无菌检查方法的验证

1、无菌检查方法的验证无菌检查方法是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的试验方法， 是作为无菌产品批放行的重要依据及药监部门对无菌产品质量监管的一个重要工程。 因此如 何确保无菌检查方法的准确可靠至关重要， 而检查方法的验证是保证检查结果的公正、 科学 和准确的根底，因此各个主要国家的GMP或药典都对无菌检查方法的验证提出了严格的要求，2022版中国药典对分析方法验证和检查的要求也有大幅度的提高，同时也是GMP佥查中检查的重点和容易发现问题的区域。验证要求与方法无菌检查方法验证一般分为前验证和再验证两种。前验证，也称预验证，指在无菌分析方法正式使用前，按照预定验证方案进行的验证。

2、如果没有充分的理由，任何检查方法必须进行前验证。再验证， 指某一检查方法经过验证并在使用一段时间后进行的，旨在证实已验证状态没有发生飘移而进行的重新验证及对检查方法进行修订、改变时进行的验证。通常一个无菌产品的检查流程为： 首先基于产品的剂型、 溶解度等性质， 按照药典的要 求确定是否需要进行前处理 ; 然后根据产品的特性是否有抑菌性，确定是否需要增加去除产 品抑菌性的方法 ; 最后验证整个检查方法中用到的一切及试验过程中的每一个环节包括样品 的预处理方式、检查过程、培养条件等均不影响样品中微生物的生长。这里，验证的重点环节包括：前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应是验证的重点。供试品

3、中抑菌活性的去除是当前验证工作的重点， 尤其强调应充分验证供试品本身对微 生物生长的影响。具体的验证方法如下：菌种的选择无菌检查方法验证中通常选择以下 6 种试验中常用的控制菌的标准菌株， 它们分别代表 不同类型的菌种：枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63 501 代表药品中常见的污染菌芽孢杆菌、 金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26 003 代表革兰阳性菌、 生孢梭菌 CMCC(B)64 941代表厌氧菌、 大肠埃希菌 CMCC(B)44 102 代表革兰阴性菌、白色念珠菌 CMCC(F)98 001 代表酵母菌、 黑曲霉菌 CMCC(F)98 003 代表霉菌。菌液的制备接种金黄色葡萄球菌、 大

4、肠埃希菌、 枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，3035 C培养1824h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，2328C培养2448h,上述培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml含菌数小于100cfu的 菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，2328 C培养57天，加入 35ml 含 0.05%ml/ml 聚山梨酯 80的 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适 宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内， 用含 0.05%ml/ml 聚山梨酯 80的 0.

5、9%无菌氯化钠溶 液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。样品的前处理无菌产品中每个成分应该是均匀的， 因此只要确定在验证的方法中， 按所需的总接种量 即可，而不必像样品日常检测中按规定的容器数取样。如果制备样品时需要使用溶解剂、稀释剂、助溶剂、 破乳剂等溶剂，需要确保这些溶剂 是有效的，并且其使用对微生物生长无影响 ; 或者制备过程中需要对样品进行加热助溶、离 心等操作时，需要确保加热的温度、离心速度和离心时间等对微生物生长或分布无影响。不需前处理的样品免做。消除样品抑菌性的方法无抑菌性样品的验证方法： 依据产品溶解性和微生物限度选择适宜的中性稀释剂溶解和 稀释，用直接接种法验证，

6、常用中性稀释液或淋洗液。对于具有抑菌性样品的验证方法，首先确定样品的抑菌作用 抑细菌、真菌试验验证 ， 选择敏感标准菌株对供试品抑菌活性去除效果检查 阳性菌回收试验 。常用的消除样品抑 菌活性的方法如下：稀释法：利用降低供试品的相对浓度，将样品稀释至最低抑菌浓度下进行。如：取规定 量的样品溶液至较大量的培养基中，使单位体积内的样品含量减少，至不含抑菌作用。薄膜过滤法：利用体积差异别离，通过薄膜过滤，微生物被截于滤膜，培养薄膜观察有无微生物生长。通常薄膜孔径应不大于0.45卩m直径一般为 50?mm假设采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。 滤器和滤膜在使用前采用适宜的方法进行灭菌。 使用

7、时应 保证滤膜在过滤前后的完整性。 水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试液其滤膜和滤器在使用前应充分枯燥。供试液经过滤膜过滤后，假设需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100?ml。总冲洗量不得超过 1000ml。化学中和法：利用化学 生物专属性灭活，常用中和剂或灭活方法有：对氨基苯甲酸、卵磷脂、聚山梨酯-80等。对化学中和剂不敏感的样品，用酶中和，如3 -内酰胺酶。联合使用：将以上两种或几种方法组合运用， 以消除样品的抑菌性。 适用于抑菌作用较 强的中西药制剂。其次按照以下要求制备 3 组样品：样品组：选择以上适当的方法中和样品，参加少量验证微生物接种量少于 10

8、0?cfu 。对照组： 0.1%蛋白胨或 pH7.0 无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液 ,加少量微生物 接种量少于 100?cfu 。阳性对照组：将试验菌株直接接种于培养基中 接种量少于 100cfu 。最后结果分析如下：样品组与对照组微生物生长数量相似， 说明中和剂的中和方式有效消除了样品的抑菌性 即有效性 ，如果对照组与阳性对照组的微生物数量相似， 说明样品预处理、 消除样品抑菌 性的方法、 检测程序和培养条件等均不影响微生物生长 即无毒性 。样品如无抑菌性， 省去 对照组试验， 样品组与阳性对照组直接比拟。 样品组微生物生长数量不及阳性对照组微生物 生长数量， 说明样品的预处理、 试验用器具

9、材料、 培养条件等方面存在对微生物生长不利的 因素。为考查验证方法的稳定性和重现性，验证至少需 3 个不同批次的同类样品，分别进行 3 次验证试验。无菌检查方法验证试验设计薄膜过滤法： 按照药典的要求取每种培养基规定接种的样品总量按薄膜过滤法过滤、 冲 洗，在最后一次的冲洗液中参加小于 100cfu 的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐 流体培养或改良马丁培养基中，或将培养基加至滤桶内。另取一装有同体积培养基的容器， 参加等量试验菌，作为对照。按照药典的要求的温度和时间进行培养。直接接种法： 取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基 8 管，分别接 入小于 100cfu 的金黄

10、色葡萄球菌、 大肠埃希菌、 枯草芽孢杆菌、 生孢梭菌各 2 管 ;取符合直 接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基 4 管，分别接入小于 100?cfu 的白色念珠菌、 黑 曲霉各 2管。其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量， 另1管作为对照， 按照药典的 要求的温度和时间进行培养。结果判断同对照管比拟，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，那么说明验证通过; 如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、 缓慢或不生长，验证失败，应采用增加冲洗量、增加培 养基的用量、使用中和剂和灭活剂、 更换滤膜等方法，消除供试品的抑菌作用，重新进行验 证。新GMF检查重点首先要检查方法验证方案设计的科学性和

11、完整性， 是否有与药典方法相悖的地方， 尤其 是产品本身的抑菌性，检查方法的选择，是直接接种法还是薄膜过滤法等。无菌检查方法验证的硬件是否具备及是否已经进行了相关确实认。 如使用黑曲霉菌是否 具有生物平安柜并进行确认， 无菌室确实认及日常监测， 培养箱的型号及数量和进行确认的 情况等，智能集菌器、全封闭无菌试验过滤培养器的型号、性能，滤膜是否符合规定等。验证中各个环节有关数据的真实性， 如产品本身抑菌性试验数据， 菌种回收率和培养基 适用性和灵敏度检查数据， 菌种的传代、 销毁和使用记录， 无菌检查操作记录、 培养记录等。无菌检查中偏差的处理是否真的找到了根本原因， 是否在没有确切的原因前就对

12、样品重 新检查并依据新的检查结果放行产品。验证的方法与无菌检查操作规程和无菌检查记录是否完全一致，如操作步骤、 检查方法、检查环境、试验耗材均需与实际检查操作规程及验证过程完全相符。为了考查验证方法的稳定性和重现性，验证时是否至少采用了3 个不同批次的同类样品，分别进行了 3 次验证试验。使用新的滤膜或过滤器 不同厂家或批号、 型号 是否重新进行样品试验组、 蛋白胨对照 组和阳性对照组的验证确认。除非样品不能采用过滤的方法难溶解 ，企业是否采用全封闭的薄膜过滤法。菌液的保存条件和保存期限是否符合药典的要求， 对于黑曲霉孢子悬液是否有验证的资 料。无菌检查的考前须知 培养基的适用性检查包括培养基

13、的无菌性检查和培养基的灵敏度检查。 中国药典附录中规定的检验数量不包括阳性对照用样品量，虽然附录另处有专门说明，仍然容易忽略。无菌检查时应强调“检验数量， 主要是保证试验结果的代表性， 而阳性对照试验和验 证时仅须满足“检验量总量要求即可， 以保证试验结果的可靠性， 验证试验可以由此减少 大量的样品 ;工作菌株的传代次数不得超过 5 代，以防止过度的传代增加菌种变异的风险。这里“代的定义是指， 活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养， 任何亚培养的形式 均被认为是转种或传代一次。菌液参加，按规定应在最后一次冲洗液中参加阳性菌液，主要是考虑过滤器的有效性。 过滤器的有效性应由提供企业控制，

14、用户可采用适当方法抽查 如检查阳性菌液通过滤筒的 流出液 。实验室菌种的处理和保存的程序应标准化，以尽可能减少菌种污染和变异。 试验时菌悬液并不是只要活的菌体就行， 而是要保持旺盛的生命力， 所以菌悬液存放时间不能太长。菌液制备后假设在室温下放置，应在2?h内使用，假设保存在 28C,可在24?h内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在28 C,在验证过的贮存期内使用。薄膜过滤法采用大样品量集菌的方法，具有代表性，不易漏检，仪器操作相对简单。该系统是全封闭过滤系统，防止了操作过程中外源性微生物的污染，对试验结果的可信性影响较小。因此无菌试验采用薄膜过滤法还是直接接种法并不依赖于验证结果，而是取决于样品的特性，如能采用过滤的方法均应采用薄膜过滤法检查。假设样品含有抑菌成分，当采用薄膜过滤法时，应先将供试液稀释后在过滤，这样可以减少滤膜对样品的吸附，减少冲洗量，进而减少微生物的损失或伤害。无菌检查应作为稳定性考察的工程进行，以便对产品有效期的制定和合理确实定储存条件提供重要的依据。阳性结果的调查：在无菌检查中必须小心防止任何可能污染样品的行为。一旦发现微生物生长，该批产品就被判断非无菌，必须进行调查。只有可以造成微