是一种在实验室中易于操作加工 的生物，它具有高效转化性，易繁殖，易观察和可利 用的细胞标记物多等特点；更重要的是，对弓形虫的基 因组

24、研究显示，它的部分基因与RNAi相关的重要酶 蛋白基因具有同源性，如AGOQicer和RdRp。弓形 虫的速殖子可表达大量的AGO样蛋白质，这些AGO样蛋白中也包含AGO具有的PAZ和Piwi两个结构域。 因此，弓形虫可能是特别适用于RNAi的生物之一。 通过与其他原虫生物比较发现，弓形虫所具有的许多 特点决定了它是顶端复合物中一个非常好的进行反向遗传学研究的模式生物。到目前为止，关于弓形虫的 反向遗传学的报道并不多，仅有Nakaar等用反义核酸 下调相应基因；Malhotra等使用dsRNA使半胱氨酸蛋白水解酶(cysteineproteases沉默;AI-Anouti等利用RNAi抑制了尿

25、嘧啶磷酸核糖转移酶(uracilphos-phoribosyltransferaseUPRT的表达。有的 实验室使用RNAi下调弓形虫某些基因未能出现相应 的表型变化，其原因是多方面的，如使用的dsRNA量 不够大，选用的启动子作用不够强，等等，还有待进 一步的研究。蚊虫蚊虫是疟原虫最主要的媒介，是媒介与寄生虫相 互作用研究的重要模式生物。近几年来，对蚊虫本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载转化的发展，可诱导的组织特异性启动子的鉴定和蚊 基因组序列的获得等。许多实验室通过转基因作用制 备各种转基因蚊用于疟原虫及其他方面的研究。将蚊 虫转基因技术和传统的RNAi结合起来已建立稳定的