幽门螺杆菌外膜蛋白基因omp22克隆、表达和鉴定.docx

1、678X2010Oct；27(5)广西医科大学学报JOURNALOFGUANGXIMEDICALUNIVERSITY幽门螺杆菌外膜蛋白基因omp22克隆、表达和鉴定基金项目：河南省殴学创新人才基金资助项B(No.2000-84):河南省科技厅科技攻关项目基金资助课题(No.0424410035)通信作者:E-mail:gcduan©public,zz.ha.cm电话：0371-669128691广西壮族自治区疾病镇防控制中心南宁5300282郑州大学公共卫生学院流行病学教研室郑州450001收稿日期,2009-05-10黄学勇李永红I段广才范清堂2都园林2(河南省疾病预防控制中心郑州

2、450016)摘要目的：克隆幽门螺杆菌外膜蛋白基因。mp22构建幽门螺仟菌。mp22基因与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体.并进行诱导表达，鉴定融合蛋白免疫原性，为幽门螺杆菌疫苗研究提供依据。方法：利用PCR技术从Helicobacterpylori郑州分离株MEL-Hp27染色体DNA上扩增omp22基因.并将其克隆到表达载体pMAL-c2X中.转化大肠杆菌(E.coliTB1),用IPTG诱导目的基因表达，SDSPAGE方法对表达产物进行分析，Westernblot鉴定其免疫原性。结果:PCR方法扩增的omP22基因长度约为540bp°经酶切鉴定，插入到表达载体的基因片段与预期目的

3、DNA片段相一致；SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为22ku.融介蛋白的表达最约占全菌总蛋白的26%。结论：成功克隆并构建了omp22基因高效原核表达系统.为幽门螺杆菌基因JL程组分疫苗的研究奠定基础。关键词幽门螺杆菌;omP22基因克隆基因表达中图分类号:R378.2文献标志码：A文章编号：1005-930X(2010)05-0678-03CLONING,EXPRESSIONANDIDENTIFICATIONOFOUTMEMBRANEPROTEINomp22GENEOFHELICOBACTERPYLORIHuangXueyong,LiYonghong,DuanGuangcai,eta

4、l.(HenanProvincialCenterforDiseasePreventionandControl»Zhengzhou450016China)AbstractObjective：Tocloneandexpresstheomp22geneofHelicobacterpyloriandtoidentifytheimmunogenicityofexpressedproteininordertobuildabasisfortheinvestigationworkofvaccineanddiagnosticantigen.Methods：omp22geneoftheHelicobac

5、terpyloriMEL-Hp27wasamplifiedbyPCR.andinsertedintoexpressionvectorpMALc2X.ThepositiverecombinantsweretransferredintoE.coliTB1,thegeneticallyengineeredbacteriaincludingpMAL-c2X-omp22plasmidswereinducedbyIPTG,andtheexpressionproductswereanalyzedbySDS-PAGEandWesternblot.Results：omp22geneof540bpwasobtai

6、nedfromtheHelicobacterpyloristrainsMEL-HP27genomeDNAThegenesegmentinsertedintotherecombinantvectorwasidentifiedbyusingrestrictionenzymedigestion.PlasmidpMAL-c2X-omp22couldexpressaspecificapproximative65kufusionprotein(omp2222kuandMBP42.5ku)inE.coliTB1andthefusionproteinaccountedfor26%ofthetotalprote

7、inofrecombinantbacterial.Conclusion：omp22genehasbeenclonedandaprokaryotichighexpressionsystemforomp22genesuccessfullyconstructed,whichwillhelptodevelopgenerecombinantvaccineagainstHelicobacterpyloriinfection.KeywordsHelicobacterpylori；omp22gene；cloning；expression幽门螺肝菌(HelicobacterpyloriHp)是一种能长期定植于人

8、体胃黏膜的致病菌.流行病学调查显示,全世界感染率之高是前所未有的，而我国普通人群的感染率为50%80%.每年仍有递增趋势。自然感染Hp后机体的免疫反应不但不能清除细菌反而会导致胃黏膜的慢性免疫病理损害.因此要消除该致病菌的危害仅仅被动治疗是难以实现的目前大房实验研究表明.免疫接神蛋白质亚单位疫苗能够诱导机体产生保护性细胞和体液免疫反应.可以预防甚至治疗Hp感染其中Hp的外膜蛋白(Outermembraneprotein.OMP)可作为潜在的靶标.能够在人体保护性免疫反应中起到重要的作用.并为该菌的共有抗原成分.以其制备的抗原可使实验动物获得保护5。本研究采用郑州Hp临床分离株MEL-HP27,

9、对外膜蛋白OMP22编码基因(omp22)进行克隆和表达,为进一步纯化及大重制备重组OMP22蛋白，并进行OMP22免疫原性和相关功能的研究奠定基础.1材料与方法L1材料:HpMEL-HP27株由本研究室从郑州市慢性萎缩性胃炎患者体内分离并保种。表达质粒PMAL-c2X和E.coliTB1购自NewEnglandBiolabs公司iPyrobestDNA聚合酶、限制性内切酶BamHI和PstI,T4DNA连接酶等购自宝生物公司IDNA纯化试剂盒为Vitagene公司产品。1.2方法2.1PCR扩增：参考GenBank收录的Helicobacterpylori国际标准株J99和26695的基因序

10、列，应用Primer5.0设计Hp外膜蛋白omp22基因的PCR引物：上游5x-cgggatccat-gaagagatcttc-3;下游5z-cgcctgcagttacttcactaattt-3,.分别在上、下游引物引入BamHl和Pst1酶切位点，该引物由赛百盛公司合成。PCR扩增体系:10XBuffer5、L,4XdNTP4 mL（各200pmol/L）,MEL-HP27DNA模板2.5pL,引物各2mL（0.25pmol/L）,PyrobestDNA聚合酶0.4/J.（l.25U）,最后加MilliQ4（）至50PCR扩增条件：95C预变性min,然后按以下参数进行30个循环，94C变性

11、50*45X?退火45s,72X：延伸50方最后一个循环72X?反应10min。PCR产物3/在1.0g/L琼脂糖凝胶（含EB）中电泳.凝胶图像分析仪照像。1.2.2omp22表达质粒的构建:PCR产物和表达质粒pMALc2X分别用BamHI和PstI双酶切,酶切产物分别用Vitagene掇胶问收试剂盒回收，凝胶图像分析仪定量。omp22与pMALc2X酶切产物以6:1的mol比例进行混合，T4DNA酶16C过夜连接。取连接产物10/1L.转化TB1感受态细胞将转化菌均匀涂布于含X-gal和IPTG的LB氨*青篝素固体培养基上.37K培养1216h。挑选白色菌落,接种于5mL含氨卡青霉素的LB

12、液体培养基中，371、220r/min培养过夜，碱裂解法提取质粒进行单、双酶切和PCR扩增鉴定。阳性重组质粒命名为pMAL-c2X-omp22质粒。1.2.3目的基因的诱导表达与SDSrPAGE分析：将已鉴定为阳性克隆菌落接种于含氛苯青霉素（100mg/L）的LB液体培养基中.37°C.200r/min摇菌过夜。取50L菌液加入到5mLLB液体培养基中，371,240r/min,摇菌1.5h,加入终浓度为0.4mmol/L的1PTG,诱导表达4h。取菌液样品1mL.4000g离心5min,弃上清.加入100ML2XSDS-PAGE上样缓冲液，于100水浴5min,10000离心10m

13、in.取10上清加样。采用0.5mg/L的浓缩胶和1.2mg/L的分离胶电泳约2.5h.凝胶用考马斯亮蓝R250染色。1.2.4表达产物的westernblot分析：SD&PAGE电泳后.凝胶和硝酸纤维素膜在转移缓冲液中浸泡15min.于半式电转印仪中20V转印30min。硝酸纤维素膜用蒸儒水洗3次.PBS洗1次，转入封闭液封闭3h.与Hp病人血清（1:50）反应2h.洗膜后.与弟抗人血清（1«2000）反应1h,DAB（二氨基联苯胺）显色。2.1 omp22基因克隆:PCR产物经琼脂糖凝胶电泳.结果显示扩增产物长度约540bp（见图1）,获得预期大小目的基因片段。该基因序列

14、已被GenBank收录（收录号：DQ499023）。12图1Hpomp22基因的PCR反应产物1：DNAmarker：2、3：omp22基因扩增产物2.2 omp22重组表达质粒构建及鉴定结果：重组表达质粒分别用BamHI和PstI单，双酶切以及PCR扩增均获得相应大小的DNA片段，表明重组表达质粒pMAL-c2Xomp22构建成功（图2）。15OCX)hp5000bp2S00bpI000hp15OCX)hp5000bp2S00bpI000hp250bp图2重组表达载体的酶切鉴定1：DNAmarker,2：pMAL-c2X双酶切13:pMAL-c2X-omp22单酶切b4：PMAL-c2X-o

15、mp22双酶切j5：以pMALc2Xomp22为模板扩增omp22诱导表达产物的SDS-PAGE结果：将重组菌TB1（PMALc2X-omp22）和对照菌TB1（PMAL-c2X）以及TB1诱导后的粗提蛋白进行SDSPAGE电泳.重组前体蛋白在约65ku处出现一条特异蛋白带（图3）.正好是标签蛋白MBP（分子最42.5ku）与OMP22的分子斌（22ku）的总和.经GeneGenius凝胶图像分析仪分析.融合蛋白的表达量约占全菌蛋白的26%,该蛋白分子量与预期融合表达蛋白分子景一致。初步证实本研究构建的重组表达质粒PMAL-c2X-omp22口J以高效表达融合蛋白MBP-CMP22。97400

16、6620043(XX)3100020100974006620043(XX)3100020100MRP-OMP22图3TBl(pMAL-c2X-omp22)诱导表达产物的SDSPAGE分析1:proteinmarker；2：E.coliTB1诱导；3：TB1(pMALc2X)诱知4,5,6：TB1(pMAL-c2X-omp22)诱导4表达产物的Westernblot分析：重组菌TB1(pMAL-c2X-omp22)表达产物与Hp阳性病人血清进行Westernblot分析.在约65ku处产生特异杂交带(图4),进一步证实获得了月的蛋白的表达。图4r()MP22免疫原性的Westernblot分析1

17、：健康人血清，2：Hp病人血清3讨论Hp是世界性分布的病原前.它的感染是目前人类发生率最高的慢性细菌感染之一,已被确认为消化性溃疡和慢性胃炎的重要病因，并与胃癌和胃淋巴瘤的发病密切相关兀。近年来的研究显示.应用Hp疫苗防治其感染已成为公认的最为经济有效的措施*。有研究表明.革兰阴性细筒外膜中的一些蛋白成分具有良好的抗原活性.可诱导出很强的菌株特异性免疫反应.这些外膜蛋白作为抗体和免疫细胞攻击的主要靶标,可以介导对细前最直接有效的杀灭作用.是决定免疫反应是否对人体具有保护性的关健因素。Hp基因组中含有34个功能有待进一步研究的外膜蛋A(outermembraneprotein,CMP)基因.一些

18、实验研究已证实部分外膜蛋白分子如Lpp20、OMP26、()MP27及OMP25等具有良好的免疫活性9.提示外膜蛋白分子可以成为Hp疫苗研究良好的候选抗原。本研究选择的OMP22也是Hp的一种外膜蛋白.这种蛋白在菌体内的生理功能尚不清楚，但已有研究表明其能够分泌表达于细萌表面，并能引起Thl细胞较高的免疫反应口。.对OMP22进行深入研究有希望发现更有效的Hp疫苗抗原和诊断抗原。通过PCR方法获得郑州分离Hp菌株MEL-HP27的omp22基因,进一步将克隆到的omp22基因酶切、纯化、连接入融合原核表达载体pMAL-c2X,成功构建了表达OMP22蛋白的重组表达质粒pMAL-c2X-omp2

19、2°通过IPTG诱导和SDS-PAGE蛋白电泳，发现重组细菌在分子量约65ku处出现一条特异蛋白带，正好是标签蛋白MBP(分子量42.5ku)与OMP22的分子最(22ku)的总和,与预期融合蛋白分子最相符。这就为进一步的OMP22重组蛋白的抗原性和免疫保护性研究以及Hp基因工程疫苗和临床诊断试剂研制奠定r重要基础。参考文献：1 DelchierJC,LamarqueD,LevyM,etal.Helicobacterpyloriandgastriclymphoma：highseroprevalenceofCagAindiffuselargeB-celllymphomabutnotin

20、low-gradelymphomaofmucosa-associatedlymphoidtissuetypeJ.AmJGastroenterol.2001,96(8)：2324-2328.2 FockKM,AngTL.EpidemiologyofHelicobacterpyloriinfectionandgastriccancerinAsiaJ.J(iastroen-terolHepatol,2010,25(3):479-486.3 SachsG,WenYScottDR.GastricinfectionbyHelicobacterpyloriCJJ.CurrGastroenterolRep,2

21、00911(6)：455-461.4 JiangZ,HuangAL.TaoXHetal.ConstructionandcharacterizationofbivalentvaccinecandidateexpressingHspAandMrl8000()MPfromHelicobacterpylcriJ.WorldJ(jastroenteroL2003,9(8)：1756-1762.5 姜政.余剑平Y新渝.等,人幽门螺杆菌外膜蛋白18000DNA疫苗的构建及表达J.中国免疫学杂志，2005.21(2):134-138.6 李良仁.王继德，白杨，等.幽门螺杆菌外膜蛋白25基因的克窿及序列分析口.中国微生态学杂志<2005,17(4)：763-765.7 LahnerE<Be