利用植物叶绿体表达重组药用蛋白和疫苗研究进展.docx

1、|V容9技条孚曹IIOnlinesystem:农业生物技术学报JournalofAgriculturalBiotechnology2012,20(9):1080-1096DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2012.09.013评述与展望ReviewandProgress利用植物叶绿体表达重组药用蛋白和疫苗研究进展钟雪齐广砌I康岭生I刘剑锋2杨向东卜1吉林省农业科学院生物技术研究中心，长春130033:2吉林师范大学生命科学学院，四平136000*通讯作者,xdyang020918摘要植物是医用药物的重要来源之一，约占整个医用

2、药物市场的1/4以上。现代生物技术的发展进一步拓宽了植物在医药领域的应用范围，许多具有重要应用价值的重组药用蛋白在植物中获得成功表达,部分重组药用蛋白已进入商业化应用阶段。与其他重组为用蛋白生产系统相比,植物叶绿体生产系统具有独特的优势，如外源基因的高效和稳定表达、多基因表达、环境安全等。利用植物叶绿体表达系统生产的.重组药用蛋白和疫苗己达40多种。本研究对近年来利用叶绿体表达重组约用蛋白和疫苗的研究进展进行了综述，并就植物叶绿体表达重组药用蛋白方面的几个问题进行了探讨。关键词叶绿体生产系统,重蛆药用蛋白，口服疫苗RecentAdvancesinRecombinantPharmaceutica

3、lProteinsandVaccinesProductioninChloroplastsZHONGXue'口QIGuang-Xun'KANGLing-Sheng!LIUJian-Feng2YANGXiang-Dong1,1BiotechnologyResearchCenter,JilinAcademyofAgriculturalSciences,Changchun130033,China;2CollegeofLifeSciences,JilinNormalUniversity,Siping136000,China*Correspondingauthor,xdyang020918

4、AbstractsPlantshavebeenusedforhumanmedicineformanycenturiesandaccountforaboutonefourthofpresentprescriptiondrugs.Advancesinmodembiotechnologyhavefurtherextendedthepotentialsandapplicationsofplantsforhumanmedicinedevelopment.Manyimportantrecombinantpharmaceuticalproteinshavebeensuccessfullyexpressedi

5、nplantsandsomeofthemareeveninthecommercialpipeline.Amongseveralproductionstrategies,chloroplastengineeringoffersanumberofuniqueadvantagesincludinghigh-efficiencyandstableexpression,multi-geneexpressioninsingletransformationevent,environment-friendliness,etc.Morethan40functionallyactiverecombinantpha

6、rmaceuticalproteinssuchasvaccinesandvariousothertherapeuticproteinshavebeensuccessfullyproducedthroughchloroplastsengineering.Inthispaper,wegaveareviewonrecentadvancesinrecombinantpharmaceuticalsandvaccinesproductioninchloroplasts.Someconsiderationsforthechloroplast-derivedpharmaceuticalsproductionw

7、erealsodiscussed.KeywordsChloroplastproductionsystem,Recombinantpharmaceuticalproteins,Oralvaccines植物一直以来就是医用药物的最主要来源之一。直到20世纪初期,化学合成约物才首次超过植基金项目：国家自然科学基金(No.31000743)和吉林省留学人员科技创新创业项目收稿日期：2012-02-10接受日期：2012-04-044.2翻译后加工大多数商业化重组药用蛋白都需要进行广泛的翻译后修饰，如前肽加工、蛋白折叠、二硫键形成、糖基化等过程，才能形成稳定的，具有生物学功能的空间构象。蛋白翻译后修饰过

8、程也在很大程度上影响了重组药用蛋白的稳定性、药物动力性和生物学活性。如胰岛素、IFN-a2b、人生长激素等均需要二硫键修饰后才能够形成正确的空间结构;莱姆病疫苗抗原OspA需要进行脂基修饰后才能形成稳定的具有功能活性的分子。一些复杂的抗体，如Guy's13等甚至需要在分子伴侣或酶的作用下才能完成多亚基的正确组装。就目前来看，尽管植物叶绿体基因组起源于原核生物，但仍然具有真核生物的一些特点。利用叶绿体表达的重组约用蛋白或疫苗能够进行适当的翻译后修饰过程如二硫键、酯基修饰等(Arlenetal.,2008;Staubetal.,2000;Gisbyetal2011;Glenzetal.,2

9、006)。许多体外或体内研究如巨噬细胞裂解分析、GM1结合试验、病原攻毒试验等进一步验证了叶绿体表达重组药用蛋白或疫苗的生物学功能。这也是叶绿体生产系统优于传统微生物生产系统的重要特点之一。另一方面，由于商业化药用蛋白呈现多种多样的结构，其分于量大小不一，有些药用蛋白如小分子量抗菌肽以及对细胞有毒性的蛋白不能利用核转化系统进行生产或表达水平较低。叶绿体表达系统则具有较好灵活性，不仅可以表达分子量较大、结构较为复杂的单克隆抗体如Guys13等，同时也可以表达一些分子量较小的抗菌肽(20个氨基酸)如抗菌肽MSI-99以及环肽RC101和PG1等(DeGrayetal.,2001;Leeetal.,

10、2010),且能够形成具有正常功能活性的分子。不过，与核表达系统不同，叶绿体中表达的重组蛋白通常不能够进行糖基化修饰。由于目前已批准进入商业化生产的药物蛋白中，大约有1/3都是糖蛋白(WalshandJefferis,2006),虽然多数药用蛋白的糖基化修饰并不会影响蛋白的功能活性，但对于部分药用蛋白来说，糖基化修饰对于维持重组药用蛋白的稳定性、药物动力学活性或免疫学活性等均有非常重要的作用(Riceetal.,2005)。因此，利用叶绿体表达这些糖蛋白(如大多数抗体、B型或C型肝炎疫苗、狂犬病毒疫苗等)还存在一定的困难。目前只能选择一些无需糖基化修饰的药用蛋白或是部分核心蛋白序列进行表达，如

11、Madesis等(2010)利用烟草叶绿体表达了C型肝炎核心多肽抗原，并在免疫人血清中检测到该抗原的特异抗体。4.3叶绿体表达重组药用蛋白的功能虽然外源重组药用蛋白在叶绿体中可以获得高水平的表达和转录后修饰，但更为重要的是表达.重组蛋白是否具有相应的生物学功能。因此，评价叶绿体来源重组药用蛋白的其实性及其生物学功能，特别是在试验动物模型中的功能是叶绿体生产系统研究中的关键环节。一般来说,叶绿体中表达的重组蛋白一般需要在其N-末端添加一段多肽序列如GFP或MAS1S盒(包含5个氨基酸残基)以增强融合蛋白的稳定性。因此在进行功能分析时，需要明确这些序列是否会对药用蛋白的正确组装或功能活性产生影响。

12、另外，对于重组疫苗抗原来说，为了进一步增强目标抗原的免疫原性，通常需要将疫苗佐剂(如CTB.LTB以及-些白介素等)和目标抗原进行融合表达。因此，对于融合蛋白中药用蛋白或疫苗抗原的功能评价就显得十分重要。目前世界各国研究者对叶绿体表达的一些重组药用蛋白的生物学功能进行了体外或动物模型研究(表2,表3)。Daniell等(2009)研究了叶绿体表达胰岛素样生长因子IGF.1的功能，发现重组药用蛋白对HU-3细胞表现出明显的促进生长作用。Gisby等(2011)研究表明，利用叶绿体表达的人转化生长因子TGFb3可以有效抑制水貂肺上皮细胞的增殖。Arlen等(2007)发现，叶绿体来源的重组药物蛋白

13、IFN-a2b能够显著促进小鼠脾细胞MHCI的表达及NKC的增加。纯化IFN-a2b具有效保护试验小鼠抗转移痛的生物学功能。Davoodi-Semiromi等(2009)的研究结果表明，叶绿体来源的CTB能够有效识别和结合GM1,表明叶绿体表达的重组CTB的抗原结合位点具有较好的保守性。Koya等(2005)利用皮下注射和曰服CTB-PA融合抗原时均可诱发试验小鼠产生免疫反应。叶绿体来源的重组炭疽病疫苗PA免疫效率与来源于炭疽杆菌(8叫沮必anthracis)来源的PA抗原相近。利用烟草叶绿体表达的HIV-1抗原p24-nef对试验小鼠进行口服饲喂研究表明，重组抗原能够有效诱发抗原特异性IgG

14、抗体反应。利用叶绿体表达的人胰岛素原融合蛋白(CTB-Pins)能够降低试验小鼠的血糖水平显著下降(Boyhan,2011)。此外,利用叶绿体表达的人乳头瘤病毒疫苗抗原L1、疟疾疫苗抗原AMA1和MSP1等均能够有效诱发小鼠产生免疫反应。从目前己有的文献报道来看，利用叶绿体表达的重组药用蛋白或疫苗抗原的生物学功能多数已经过实验证实。不过仍有部分叶绿体来源的重组药用蛋白如干扰素IFNot5、单.克隆抗体Guy's13的生物学功能尚需进一步研究。4.4重组疫苗的口服目前广泛使用的疫苗(包括弱毒或灭活疫苗等)主要是通过皮卜注射诱导机体产生免疫反应。利用植物表达系统生产的重组疫苗为传染病预防提

15、供一个新途径。植物疫苗通常以两种方式进行接种免疫，一种方式是将重组蛋白分离纯化后用于注射免疫;另一种方式是通过直接食用表达重组疫苗的植物组织，或是将新鲜植物材料脱水处理后的粉末制成胶囊后进行口服。口服疫苗的优势在于不需要相应的纯化、加工、冷链运输、人工注射等步骤，因此极大地降低了成本，并避免了在生产、加工.及运输等环节中的污染问题。实际上，当重组药用蛋白首次在植物获得成功表达以来，口服疫苗就一直世界各国研究者的重点研究领域之一。与注射免疫不同，口服免疫-般需要大剂量的重组疫苗制剂才能够达到免疫效果，因此重组疫苗抗原能否在植物体内高水平表达是口服疫苗应用的重要因素之一。通常来说，利用核表达系统生

16、产的重组疫苗抗原表达水平较低(>1.0%),般需要浓缩后才能达到免疫需要的剂量。而叶绿体生产系统的高效表达特点则为重组疫苗的直接口服提供了有利的条件。有报道表明，一英亩转基因烟草就可以生产3.6亿单位剂量的具有功能活性的炭疽病疫苗抗原PAo可见，叶绿体表达系统为实现真正意义上的疫苗口服开辟了一条新的技术途径。另一方面，口服疫苗需要通过肠道细胞吸收后才能发挥免疫作用，由于肠道细胞通常对重组疫苗抗原的吸收能力较差，且重组抗原易被肠道蛋白酶降解，因而降低了疫苗抗原的吸收和免疫效果。因此，如何减少疫苗抗原在肠道中的降解以及促进肠道上皮细胞对疫苗抗原的吸收的是植物口服疫苗应用面临的一个重要问题。在

17、口服叶绿体来源的重组疫苗时，由于植物细胞壁、质膜、叶绿体双层膜的保护作用，进入肠道的疫苗抗原可以实现在肠道中定点释放，有效减少了肠道蛋白酶的降解作用。针对肠道上皮细胞对疫苗抗原吸收能力差的问题,Limaye等(2006)开发了受体介导口服免疫(receptor-mediatedoraldelivery)方法。该方法充分利用霍乱毒素B亚基-CTB能够和肠道上皮细胞上的特异受体GM1有效结合，并通过细胞内吞作用(endocytosis)进入肠道细胞的特点，将跨粘膜载体(transmucosalcarrier)蛋白分子与抗原蛋白进行融合(两个融合蛋白之间含有鱼rin剪切位点)，通过载体分子与肠道细胞

18、受体的有效结合，促进肠道细胞对重组抗原蛋白的有效吸收。口服疫苗应用的另外一个重要问题是重组疫苗抗原是否能够有效诱导体内产生免疫效应。病原攻毒试验表明，口服叶绿体来源的重组疫苗抗原可以有效诱导肠粘膜相关淋巴系统(gut-associatedlymphoidtissue,GALT)产生局部或全身特异性抗体IgA,而通过皮下注射疫苗抗原的小鼠则不能或极少产生相应的IgA抗体。Tezuka等(2007)认为诱发GALT分泌IgA抗体是口服免疫的一个独特机制,这可能与肠粘膜的独特微环境有关。对于一些通过粘膜组织侵入人体的传染性疾病如呼吸道疾病、肠胃疾病以及泌尿系统疾病等来说,IgA抗体在诱导机体产生粘膜

19、免疫反应方面具有极为重要的作用。除IgA抗体外，口服免疫也可以有效诱导机体产生抗原特异性抗体IgG。Koya等(2005)发现，口服炭疽病保护性抗原PA的小鼠产生免疫球蛋白G的含量是皮下注射的320000倍。口服HIV-1抗原p24-nef的实验小鼠能够产生抗原特异性IgG抗体反应。已有的一些研究也表明，口服疫苗的免疫效果优于常规注射方式，如Davoodi-Semiromi等(2009)发现，对于致死剂量的霍乱毒素来说，口服疫苗抗原CTB对小鼠的保护效果为100%,而皮下注射保护效果为89%o在50倍致死剂量的耶尔森菌(鼠疫病原菌)下，口服疫苗抗原CaFl-LcrV对小鼠保护效果为88%,而皮

20、下注射保护效果为33%。因此，口服疫苗独特的免疫机制和免疫效果为现有的疾病防治方式提供了一条新的途径。4.5安全性问题对于大多数被子植物来说，叶绿体基因组遗传方式多数为母性遗传(叶绿体基因组通过父本传递的比例般小于IO)因而有效降低了外源基因向周围近缘物种的逃逸以及转基因花粉对非靶标昆虫的影响。这也是叶绿体生产系统优于核转基因生产系统的重要特点之一。与核转化-样，在获得叶绿体转基因植株的过程中也需要使用筛选标记。目前在叶绿体遗传转化中使用的抗生素筛选标记基因包括(uulA(编码氛基糖昔-3-磷酸转移酶)、叩£口(编码新霉素磷酸转移商)、塑由-6(编码氨基糖昔磷酸转移酶类蛋白)(Day

21、etaL,2011),其中最为广泛使用的筛选标记是aadA.由于叶绿体转化高水平衣达的特点，筛选标记基因表达产物通常也会在植物细胞中积累到较高的水平。为避免抗生素筛选标记对人类健康和环境造成威胁，目前在叶绿体转化研究中发展了些标记去除技术(CorneilleetaL,2001;Dayetal.,2005)»其中一种方式是通过在标记基因表达盒两侧加上一段同向重复序列，通过叶绿体内同源重组前的作用，将位于同向重复系列之间的标记基因去除。另外一种方式是利用位点特异性重组系统去除外源标记基因。如Comeille等(2001)报道了采用P1噬菌体CRE-lox位点特异性重组系统去除叶绿体基因组

22、中的筛选标记基因。通过核基因组编码或授粉的方式引入的CRE重组酶将位于两个lox之间的筛选标记基因去除。最近Kittiwongwattana等(2007)报道了利用phiC31噬菌体位点特异性整合酶(INT),通过介导位于attB和attP位点之间的重组反应，将位于两个位点之间的标记基因去除。除了标记去除技术外，安全标记基因的利用也为有效降低叶绿体转基因植物的安全性问题提供了一条有效途径。目前在叶绿体遗传转化中使用的一些安全标记基因包括方财(编码草丁麟乙酰CoA转移酶，lamthametal.,2000),6oJ/i(编码甜菜碱醛脱氢酶),epsps(编码磷酸烯醇式丙酮酰莽草酸合成前，Yeet

23、al.,2004),hppd(编码4-羟苯丙酮酸二氧醵,Dufourmanteletal.,2004),wlSZ/编码突变乙酰乳酸合成醵，Shimizuetal.,2008)、asa2(编码突变邻氨基苯甲酸合成酶a.亚基，Baroneetal.,2009)等。如Dufourmantel等(2007)利用hppd作为筛选标记，获得抗三酮类和异嗯哇类除草剂的叶绿体转基因大豆植株。Shimizu等(2008)以突变mASL基因为筛选标记，获得叶绿体转基因烟草植株。Lutz等(2007)利用咄噪类似物4-甲基呵噪以及色氨酸类似物7-甲基-DL-色氨酸作为筛选剂也成功获得叶绿体转基因植株。最近,Baro

24、ne等(2009)利用烟草反馈不敏感型突变0502基因作为筛选标记成功获得了叶绿体转基因烟草植株。通过去除外源筛选标记基因或是选用安全的筛选标记无疑可以进一步加快叶绿体表达系统在重组药用蛋白生产中的应用。不过，有一点需要指出的是，与常规转基因作物不同，由于利用植物叶绿体表达系统生产的重组药用蛋白特别是口服重组疫苗在进入商业化生产前面临的安全性问题更为敏感，因此，利用标记剔除技术直接去除外源标记基因的方法可能更容易被公众接受。5展望近20年来，植物叶绿体生物反应器研究取得了较快的发展，一批具有重要应用价值的药用蛋白、疫苗等在叶绿体中获得成功表达(表2,表3)。与其他重组药用蛋白生产系统相比，利用

25、植物叶绿体生产的重组药物蛋白不仅可以实现高水平表达,而且能够在叶绿体中形成正确的空间构象。叶绿体生产系统高效表达特点不仅显著降低了重组药用蛋白的后期纯化成本，而旦进一步提高了药用蛋白纯化效果。同时，外源蛋白在叶绿体中的稳定表达利于实现重组药用蛋白生产过程中的质量控制。外源基因在叶绿体中的分室化表达也使得叶绿体表达系统更加灵活，一些分子量较小的抗曲肽或是利用核转基因系统无法表达的药用蛋白或多肽也能够在植物叶绿体中获得成功表达。叶绿体多基因表达的特点也为同时表达多个药用蛋白提供了有利的条件。值得一提的是，由于外源重组疫苗抗原在叶绿体中的高水平表达以及有效诱发机体产生免疫反应的特点，叶绿体表达系统也

26、为开辟新的疫苗免疫方式，实现疫苗曰服提供了一条新的技术途径。可以预见，随着研究的进一步深入，叶绿体表达系统将在重绢药用蛋白特别是口服抗原疫苗研究领域,展现出更加诱人的发展前景。当然，叶绿体表达系统也存在一些不足，如叶绿体转化植物种类较少、无糖基化修饰以及进入商业化生产前重组药用蛋白的临床评价等问题。相信随着研究的深入，这些问题将会逐步得到解决。致谢:本研究通讯作者曾在美国中佛罗里达大学HenryDaniell教授实验室进行为期-年的访问学习，期间HenryDaniell教授在叶绿体生物反应器研究方面给予了细致的指导，在此一并致谢。参考文献ArlenPA,FalconerR,Cherukumil

27、liS,ColeA,ColeAM,OishiKKandDaniellH,2007.Fieldproductionandfunctionalevaluationofchloroplast-derivedinterferon-alpha2b.PlantBiotechnologyJournal,5(4):511-525ArlenPA,SingletonM,AdamoviczJJ,DingY,Davoodi-SemiromiAandDaniellH,2008.EffectiveplaguevaccinationviaoraldeliveryofplantcellsexpressingFl-Vantig

28、ensinchloroplasts.InfectionandImmunity,76(8):36403650BallyJ,NadaiM,VitelM,RollandA,DumainRandDubaldM,2009.Plantphysiologicaladaptationstothemassiveforeignproteinsynthesisoccurringinrecombinantchloroplasts.PlantPhysiology,150(3):1474-1481BaroneP,ZhangXHandWidholmJM,2009.Tobaccoplastidtransformationus

29、ingthefeedbackinsensitiveanthranilatesynthasea-subunitoftobacco(ASA2)asanewselectablemarker.JournalofExperimentalBotany,60(11):3195BartaA,SommergruberKandThompsonD,1986.Theexpressionofanopalinesynthasehumangrowthhormonechimaericgeneintransformedtobaccoandsunflowercallustissue.PlantMolecularBiology,6

30、(5):347357.Birch-Machin1,NewellCA,HibberdJMandGrayJC,2004.AccumulationofrotavirusVP6proteininchloroplastsoftransplastomictobaccoislimitedbyproteinstability.PlantBiotechnologyJournal,2(3):261270BockR,2007.Plastidbiotechnology:Prospectsfbrherbicideandinsectresistance,metabolicengineeringandmolecularfa

31、rming.CurrentOpinioninBiotechnology,18(2):100106BoyhanDandDaniellH,2011.Low-costproductionofproinsulinintobaccoandlettucechloroplastsforinjectableororaldeliveryoffunctionalinsulinandC-peptide.PlantBiotechnologyJournal,9(5):585598CardiT,LenziPandMaligaP,2010.Chloroplastsasexpressionplatformsfbrplant-

32、producedvaccines.ExpertReviewofVaccines,9(8):8939l1CheboluSandDaniellH,2007.StableexpressionofGal/GalNAclectinofEntamoebahistolyticaintransgenicchloroplastsandimmunogenicityinmicetowardsvaccinedevelopmentfbramoebiasis.PlantBiotechnologyJournal,5(2):234239CorneilleS,LutzK,SvabZandMaligaP,2001.Efficie

33、nteliminationofselectablemarkergenesfromtheplastidgenomebytheCRE-loxsite-specificrecombinationsystem.PlantJournal,27(2):171-178CuiC,SongF,TanY,ZhouX,ZhaoW,MaF,LiuY,HussainJ,WangY,YangGandHeG,2011.Stablechloroplasttransformationofimmaturescutellaandinflorescencesinwheat(TriticumaestivumL.).ActaBiochi

34、micaetBiophysicaSinica(Shanghai),43(4):28429lDaniellH,2002.Molecularstrategiesforgenecontainmentintransgeniccrops.NatureBiotechnology,20(6):581586DaniellH,2006.Productionofbiopharmaceuticalsandvaccinesinplantsviathechloroplastgenome.BiotechnologyJournal,1(10):10711079.DaniellH,Carmona-SanchezOandBum

35、sB,2004.Chloroplastderivedantibodies,biopharmaceuticalsandediblevaccines:FischerR,SchillbergS.(Eds.),MolecularFarming.Wiley-VCHVerlag,Wein-heim,America,pp.113DaniellH,CheboluS,KumarS,SingletonMandFalconerR,2005.Chloroplast-derivedvaccineantigensandothertherapeuticproteins.Vaccine,23(15):17791783Dani

36、ellH,LeeSB,PanchaiTandWiebePO,2001.ExpressionofthenativecholeratoxinBsubunitgeneandassemblyasfunctionaloligomersintransgenictobaccochloroplasts.JournalofMolecularBiology,311(5):1001-1009DaniellH,SinghND,MasonHandStreatfieldSJ,2009.Plant-madevaccineantigensandbiopharmaceuticals.TrendsinPlantScience,1

37、4(12):669-679DaniellH,RuiGr,DenesB,SandbergLandLangridgeW,2009.Optimizationofcodoncompositionandregulatoryelementsfbrexpressionofhumaninsulinlikegrowthfactor-1intransgenicchloroplastsandevaluationofstructuralidentityandfunction.BMC,9:33.Davoodi-SemiromiA,SamsonNandDaniellH,2009.Thegreenvaccine:Aglob

38、alstrategytocombatinfectiousandautoimmunediseases.HumVaccin,5(7):488493Davoodi-SemiromiA,SchreiberMandNalapalliS,2010.Chloroplast-derivedvaccineantigensconferdualimmunityagainstcholeraandmalariabyoralorinjectabledelivery.PlantBiotechnologyJournal,8(2):223242DayAandGoldschmidt-ClermontM,2011.Thechlor

39、oplasttransformationtoolbox:Selectablemarkersandmarkerremoval.PlantBiotechnologyJournal,9(5):540553DayA,KodeV,MadesisPandlamthamS,2005.Simpleandefficientremovalofmarkergenesfromplastidsbyhomologousrecombination.MethodsinMolecularBiology,286:255-270DeCosaB,MoarW,LeeSB,MillerMandDaniellH,2001.Overexpr

40、essionoftheBtcry2Aa2operoninchloroplastsleadstoformationofinsecticidalcrystals.NatureBiotechnology,19(1):71-74DeGrayG,RajasekaranKSmithF,SanfordJandDaniellH,2001.Expressionofanantimicrobialpeptideviathechloroplastgenometocontrolphytopathogcnicbacteriaandftingi.PlantPhysiology,127(3):852862Dufourmant

41、elN,PelissierB,GarconF,PeltierG,FerulloJMandTissotG,2004.Generationoffertiletransplastomicsoybean.PlantMolecularBiology,55(4):479489DufburmantclN,DubaldM,MatringcM,CanardH,GarconF,JobC,KayE,WisniewskiJP,FerulloJM,PelissierB,SaiIlandAandTissotG,2007.Generationandcharacterizationofsoybeanandmarker-fre

42、etobaccoplastidtransformantsover-expressingabacterial4-hydroxyphenylpynivatcdioxygenasewhichprovidesstrongherbicidetolerance.PlantBiotechnologyJournal,5(1):118-133FairanI,Rio-ManterolaF,IniguezM,GarateS,PrietoJandMingo-CastelAM,2008.High-densityseedlingexpressionsystemfortheproductionofbioactivehuma

43、ncardiotrophin-1,apotentialtherapeuticcytokine,intransgenictobaccochloroplasts.PlantBiotechnologyJournal,6(5):516-527Fernandez-SanMillanA,Mingo-CastelA,MillerMandDaniellH,2003.Achloroplasttransgenicapproachtohyper-expressandpurifyhumanserumalbumin,aproteinhighlysusceptibletoproteolyticdegradation.Pl

44、antBiotechnologyJournal,1(2):7l79FischerRandEmansN,2000.Molecularfanningofpharmaceuticalproteins.TransgenicResearch,9(45):279-299FischerR,StogerE,SchillbergS,ChristouPandTwymanRM,2004.Plant-basedproductionofbiopharmaceuticals.CurrentOpinioninPlantBiology,7(2):152158GiddingsG,2001.Transgenicplantsasp

45、roteinfactories.CurrentOpinioninBiotechnology,12(5):450-454GisbyMF,MellorsPandMadesisP,201.AsyntheticgeneincreasesTGFb3accumulationby75-foldintobaccochloroplastsenablingrapidpurificationandfoldingintoabiologicallyactivemolecule.PlantBiotechnologyJournal,9(5):618-628GlenzK,BouchonB,StchleT,WallichR,S

46、imonMMandWarzechaH,2006.Productionofarecombinantbacteriallipoproteininhigherplantchloroplasts.NatureBiotechnology,24(1):76-77GoldsteinDAandThomasJA,2004.Biopharma-ceuticalsderivedfromgeneticallymodifiedplants.InternationalJournalofMedicine,97(11):705716Gonzalez-RabadeN,McGowanEG,ZhouF,McCabeMS,BockR

47、,DixPJ,GrayJCandMaJK,2011.Immunogenicityofchloroplast-derivedHIV-1p24andap24-Neffusionproteinfollowingsubcutaneousandoraladministrationinmice.PlantBiotechnologyJournal.9(6):629-638GrevichJJandDaniellH,2005.Chloroplastgeneticengineering:Recentadvancesandfutureperspectives.CriticalReviewsinPlantScienc

48、es,24(2):83-108.GudaC,LeeSBandDaniellH,2000.Stableexpressionofbiodegradableproteinbasedpolymerintobaccochloroplast.PlantCellReports,19(3):257-262HenryD,KumarSandDufburmantelN,2005.Breakthroughinchloroplastgeneticengineeringofagronomicallyimportantcrops.TrendsinBiotechnology,23(5):238245lamthamSandDa

49、yA,2000.Removalofantibioticresistancegenesfromtransgenictobaccoplastids.NatureBiotechnology,18(11):1172-1176KanagarajAP,VermaDandDaniellH,2011.Expressionofdengue-3prcmembrancandenvelopepolyprotcininlettucechloroplasts.PlantMolecularBiology,76(35):323333KanamotoH,YamashitaA,AsaoH,OkumuraS,TakaseH,Hat

50、toriM,YokotaAandTomizawaK,2006.EfficientandstabletransformationofLactucasalivaL.cv.Cisco(lettuce)plastids.TransgenicResearch,15(2):205-217KangTJ,HanSC,JangMO,KangKH,JangYSandYangMS,2004.EnhancedexpressionofB-subunitofEscherichiacoliheat-labileenterotoxinintobaccobyoptimizationofcodingsequence.Applie

51、dBiochemistryandBiotechnology,117(3):175187KangTJ,LocNH,JangMO,JangYS,KimYS,SeoJEandYangMS,2003.ExpressionoftheBsubunitofE.coliheat-labileenterotoxininthechloroplastsofplantsanditscharacterization.TransgenicResearch,12(6):683-691KhanMSandNurjisF,2012.Synthesisandexpressionofrecombinantinterferonalph

52、a-5geneintobaccochloroplasts,anon-ediblcplant.MolecularBiologyReports,39(4):43914400KimJY,KavasM,FouadWM,NongG,PrestonJFandAltpeterF,2011.ProductionofhyperthennostableGH10xylanaseXyl10BfromThermotogamariiimaintransplastomicplantsenablescompletehydrolysisofmcthylglucuronoxylantofermentablesugarsforbi

53、ofuelproduction.PlantMolecularBiology,76(35):357369KittiwongwattanaC,LutzK,ClarkMandMaligaP,2007.PlastidmarkergeneexcisionbythephiC31phagesite-specificrecombinase.PlantMolecularBiology,64(12):137-143KoyaV,MoayeriM,LepplaSHandDaniellH,2005.Plant-basedvaccine:miceimmunizedwithchloroplast-derivedanthra

54、xprotectiveantigensurviveanthraxlethaltoxinchallenge.InfectionandImmunity,73(12):82608274KumarS,DhingraAandDaniellH,2004.Plastid-expressedbetainealdehydedehydrogenasegeneincarrotculturedcells,roots,andleavesconfersenhancedsalttolerance.PlantPhysiology,136(1):2843-2854LeeMY,ZhouY,LungRW,ChyeML,YipWK,

55、ZeeSYandLamE,2006a.ExpressionofviralcapsidproteinantigenagainstEpstcin-BarrvirusinplastidsofNicotuuiatabacumcv.SRI.BiotechnologyandBioengineering,94(6):11291137LeeSB,LiBC,JinSXandDaniellH,2010.ExpressionandcharacterizationofantimicrobialpeptidesRctrocyclin-101andProtcgrin-1inchloroplaststocontrolvir

56、alandbacterialinfections.PlantBiotechnologyJournal,9(1):100-115LeeSM,KangK,ChungH,YooSH,XuXM,LeeSB,CheongJJ,DaniellHandKimM,2006b.Plastidtransformationinthemonocotyledonouscerealcrop,rice(Oryzasaliva)andtransmissionoftransgenestotheirprogeny.MoleculesandCells,21(3):401410LeelavathiSandReddyVS,2003.C

57、hloroplastexpressionofhis-teggedGUS-fusions:Ageneralstrategytooverproduceandpurifyforeignproteinsusingtransplastomicplantsasbioreactors.MolecularBreeding,11(1):4958LenziP,ScottiN,AlagnaF,TomesclloML,PompaA,VitaleA,DeStradisA,MontiL,GrilloS,BuonaguroFM,MaligaPandCardiT,2008.Translationalfusionofchlor

58、oplast-expressedhumanpapillomavirustype16LIcapsidproteinenhancesantigenaccumulationintransplastomictobacco.TransgenicResearch,17(6):1091-1102LiHY,RamalingamSandChyeML,2006.AccumulationofrecombinantSARS-CoVspikeproteininplantcytosolandchloroplastsindicatepotentialfordevelopmentofplant-derivedoralvacc

59、ines.ExperimentalBiologyandMedicine(Maywood),231(8):13461352LimS,AshidaH,WatanabeR,InaiK,KimYS,MukougawaK,FukudaH,TomizawaK,UshiyamaK,AsaoH,TamoiM,MasutaniH,ShigeokaS,YodoiJandYokotaA,2011.Productionofbiologicallyactivehumanthioredoxin1proteininlettucechloroplasts.PlantMolecularBiology,76(3-5):335344LimayeA,KoyaV,SamsamMandDaniellH,2006.Reccptor-mediatcdoraldeliveryofabioencapsulatedgreenfluorescentproteinexpressedintransgenicchloroplastsintothemo