waters-液质联用

1、1 适用范围本设备配备ACQUlTY UPLC液相色谱仪、XeVO TQ- SmiCrO MS/MS质谱仪，适用于食品、药品中各种有机物的定性、定量 分析，是一种具有高灵敏度的检测仪器，仪器由主机、计算机和数据 处理软件等组成。2.职责2.1操作人员按照本规程操作仪器，认真填写实验使用记录。2.2保管人员负责对仪器进行定期维护和保养。2.3科室负责人负责监督检查规程的执行。3操作程序日常操作步骤：准备UPLC->设置样品表一-> 运行样品一-定量 打印报告o注：如果一个星期内不运行样品请不要尖质谱仪，使其保持真空。 建立新方法和PrOjeCt的操作步骤：准备UPLC -建立新 的P

2、rOjeCt用标准品调谐编辑质谱方法编辑UPLC方法一一设置样品表一-运行样品一-定量一-> 打印报告。3.1开机：3.1.1彻底开机顺序（仪器已矢闭）确定MS及其它仪器电源电缆已 连接，开氮气发生器、开氨气，小表<0.1 mpa。打开计算机电源 > 等 待WindOWS正常启动 > 电脑界面右下角网络图标红叉。打开UPLC自 动进样器电源，等到电脑界面右下角网络图标出现感叹号！。打开 UPLC泵电源，等约30s或者是有响声。打开质谱电源，等待5min， 离子源透视镜里面亮。打开MaSSIynX软件，masslynx主界面- 左狈instrument MaSS tune

3、界面菜单栏 VaCUUiTI-PUmP 同样界面左侧偏上 CIiagnOStiCS-VaCUUm-analyserMSl turboSPeecl%要在5分钟内升到80。至少抽真空4个小时 > 查看真空状 态主界面InaSS COnSOIe界面左侧 XeVO tq ms CleteCtOr加号展开-TIS CliSPIay >碰撞室真空度 > 达到1.32E-5 mBar。3.1.2日常开机顺序（仪器未尖闭）开氮气发生器、开氨气，小表 <0.1 mpa，打开MaSSlynX软件，进入工作站。3.2建立项目点击file下的PrOjeCt WiZarCl ,出现对话框，单击y

4、es出 现对话框，输入PrOjeCt JoCatiOn为C:MS DATA ,单击next,选 择 Create existing PrOjeCt as template,并 以 c: 为模板，单击 finish .点击 OK。3.3准备UPLC系统准备液相的一般流程：准备流动相 > 准备样 品 >灌注二元泵 >灌注自动进样器 >建立液相方法 > 平衡液相3.3.1. 准备流动相用0.22Um的膜过滤缓冲液，所有的缓冲液和超纯 水都要新配制，超纯水和缓冲液使用不得超过二天，缓冲盐一定要是 可挥发的，而且浓度不要大于IOmM。3

5、.3.2. 样品要求所有样品尽量用流动相初始梯度比例的溶剂来溶解， 并用0.22Um的膜过滤。3.3.3 灌注二元泵在MaSSlynX主界面，单击MS COnSOIe）进入UPLC 交互显示界面'点击左栏 ACqUity UPLC SyStelT> COntrOl > Start UP SyStem，单击QSM，选择需要用到的流动相位置，如A和B，选择 Seal WaSh ，时间设为 3 分钟。单击 SM，选择 StrOng WaSh 5 CyCIeS , SamPle Syringe 20 单击 EqUilibrate to MethOCl ，将流 速设为 0 J 单击

6、Start开始灌注时间大约为9 min左右。设定流 速、平衡液相 在 MaSSIynX主界面，单击Inlet MethOd图标，打开液相方法编辑 窗口，单击 StatUS > ACQIJITY AClClitiOnal StatUS，进入液相控制 台，单击A或B或流速的位置，出现流速、比例设定对话框，设定液相流速与比例，单击对勾，开始平衡液相，如果后面要做调谐，可设 定流速0.2 mlmin5有机相与水相的比例为50:50。3.4准备质谱3.4.1.计算化合物单同位素质量数MaSSlynX主界面> 单击Tools> MOIeCUIar Weight Calculator,输入

7、化合物的分子式（大写-注意 Cl、Br等正确的输入方法），注意选单同位素MOnOiSO ,Ion Mode:离 子化模式,+ve正离子» -Ve负离子,单击 CaICUIate。3.4.2用IntelIiStart进行自动调谐 在MaSSlynX主界面单击MSTUne图 标，打开调谐窗口，单击IOn MOde > ES+或ES-，单击APl GaS图标打开氮气，单击打开高压 选择MS MOde图标，设 定液相流速0.2 mlmin,水：乙睛的比例为50:50。把标准品调谐液放 入质谱仪塑料瓶位置处的A （或B）号位（注:浓度在200 PPb左右） 单击 FlUicIiCS ,选

8、择 ReSerVOir 为 A ,Flow State 为 LC 模式，点击 PUrge 图标。PUrge结束后，将FIOW State改为COmbine模式，设定 FUnCtiOn为MSl SCarl，MaSS为计算出化合物的质量数，SParI为5， 点击进样，开始进样，直到离子的响应比较稳定。保存调谐文件： FiIe > SaVe AS至已建的项目下。在MaSSlynX主界面，选择MS COnSOle> XeVO TQ MS DeteCtOr 选 择 IntelliStart ，选 择 SamPIe TUne and DeVelOP MethOcl ， ES+ 单击 Start

9、 图标，出现 IntelIiStart 自动调 谐编辑窗口 ，选择SWitCh to AdVanCeCl mode，输入COmPOUnCl name （化合物名称MOIeCUIar Mass/FOrmUIa （分-7 -子量或分子式）AddUCt A+ （ M+H + ，选择 LOacl EXiSting SamPIeTUne,在SamPIe TUne Name方 框后的“。”处调用开始保存的调谐文件'在DeVeIOP MRM MethOCl 前 的方框打钩，并在方框出输入MRM方法的文件名，路径为已建的项 目下。在 Print RePOrt 前方框打钩,COne VOItage ，

10、COIIiSiOn Energy 处为默认值、FIUiCliCS 下的 FIOWPath 选择 COlnbineCl 模 式，SamPIe ReSerVOir 和 SamPIe FIOW Rate 参数与 FUlCliCS 下 COmbinecl 模式下的进 样参数保持一致。单击右边的Start开始自动调谐。调谐成功，会有绿 勾出现，查看intellistart报告。3.4.3 查看intellistart中自动生成的质谱方法：从MaSSLyrlX主窗 口，单击MS MethOCl，出现MS MethOcl编辑对话框,选择File > OPen) 选择InteIliStart中保存的质谱

11、方法的文件，双击方法,如发现自动调谐 生产的质谱方法中部分参数有误,则可以在ChanneIS窗口手动修改参 数，填写relentinon WindOW中的end时 间，此时间必须与液相色谱 方法运行时间保持一致,选择AUtO Dwell,单击OK，点击File> SaVe As,保存质谱方法文件。3.5建立液相方法3.5.1编辑液相方法在液相方法编辑窗口，单击Inlet，输入溶剂名 称，run time及梯度洗脫程序，梯度洗脱程序中最后阶段时间必须与 run time符合，单击OK,选择FiIe > SaVe AS保存方法，单击LOaCl MethOCl ，平衡液相。3.5.2 建

12、立样品列表 在MaSSlyrIX主窗口，选择File > New建 立一个 空白的表SamPleliSt。输入文件名FiIe Name，样品信息FiIeTeXt，双 击MS File，选择质谱方法，双击InIet File)选 择液相方法，在 BOttIe中输入样品瓶的位置，在InjeCt VOlUme中输入进样体积，可右 键> Add,增加样品表的行数,保存样品表：File > SaVe AS o3.6数据采集和处理361.选中要采集的样品，单击RUn > Start J选择ACqUireSamPIe Data OnIy,，单击OK开始进样并采集。3.6.2在采集过程

13、中，可查看色谱图，点击ChrOmatOgram窗口，点 击 Real-time UPdate icon .如果不能见整个 TIC 图，单击 DefaUlt Range 图标。如果方法中包括多个通道,可通过DiSPlay > MaSS查 看 如果方 法中包括多个检测器或多个FUnCtion,可通过DiSPlay > TlC查看3.6.3处理多个FUnCtiOn的数据如果质谱方法中有多 个 FUnCtiOn ，如有三个 FUnCtiOn ，如想看第二个 FUnCtiOn，MS SCarl 的数据。 在色谱图窗口，点击DiSPlay > TlC，选中MSSCan，选择

14、 Add trace 、单击 OK。 如想查第二个FUnCtion, DaUghter SCan质谱图，在色谱 图 中'选择 DiSPlay > TIC）选择 SCanWaVeDS Add trace ，单击 OK o.选择PrOCeSS > COmbine SPeCtra.分别用右键输入信号 和本底噪 音.单击OK.得 到DaUghter SCarl的质谱 图，单击PrOCeSS >SmOOth ,，单击 OK。3.7数据处理外标定量法3.7.1 在MaSSlynX主页面单击TargetIynX/Edit method，出现定量方法 编辑

15、对话框，单击新建方法图标，新建一个定量方法。3.7.2单击Add new COmPOUnCl （添加新的化合物）图标，添加一个 新的化合物。3.7.3 单击菜单栏 update,选中 QUantitatiOn IOrl 和 COmPOUnCl Name （前面打勾）在MaSSIynX主页面，打开中等偏下低浓度标准品的色谱图，DiSPlay/Mass ChrOmatOgram选出要定量的化合物的离子对，一 般强度高的化合物用来做为定量离子，另一个离子对则作为确证离 子,用鼠标右键在定量离子对色谱图上拉一下,则COlTlPOUnCl name,ACqUiSitiOn FUnCtiOn NUmber

16、） QUantification Trace, PrediCtecl RetentiOn TilTle和RetentiOn Time WindOW将自动输入到定量方法中。注意：在色 谱图上拉的时候，要遵循两个原则，拉的位置要以色谱峰的峰尖左右 对称，拉的宽度要超过峰的起点和终点。3.7.4单击工作曲线图标，在工作曲线设置页面， 填入 COnCentratiOn Units:浓度单位'例如 ngml, ug/kg，PPb） PPm 等。COnCentratiOn Of Standard: LeVel -选择 COrc.A。 POIynOInial TyPe -选择Linear.（可根据自

17、己行业的规 定）CalibratiOn Origin_ 选择 exclude （排除原点），include （包含原点）,force （强制过原点）Weithting FUnCtiOn （权 重）_1/x （根据 自己行业规定）PrOPagate CalibratiOn ParalneterS_ 如 果所有的化合物均用相同的工作曲线的参数，选YeS3.7.5 打开积分参数列表，选中 APeX TraCk EnabIeCl （打勾，YES），IntegratiOn WindOW EXtent 输入 2，选中 PrOPagateIntegratiOn ParameterS （打勾），如果色谱峰并不

18、是很对称的色谱 图，可先在色谱图上先设定参数，积分，好积分参数满意之后， PrOCeSS/integrate , /copy ,在 TargetIynX 方法中 ECIit/Past 就可 将其粘贴 到TargetIynX方法中。建议用APeX TraCk积分方法，SmOOth方法建 议用SmOOth iteration 1 ,smooth WiClth 2。重复上面 的过程'把其他几个 化合物的信息全部加入，保存方法：File/Save As,保存到当前项目的 MethDB文件夹中，正确的SamPIeIiSt表格模板，除了前面进样时的选 项之外，还要有SamPle type, Con

19、A,等选中要处理的样品、单击 PrOCeSS SamPleS 出现下图的对话框确保选中JIntegrate、SamPIe，CaIibrate StandarCl，QUantify SamPIe）选择刚才编辑的 TargetIynX方法，单击OK后，出现定量结果对话框。可根据自己的需 要,用鼠标右键,Chang COIUmn Order来增加或减少SUmmary中的选 项。3.8尖机程序3.8.1日常尖机：如果流动相中有缓冲盐必须先将缓冲盐换成水，灌注2分 钟，流速设为0.2mlmin，80%水相，冲洗至少30分钟，换成80%有 机相，冲洗至少20分钟，停流速，水相，冲洗至少30分

20、钟，换成 80%有机相，冲洗至少20分钟，停流速，柱温为室温。尖质谱：主界面mass tune或者电脑下面仪器图标-界面 左侧偏上 fluidics-flow State 选择为 WaSte、尖氮气、ITIaSS tune 界面或者电脑下面仪器图标工具栏第6个 > 矢高压mass tune界面右 下角> 等待去溶剂气温度降低至100度以下mass tune界面或者电脑 下面仪器图标左侧偏上。ES+source temperature desolvation >尖氮气，点击氮气发生器开启开矢。3.8.2彻底尖机先完成日常尖机 泄真空：t

21、une Page > VaCUUm > Ventyes >等待涡轮分子泵转速降到10以下J masslynx主界面 左侧instrumentMaSS tune-界面左侧偏上 CIiagnoStiCS-VaCUUmsource turbo SPeeCl% 退出软件，其他界面先退出，主界面最后退出矢质谱电源 > 尖所有UPLC电源，计算机电源，仪器三个 电源顺序无所谓,尖氮气发生器，氮气。如果有UPS，尖闭UPS电源，计算机电源。4日常维护、保养及注意事项4.1 仪器室要保持整洁、干净、无尘；配套设施布局合理。4.2 仪器室温度应相

22、对稳定，一般应控制在20-25 OC，保持恒温；相 对湿度最好为50-70%，室内应备有温度计和湿度计，一般采用空调和 吸湿机调节温度和湿度。4.3气压过滤机械泵油，停止样品采集、停止流动相、尖闭高压、尖 闭所有气流，矢闭离子源内的真空隔离阀。用一字镰丝刀顺时针方向 拧开机械泵上的GaS BalIaSt阀四分之一圈，运行30分钟后再把GaS BallaSt阀旋转到原来尖闭的位置。对于ESl源，至少每星期做一次， 对于APCl源，每天做一次。4.4 开高压之前一定要先开氮气，尖氮气之前一定要先矢高压。4.5 ESl离子化与溶剂密切相尖，在使用某些溶剂和添加物需要注意以 下几个方面：三氟乙酸（TFA）多用于蛋白质和多肽分析，但对ESl 离