口蹄疫疫苗免疫对比试验及疫苗质量问题研究.docx

1、口蹄疫疫苗免疫对比试验及疫苗质量问题研究李儒曙赵庆文游（1.珠海市动植物防疫监督检验中心，广东珠海森I,冷和平2,伍时达：5190（H）；2.恩平市金津猪场，广东江门529471）中图分类号：S858.285.3文献标志码：A近年来，口蹄疫的免疫防控任务越来越艰巨。对于部分猪场口蹄疫免疫失败的现象，有的学者把它归因于口蹄疫病毒的血清型或基因系列变异，然而，事实并不尽然。近几年珠海市动植物防疫监督检验中心在对珠海地区口蹄疫免疫抗体监测过程中发现，部分猪场的口蹄疫免疫抗体完全达不到有效预防口蹄疫的要求,有的猪场长期不合格，有的猪场年比一年差。为深入研究这问题,2011年711月，珠海市动植物防疫监

2、督检验中心组织珠海市安富来生物科技布限公司在恩平市金津猪场就当前养猪生产中广泛使用的某生物制药厂生产的两种0型口蹄疫疫苗进行如下免疫对比试验。1材料和方法1.1试验材料（1）试验猪。试验猪场70日龄健康猪136头。（2）试验用疫苗（以下X、Y、XX均仅为代号，并非特指）。O型口蹄疫（X毒株）浓缩苗（以下简称A苗），批号为H110101J：O型I蹄疫（Y毒株）浓缩苗（以下简称B苗），批号为H110530J:生产厂家为XX生物制药厂。（3）检测试剂。猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂（以下简称优耐特VP1试剂），生产厂家为上海优耐特生物医药有限公司，批号为201012004c1

3、.2方法和步骤（1）试验猪挑选和试验前抗体检测。试验猪场同批次63日龄健康、精神正常猪200头，逐头打耳缺编号，前腔静脉采血5mlJ头，分离血清并逐份做好耳号标记，送珠海市安富来生物科技有限公司猪病诊断实验室做口蹄疫免疫抗体检测。（2）试验分组和首免。根据上述抗体检测结果，挑选其中抗体检测值最接近平均值的猪136头，按配对试验分组方法分成4组，每组34头。试魅猪70日龄时，对照组每头颈部肌肉注射收稿日期：2012-02-29作者简介：李倜曙（1980-）,男，湖北黄石人，执业兽医师.硕士，主委从事重大动物疫病防控研5t.E-mail:linishu通讯作者:伍时达，高级善医师.E-mail:w

4、ushidal964文章编号:1002-1957（2012）02-0097-04生理盐水1mL,3个试验组分别每头颈部肌肉注射A苗1mL（说明书推荐免疫剂量）、A苗3mL（说明书推荐免疫剂量3倍星）、B苗ImL（说明书推荐免疫剂量）。（3）二免。首免28d后，对照组每头颈部肌肉注射生理盐水2mL,3个试验组分别每头颈部肌肉注射A苗2mL（说明书推荐免疫剂量）、A苗6mL（说明书推荐免疫剂量3倍量）、B苗1mL（说明书推荐免疫剂量：）。（4）试验结束期抗体检测。加强免疫28d后，所有试验猪逐头前腔静脉采血5mL,分离血清并逐份做好耳号标记，送实验室做口蹄疫免疫抗体检测。2结果和分析口蹄疫免疫抗体

5、合格率结果与分析从表1可见，未进行相应疫苗免疫或注射生理盐水处理前，对照组及各试验组抗体合格率均为94.12%:经两次相应疫苗免疫或注射生理盐水28d后，对照组免疫抗体合格率为9.09%,A苗推荐剂母:组、A苗推荐剂量3倍最组、B苗推荐剂量:组依次为17.86%25.80%和12.50%oA苗推荐剂取组免疫抗体合格率比对照组高8.77个百分点，A苗推荐剂量3倍量组比对照组高16.71个百分点，B苗推荐剂量组比对照组高3.41个百分点:A苗推荐剂量3倍虽组比A苗推荐剂量组高7.94个百分点,A苗推荐剂量3倍量组比B苗推荐剂量蛆高13.30个百分点,A苗推荐剂量组比B苗推荐剂量组高5.36个百分点

6、。2.1 口蹄疫免疫抗体均值结果与分析因本次试验免疫抗体分多批检测，每批检测临界值不同，对照组与各试验组间免疫抗体均值的差异不能直接用0D值进行比较。考虑到检测试剂的临界值=0.23x阳性对照孔平均0D值，对各试验样本的0D值按“标准化0。值=原始检测0D值/相应检测批次的临界值”的公式进行标准化，再对各组标准化（）D值均值进行统计分析,对于比较各组间免疫抗体均值差异仍有一定参考意义。据此公式整理的各参试样本标准化（）1）值见表2。应用独立二样本均值差异t检验对各试验组与对照组间标准化0D终值均值进行对比：对照组为0.55210.6863,A苗推荐剂量组为0.80730.7862,比对照组高0

7、.2552,差异不显著;A苗推荐剂量3倍量组为0.85990.8148,比对照组高0.3078,差异显著（P0.05）;B苗推荐剂量组为0.74670.3417,比对照组高0.1946,差异不显著。各试验组间标准化0D终值均值对比:A苗推荐剂量3倍量组比A苗推荐剂量组略高0.0526,差异不显著;A苗推荐剂量3倍量组比B苗推荐剂量组高0.1132,差异不显著:A苗推荐剂量组比B苗推荐剂量组略高0.0606,差异不显著。表1口蹄疫免疫抗体检测结果（01）值）注：l.a表示0D值NO.35为阳性，否则为阴性;b表示0D值N0.3581为阳性，否则为阴性;c表示0D值N0.2454为阳性，否则为阴性

8、。2.A苗推荐刑量组终值OD值数字下标横线者0D值N0.2454为阳柱.其他0D值0.3581为阳性。序导对照组A苗推荐剂量组A苗推荐剂量3倍量组B苗推荐剂最组耳号始值，终值卜耳号始值终值-耳号始值终值卜耳号始值终值。1600.277(-)0.090(-)170.266(-)0.112(-)630.292(-)910.312(-)0.102(-)2960.319(-)0.086(-)310.338(-)270.320(-)0.126(-)760.326(-)0.099(-)3690.381(+)0.098(-)480.369(+)0.178Q)560.361(+)0.104(-)1310.36

9、6(+)0.488(+)4150.410(+)0.081(-)610.399(+)0.115(-)750.432(+)0.147(-)90.388(+)0.133(-)51020.442(+)0.082(-)1200.433(+)660.447(+)0.139(-)830.448(+)0.169(-)6120.464(+)0.103(-)860.458(+)790.466(+)0.153(-)1320.469(+)0.191(-)7800.473(+)0.122(-)940.482(+)0J71(-)300.481(+)0.091(-)380.481(+)0.184(-)8620.523(+)

10、0.112(-)280.523(十)0.171(-)650.491(+)0.506(+)550.514(+)0.173(-)9100.547(+)0.103(-)1400.526(+)0.319(+)10.548(+)0.102(-)950.525(+)0.171(-)10430.549(+)0.113(-)340.549(+)0.219(-)900.549(+)0.390(+)840.556(+)0.110(-)11540.583(+)0.311(-)400.577(+)0.220(-)930.592(+)0.146(-)1220.596(+)0.130(-)12490.597(+)0.17

11、9(-)190.618(+)0.142(-)850.605(+)0.108(-)180.616(+)0.220(-)13870.637(+)0.108(-)770.634(+)1.005(+)820.624(+)0.112(-)1370.624(+)0.127(-)】4420.650(+)0.531(+)980.645(+)1000.657(+)0.159(-)710.642(+)0.147(-)15670.671(+)0.179(-)640.662(+)0.164(-)470.674(+)440.676(+)0.135(-)16360.696(+)0.136(-)580.687(+)0.21

12、6(-)290.699(+)0.465(+)80.702(+)0.125(-)17680.704(+)0.104(-)1160.722(+)0.125(-)1100.713(+)0.146(-)390.722(+)0.287(+)18590.753(+)1.452(+)740.748(+)1170.723(+)0.146(-)30.724(+)0.121(-)191190.780(+)0.193(-)200.774(十)0.150(-)720.786(+)0.218(-)40.757(+)0.278(+)201290.789(+)520.787(+)0.284(-)160.796(+)1.05

13、4(+)510.800(+)0.159(-)21110.829(+)0.104(-)1040.809(+)0.245(-)350.835(+)0.181(-)700.835(+)0.226(-)22140.857(+)0.232(-)60.864(+)0.228(-)1300.862(+)0.717(+)730.863(+)0.392(+)231050.920(+)0.104(-)410.893(+)0.139(-)890.868(+)0.128(-)880.869(+)0.215(-)2420.956(+)0.406(+)260.968(+)0.144(-)1260.963(+)0.955+

14、)1030.941(+)0.124(-)25920.969(+)0.138(-)220.999(+)0.319(-)330.977(+)0.882(+)130.984(+)0.155(-)2651.047(+)0.116(-)1071.259(+)321.117(+)0.165(-)1271.151(+)0.151(-)27781.166(+)0.093(-)531.379(+)0.467(+)1251.237(+)0.102(-)1081.244(+)0.175(-)28241.391(+)0.088(-)570.947(+)0.137(-)971.274(+)0.276(-)991.353

15、(+)0.202(-)291241.502(+)0.237(-)1061.439(+)0.603(+)1351.640(+)0.310(-)1091.424(+)0.122(-)30811.693(+)0.117(-)501.661(+)0.265(-)1331.821(+)0.954(+)1281.842(+)0.234(-)311211.908(+)0.165(-)1011.869(+)0.137(-)461.931(+)0.194(-)1122.013(+)0.111(-)32452.046(+)0.141(-)1232.127(+)0.479(+)1152.046(+)0.250(-)

16、1142.096(+)0.208(-)331342.253(+)0.261(-)212.226(+)0.179(-)1382.189(+)0.120(-)1392.191(+)34252.367(+)0.139(-)72.322(+)0.135(-)232.417(+)1182.298(+)均值0.9160.1980.9110.2520.9250.3080.9220.183合格率/%94.129.0994.1217.8694.1225.8094.1212.50衰2口蹄疫免疫抗体OD值标准化结果B苗推荐剂量组耳号始值终值对照组0.89140.41560.93140.40341.04571.988

17、61.10860.54201.28000.68871.34000.77831.37430.74981.46860.70501.50000.69681.58860.44821.70290.52971.76000.89651.78290.51751.83430.59901.93140.55012.00570.50942.06291.16952.06860.49312.16291.13282.28570.64792.38570.92092.46571.59742.48290.87612.68860.50532.81140.63163.28860.61533.55430.71313.86570.823

18、14.06860.49715.26290.95355.75140.45235.98860.84766.26006.56572.63430.74677619328383311n559584221837111114893410383378998274357780120902114n1*1n始值终值耳号始值终值0.76000.3128630.83430.9657270.91430.35191.05430.4971561.03140.29041.14000.3211751.23430.41051.2371661.27710.38821.3086791.33140.42731.37710.6968301

19、.37430.25411.49430.4775651.40291.41301.50291.299911.56570.28481.56860.6116901.56861.08911.64860.6144931.69140.40771.76570.3965851.72860.30161.81144.0954821.78290.31281.84291001.87710.44401.89140.4580471.92571.96290.6032291.99711.29852.0629034911102.03710.40772.13711172.06570.40772.21140.4189722.2457

20、0.60882.24860.7931162.27432.94332.31140.6842352.38570.50542.46860.63671302.46292.00222.55140.3882892.48000.35742.76570.40211262.75142.66692.85430.8908332.79142.46303.5971323.19140.46083.94001.30411253.53430.28482.70570.3826973.64000.77074.11142.45721354.68570.86574.74570.74001335.20292.66415.34000.5

21、583465.51710.54176.07711.33761155.84570.69816.36000.49991386.25430.33516.634303770236.90572.60160.80732.64140.8599A苗推荐剂量组A苗推荐剂量3倍量组1810648040978486346289243417965111174205204412622075357065001232171Atl111始值终值0.79140.25130.91140.24021.08860.27371.17140.22621.26290.22901.32570.28761.35140.34071.49430.

22、31281.56290.28761.56860.31561.66570.86851.70570.49991.82000.30161.85711.48281.91710.49991.98860.37982.01140.29042.15144.05472.22860.53902.25432.36860.29042.44860.64792.62860.29042.73141.13382.76860.38542.99140.32393.33140.25973.97430.24574.29140.66184.83710.32675.45140.46085.84570.39376.43710.72886.

23、76290.38822.61760.5521609669150212806210435449874267366859192911123456789101112131415161718192021S225844115459722824321111111*2345678901234他2222222233333均3讨论和结论3.1口蹄疫免疫抗体检测试剂的选用问题口蹄疫免疫抗体的检测试剂目前有多种，珠海市安富来生物科技有限公司猪病诊断实验室经多次对不同检测试剂进行对比检测发现，相同样本应用不同检测试剂进行检测，检测结果存在很大出入。本次试验口蹄疫免疫抗体检测试剂，在咨询珠海市出入境检验检疫局薄清如博士

24、后，决定选用优耐特VP1试剂。据薄清如博士介绍，珠海市出入境检验检疫局近几年一直使用该检测试剂检测口蹄疫免疫抗体，经多次检测对比发现，该检测试剂结果稳定、重复性好。本次免疫对比试验的检测结果亦显示,应用该检测试剂检出的抗体合格率和抗体均值与疫苗免疫剂量具有很好的相关性:A苗推荐剂量组和A苗推荐剂量3倍量组采用同种疫苗,A苗推荐剂量组按说明书推荐剂量进行免疫，免疫抗体合格率仅比对照组高8.77个百分点,标准化OD终值均值仅比对照组高0.2552；A苗推荐剂量3倍量组加大免疫剂量:,按说明书推荐剂量的3倍量进行免疫，免疫抗体合格率比对照组高16.71个百分点,标准化OD终值均值比对照组高0.307

25、8,且标准化OD终值均值与对照组对比差异显著。3.2两种口蹄疫疫苗的免疫效果本次试验选用的两种0型口蹄疫疫苗，免疫效果均不理想。按说明书推荐的免疫剂量进行免疫,均无法达到有效预防口蹄疫的要求。A苗的免疫抗体合格率仅有17.86%,B苗的免疫抗体合格率亦仅有12.50%。这一结果,与部分猪场的生产实际基本相符。珠海地区A猪场（800头基础母猪规模）和B猪场（400头基础母猪规模）均选用A苗免疫,70日龄免疫1m!7头、98口龄免疫2mL/头。对出栏前（约168日龄）活大猪口蹄疫免疫抗体抽样监测（检测试剂亦选用优耐特VP1试剂）结果显示：前者合格率为0（0/20）,后者相应亦仅有15%（3/20）

26、。对比口蹄疫疫苗的免疫效果，不同来源的口蹄疫疫苗差异非常明显。恩平市金津猪场选用某品质优秀的曰蹄疫疫苗进行免疫,70日龄和98日龄相继每头免疫1头份（1mD98日龄对仅经过一次免疫的猪群抽样检测（检测试剂用优耐特VP1试剂，下同）,口蹄疫免疫抗体合格率即达30%（6/20）；126日龄对经过两次免疫的猪群进行抽样检测，口蹄疫免疫抗体合格率高达97.22%（35/36）。不但免疫抗体合格率高，而且免疫过程中未观察到一例免疫应激现象。本次试验结果显示:国产的某些口蹄疫疫苗免疫效果不理想，原因仍在于疫苗中抗原含量不足，与疫苗毒株并无必然因果关系。本次免疫对比试装中,A苗推荐剂玷组和B苗推荐剂量组均按

27、说明书推荐剂量免疫，两者选用的疫苗源自不同毒株，但两者免疫抗体合格率和均值都非常接近,且免疫抗体均值与对照组无显著差异。A苗推荐剂量3倍量组选用与A苗推荐剂房组相同的疫苗，按说明书推荐剂量3倍最免疫,免疫抗体合格率则比A苗推荐剂量组提高7.94个百分点，旦免疫抗体均值比对照组显著上升。据此试验结果，提高免疫剂量在生产上可以有效提高曰蹄疫疫苗的免疫效果。但由于当前大部分国产口蹄疫疫苗的免疫应激都比较大，提高免疫剂量意味着免疫应激更严重。而目.根据此次试验结果推断，要使免疫抗体合格率达标，免疫剂量:可能要求非常大。如果要求的免疫剂最达到说明书推荐剂量的10倍，每头猪免疫剂量将达到20mL（如A苗的

28、二次免疫），这在生产上绝对是无法做到的。因此，口蹄疫疫苗免疫效果的改善仍寄希望于疫苗生产厂家提高疫苗生产技术,对疫苗中的抗原进行进一步浓缩。关于母源抗体对免疫效果的干扰问题本次试验对照组与各试验组在免疫前，母源抗体01）值和合格率都较高，这种情况与生产的要求基木相符。口蹄疫在我国为一类传染病，如果小猪等到母源抗体消退后才免疫，在开始进行免疫到主动免疫抗体逐渐上升至达到有效预防口蹄疫的要求这段时间，猪群存在感染口蹄疫野毒而暴发口蹄疫的巨大风险。从珠海市动植物防疫监督检验中心后续进行的一次口蹄疫合成肽疫苗免疫对比试验结果看，只要疫苗中抗原含量足够，母源抗体对疫苗免疫效果的干扰问题是完全可以克服的。

29、在该次合成肽疫苗免疫对比试验中，对照组和各试验组小猪在免疫前，付源抗体0D值和合格率均与本次免疫对比试验相当。试验1组和试验11组经不同剂量的合成肽疫苗免疫后，抗体均值和合格率均有效上升，且与对照组均差异极显著。试验I组按说明书推荐剂量免疫,免疫抗体合格率为78.13%;试凝II组按说明书推荐剂量3倍量免疫,免疫抗体合格率达到100%。当然，由于口蹄疫病毒结构蛋白和分泌蛋白多样,仅其完整粒子（146S）的衣壳就由4种结构蛋白一1A（VP4）、1B（VP2）、1C（VP3）和ID（VPl）组成，而口蹄疫合成肽疫苗的抗原成分仅是其中的1种结构蛋白（VP1）,其免疫抗体01）值能否作为衡量该疫苗是否能使猪对口蹄疫具有免疫力的标志，仍有待研究和生产实践证实。（编辑:姜雪）U!联疗法治疗仔猪水肿病中图分类号:S858.285.I文献标志码：B仔猪水肿病是由致病性大肠杆的产生的毒素引起的断奶仔猪的一种肠毒血症，主要发生在补料和断奶前后营养状况良好、生长快的仔猪，以突然发病，头部、皮下和浆膜下水肿，