基因工程植物疫苗的研究进展及应用.docx

1、基因工程植物疫苗的研究进展及应用张军梅（榆林市农业干部学校，陕西榆林719000）插要：也因桢物疫苗巳成为疫苗研究领域的一个新热点,本文简单介约了植物疫苗的免疫原理、枝物疫苗的特点、植物疫黄生产的表达系统、以枝粉为我休的免疫技术、植物疫苗的安会柱、植物廉因工程疫苗研霓进展、基因工球独物疫苗中的应用以及展燮等关键词：枝物疫苗；基因工程;表达系统；安会性1 植物疫苗的免疫原理植物疫苗可诱导粘膜免疫反应，小肠淋巴组织的粘膜上有一种特殊的细胞叫做膜细胞（M细胞）'粘膜免疫应答就是由M细胞识别抗原开始的。M细胞识别抗原并将其传递给巨噬细胞，巨噬细胞和其它抗原呈递细胞,再将抗原展示给辅助性T细胞，

2、辅助性T细胞识别外源蛋白质片段后就会刺激B细胞制造和释放能中和抗原的抗体，当疾病因子出现时，记忆辅助性T细胞剌激胞毒T细胞攻击受感染的细胞，同时它迅速刺激记忆B细胞分泌中和抗体消灭入侵的病原体。总的来说，转基因植物疫苗可以诱导相应的血清型的IgA和IgG反应。2 植物疫苗的特点2.1安全性高植物是人类食物来源之一,除个别人群对某些特定的植物过敏外，其安全性高。用动物细胞生产疫苗，可能有动物病毒的污染，对人类存在潜在危害。而植物病毒不会感染人类，比较安全,同时也可避免微生物生产疫苗带来的有害产物。2.2成本低植物种植系统简单易行，植物细胞培养条件简单，便于进行遗传操作，诃通过大面积栽培获得廉价的

3、疫苗,且不需妾技术、设备和种植条件等巨大投资。农作物可以当地生产，还易于储藏和运输，而且经过长期种植,植物栽培、收获、贮藏、加工程序已经形成工业化。与植物生物反应器相比,原核生物反应器与动物生物反应器生产时需要昂贵的技术设备、大址的人力物力。2.3楂物具有完整的真核表达系统具有与动物相同的直核加工修饰系统。可以对重组蛋白进行糖基化、磷酸化、酰胺化、亚基正确装配等。微生物系统不能对真核生物蛋白进行正确的翻译后加工。2.4转基因植物中的外源基因可重组通过植物杂交的方法进行基因重组，进而在植物体内积累多种病原体的抗原基因，生产出方便高效的多联疫苗。3 植物基因工程疫苗外源基因的表达系统3.1睨时表达

4、系统主要采用植物病毒作为载体.而外源基因插入到病毒基因组中，通过病毒感染植株，从而将外源基因导入植物细胞内，采用这种转化方式，外源基因并不整合至植物基因组中，只是利用寄主细胞在细胞质中进行复制，以高拷贝的形式游离于植物中，并进行高效的表达，因此可在短时间内在植物细胞内积累大量的外源蛋向。采用农杆圜介导的转化，外源基因蛋白的产域一般要低于细胞内可溶性蛋白总量的1%；而采用这种瞬时表达系统,外源基因蛋白总址会远大于1%03.2稳定整合系统3.2.1土壤农杆菌介导的遗传转化。目前根癌农杆菌主要用于双子叶植物的遗传转化，其转化植物的机制已从分子水平上基本得到解释。而发根农杆菌，由于对Ri质粒亍解得还不

5、充分，所以对这种转化系统的研究主要集中在以生产次生代谢产物为目的的根组织培养和根的发育。采用农杆菌介导的植物转化最常采用共培养法，即使用农杆菌菌液与叶盘、愈伤组织、悬浮培养细胞、茎段、下胚轴段、子叶切片等部分进行共培养，从而达到转化的目的。3.2.2外源DNA直接导入法。主要包括基因枪法、电激发、PEG诱导法、激光穿孔法、脂质体法、超声波法，其中最常用的是基因枪法。它是将带有外源基因的质粒用亚精胺包裹为直径iFim左右的金弹或鸨弹,再用高压藏气、火药爆炸力、高庆放电气体作为动力加速子弹，使它们穿过植物细胞壁和细胞膜.将外源基因带入具有再生能力的植物组织,这样可以在很大程度上缩短再生的时间，从而

6、避免体细胞变异的发生。4 以植物为载体的免疫技术4.1枝物疫苗免疫原性和免疫保护作用由于植物疫苗一般是通过食用来被人体利用。所以如何避免消化酶的影响来保护抗原就是-个重要的研究课题。目前，避免消化酶的影响来保护抗原可分为2类方法：用沙门氏菌和弧状霍乱杆菌作为载体;用保护性的包被对抗原进行包装。用减毒的菌株可以把抗原引向粘膜的表面.有利于粘膜免疫系统摄取所表达的抗原。但是基于减毒菌株的方法具有潜在安全缺陷.而后者可通过生物降解的多聚物、脂质体、钱白质体或者表达抗原的转基因植物来实现。许多研究表明，植物材料可潜在地保护所选定的抗原。特别在种子中，植物可为亚单位疫苗提供一个富含蛋白酶抑制物的糖类聚合

7、物基质环境。其它的抗原包装方法需要烦琐的处理步骤；而通过植物种子来进行生物包装不需要任何额外的代价,就可以为这些抗原提供保护。在有关转基因马铃薯的研究中，从轮状病毒和产肠毒素大肠杆菌中所选的抗原分别与霍乱毒素的B和A：亚单位融合，抗原的免疫反应显示出对TM的偏爱性，并可诱导白细胞介索2和干扰素,CD4+水平也相应增加。Thl的偏爱性很可能是抗原或者载体的选择结果。在佐剂的帮助下，亚单位疫苗的释放能增加免疫反应量。霍乱毒素和大肠杆菌的热不稳定毒索，它们与抗原共表达，有利于诱导保护性的免疫产生,改变口服免疫低效率递呈。另外,有人证实了转基因植物疫苗的粘膜传输中所诱发的免疫应答所具有的黏膜佐剂的特征

8、，这给【I服免疫可不需佐剂提供了依据，同时也提高了其安全性。在以植物疫苗的口服免疫研究中，所候选的亚单位疫苗也具有较好的保护作用。马铃薯块茎或谷物种子中表达的热不稳定毒素的B亚基和马铃磐中表达的霍乱毒素B亚基用于小鼠口服免疫.可以保护老鼠免受痢疾的感染。另外，口服免疫由谷物种子表达的传播性肠炎病毒的岛糖蛋白，对乳猪能够起到很好的保护作用。目前，通过植物递送系统来生产B型肝炎的疫苗也逐渐成熟。4.2提高抗原在植物中的表达水平利用植物进行疫苗开发，首要的问题是.植物能否表达相关的蛋白？目前为止,许多亚单位候选抗原在转基因植物中成功表达,这些抗原主要包括感染人类、家畜、野生动物的细菌和病毒抗原。表达

9、水平很大程度上取决于表达的蛋白和用于表达的植物种类.同时.构建的表达系统也影响抗原的表达水平，比如用于表达的细胞器基因组(核和质粒)、启动子的强度和组织专一性、非翻译前导序列和信号序列的选择和表达蛋白的靶细胞器的定位等均对表达产生影响。一般而言.利用上述策略可以实现抗原高水平表达c然而，很难对表达系统进行比较,因为特定抗原对植物表达系统的选择很重要.在不同的系统中其表达效果是不-样的。近来.研究人员利用内质网滞留信号可提高外源基因的表达量.Mason等利用一个核表达系统，把蛋白定位于内质网滞留信号之后，热不稳定毒素B亚单位在马玲誓块茎中表达址可达总可溶性蛋白质的0.2%;在谷物种子中的表达量约

10、占总可溶蛋白的4%或12%,这些都依赖于所用的调节序列。另外.霍乱毒素(B)亚单位在利用内质网滞留信号时在烟草叶片中的表达甘约占总可溶蛋白的4%。膜蚩白比可溶性蛋白更难于在转基因植物中表达.大量研究表明.膜饭白在植物中的表达量远不及可溶性蛋白.这就需要优化表达系统以提高表达水平。目前，转基因马玲磐表达B型肝炎的表面抗原水平已由马玲磐大约lmg/g增加到马玲馨大约16mg/g抗原.这样可以大大减少口服剂量。目前许多研究表明，所欲表达的抗原在植物中能够表达并装配成四级结构。糖基化修饰的蛋白也可在植物中进行精基化，尽管糖基化模式很可能存在着差别。在植物系统中表达的热不稳定蛋白毒素的B亚单位和雷乱毒素

11、的B亚单位，均有GM1受体结合活性B型肝炎表面抗原和诺沃克病毒衣壳蛋白可形成类病毒颗粒类病毒颗粒的形成，可认为有利于诱导免疫反应。5 植物基因工程疫苗研究进展5.1反转录病毒栽体反转录病毒作为载体是在进行动物基因工程中发现的，许多研究人员认为它同样适于植物基因工程，但目前研究的不多。5.2单链RNA植物病毒单链RNA植物病毒,即病盘RNA可直接作为mRNA的植物病毒，主要包括苜蓿花叶病毒(ALMV)、就豆花叶病毒(CPMV)、雀麦花叶病毒(BMV)、烟草花叶病毒(TMV)等。它们作为外源基因载体主要通过以下步骤感染植物：病毒RNA首先反转录为一条单链cDNA,在DNA聚合酶作用下形成双链DNA

12、,将其克隆入细菌质粒中，将外源基因插入质粒的cDNA中，最后通过体外转录，用带有外源基因的RNA病毒感染植物,将其转入植物细胞。5.3单MDNA病毒裁体在单链DNA植物病毒载体中，研究最多的是Gemi-nivimses(简称GeNV)，又叫做双粒病毒或双联体病毒。它般含有2个成对并存的病毒颗粒，大小约为1820nm,遗传物质是单链DNA,每2个颗粒中包含】2个、2.53.0kb的环状DNA分子。该病毒寄主广泛.单子叶植物和双子叶植物均可被感染，但感染部位仅限于植物的维管组织.且其传播媒介主要是昆虫,不能通过机械接种。5.4双链DNA植物病毒载体双链DNA植物病毒载体中最典型的是花榔菜花叶病毒，

13、它的基因组长约8kb,主要感染花挪菜、油菜、拟南芥等，主要寄主是芸苔属植物，目前尚未发现可感染豆科和单子叶植物。6 植物疫苗的安全性6.1对环境的影响由于在植物疫苗中包含了病原体的DNA片段，因而花粉和种子的散播造成的基因逃逸可能给人类带来新的病原、毒素、过敏原等，因此对可能引起的基因渐渗现象必须做出充分的安全性评价，并规范植物疫苗的利用和管理，同时寻求技术方法。如可恢复性功能阻塞(RBF)技术，它能使自然界中因渐渗而携带RBF的杂种或近缘系植物死亡或不育或利用叶绿体转化植物疫苗或培育植物疫苗的雄性不育系,这样就可避免花粉传播而带来的潜在威胁，转基因植物疫苗有着传统疫苗无法比拟的优越性.已经成

14、为一个研究热点了。未来的研究应着眼于生产出作为医药商品的安全、可靠、有效的植物疫苗。转基因植物疫苗应用最大的限制就是表达量低。现在的研究表明：可以通过叶绿体转化、植物育种和利用食品加工技术来提高表达水平,而旦研究还指出，运用携带蛋白和辅助蛋白可以增加抗原被免疫系统识别的能力。这些研究都使我们越来越接近生产出廉价“安全口服的商品植物疫苗”，这样的疫苗将可以帮助人们预防疾病的传播。6.2对人类和动物的影响抗生素抗性基因是筛选转基因植物常用的标记基因。长期食用这类转基因疫苗是否会对人体或动物造成抗生素医疗无效。转基因植物中的新基因会不会传递给人畜肠道的正常微生物,引起菌群和数量的变化或插入并表达，从

15、而危害人畜健康？这些问题目前都无法解答.仍需大景学者继续研究t仑证。7 展望利用植物来表达和递送疫苗技术的发展给免疫研究注入了新的内容。以往的研究中，在植物中表达了包括过滤性病毒、细菌、肠道和非肠道的病原体等各种不同的抗原,并做了相应免疫学研究。但植物疫苗面临的最大问题是抗原蛋白在植物细胞表达量不高，低剂量抗原蛋白往往不能激发足够的免疫反应,这不能仅靠增加植物组织摄取量得以解决，因为低剂量的重复免疫可能会导致机体的免疫耐受，导致机体对此抗原免疫反应保持“低调”，即使以后增加抗原蛋白的剂量也不能改变。另外，机体每天对植物组织的摄取虽:是一定的,浅谈宜君县林业产业建设张娟（宜君县国有哭泉林场.陕西

16、宜君727202）摘要:文章阐述了宜君县林业产业建设现状、存在的问题，提出了产业建设的发展思路。关键词：林业产业；建设林业产业是林业I：作的一个重要组成部分，是林业经济可持续发展的耄要动力。加快林业发展，既是林业建设的客观内在要求，也是促进经济社会发展的必然需要。近年，宜君县在抓好生态建设的同时,把林业建设作为促进自身发展和保证自身稳定的一项重要工作，切实抓紧抓好，抓出成效,坚持“两手抓”的方针，立足当前，着眼长远.整体规划，分步实施，重点发展,真正实现林业3大效益同步提高。1 宜君县林业产业建设的现状近年来，宜君县在“十七大”及“三个代表”重要思想引导下.适应生态建设和市场需求的变化，充分发

17、挥当地资源优势，巩固提高第一产业调整优化第二产业，积极引导发展第三产业建设，力争多种渠道实现全县林业经济可持续发展战略C1.1林业产业发展速度加快，经济效益显著增加近年来，宜君埃以经济林、苗木花卉、林区资源开发为重点的林业产业得到全面发展c1.2苗木花卉产业异军突起，发展规模逐步壮大全县发展国有和个体苗圃.以县中心苗圃为龙头,4个国有林场及各类小型苗圃为辅助，积极发展（五林区）苗木花卉产业。多种经营呈现良好发展态势，特色产业逐步兴起。2 产业建设中存在的问题宜君县生态建设良好。相对而言,林业产业建设发展滞后，总的来看其在整个林业工作中仍是一个薄弱环节仍存在-定的问题。2.1产业建设规模小，项目

18、少，产品结构品种单一2.1.1科技含量低，效益低,后劲不足c虽然产业建设取得一定成绩,但由于技术力量薄弱，缺乏一定的专业技术人才,使产业管理脱节严重，经济效益甚微。2.1.2市场信息闭塞。产品品种与市场需求不接轨，不能生产出适销对路的新品种，缺乏市场导向,产品销售不畅，没有真正达到产、供、销一条龙服务C2.1.3缺乏龙头企业和精深加工业。3 产业建设的发展思路为了促进宜君县产业建设的发展，我们应做好以下几方面的工作：3.1加快林业产业结构升级要加快建立以森林资源培育为基础，以基地建设为突破口，以龙头企业和精深加工为带动，以科技进步为支撑的林业产业的发展新格局，适应生态建设和市场需求的变化，加大林业产业的重组力度,进一步优化资源配置.加快林业产业结构升级步伐。特别是国家天然林保护工程实施后，由于全面禁止采伐天然林，这就为发展林业产业提供了必要条件。因此，为r满足社会对木材等林业产品多样化的需求，提高林业职工和林区群众收入，推动地方财政增收，促进区域经济发展，加强国有林业企业特别是国有林场经营机构调整，不断优化林业产业化程度势在必行。3.2加快商品用材林基地建设要大力营造以商品型为主的材林,特别是要加快以速生丰产林用材林为主的林业产业基础工程建设,在条件具