水中大肠杆菌的检测方法

1、水中大肠杆菌群检测方法多管发酵法NIEA E201.54B1、 方法概要本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在 35 ± 1 、48 ±3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（ Coliform group）;在不同体积或不同稀释度之水样所产生之结果，以100 mL 水中最大可能数（MPN/100 mL ）表示100 mL 水中存在之大肠杆菌群数目。2、 适用范围本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样中大肠杆菌群之检验。3、 干扰（一 ） 水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。（二 ） 检测使用的玻璃器皿及

2、设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。4、 设备（一 ） 量筒：100至1000 mL 之量筒。（二 ） 吸管：有0.1 刻度之 10 mL 灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。（三）试管：大小约150 x 15 mm试管或有盖螺旋试管。（四）发酵管（fermentation tube）:大小约 22 x 9 mm之玻璃管。（五 ） 稀释瓶：容量约100 mL 可灭菌之硼硅玻璃制品。（六 ） 锥形瓶：200至2000 mL 之可灭菌硼硅玻璃制品。（七 ） 采样容器：容量120 mL 以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。（八 ） 冰箱：

3、温度能保持在4 ± 2 者。（九）天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至 0.01 g;待测物重量不大于2 g时，须能精秤至 0.001 go（十 ） 培养箱：温度能保持在35 ± 1 者。（H一）高压灭菌釜：温度能维持在121c （压力约15 lb/in2或1.1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。（十二） 高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在160 达 2 小时或170 达 1 小时以上者。（十三） 接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。（十四） pH 计：精确度达0.1 pH 单位。五、试剂（一）试剂水：蒸储水或

4、去离子水，导电度在 25 C时小于2心mho / cm （心S / cm）（二 ） 培养基，应使用市售商品化培养基。1、硫酸月桂酸胰化蛋白月东培养基（ Lauryl sulfate tryptose broth,简称LST）1 倍浓度 LST 培养基含有下列成份：胰化蛋白胨（Tryptose）20.0g乳糖（Lactose）5.0g氯化钠（NaCl）5.0g磷酸氢二钾（K2HPO4）2.75g磷酸二氢钾（KH 2PO4）2.75g硫酸月桂酸钠（Sodium lauryl sulfate）0.1g试剂水1L配成 2 倍浓度（取 71.2 g LST 培养基粉末溶于1 L 试剂水），完全溶解后，分

5、取10 mL 注入装有倒置发酵管之试管内，经121 灭菌 15 分钟，冷却后备用，灭菌后培养基之pH 值应在 6.8 ± 0.。灭2菌后培养基若未当日使用，应保存在4 ± 2 ，保存期限为14 天。可根据检验需求量，依配方配制培养基。煌绿乳糖胆汁培养基(Brilliant green lactose bile broth ，简称 BGLB )1 公升的 BGLB 培养基中含有下列成份：10.0g10.0g蛋白胨（Peptone）乳糖（ Lactose）0.0133g1L牛胆粉(Oxgall Powder)煌绿色试剂（Brilliant Green ）试剂水20.0g取 40

6、 g BGLB 培养基粉末溶于1 L 试剂水，完全溶解后，分取5 至 10 mL 注入装有倒置发酵管之试管内，经121 灭菌 15 分钟，冷却后备用，其pH 值应在 7.2 ± 0.2。灭菌后培养基若未当日使用，应保存在4 ± 2 ，保存期限为14 天。可根据检验需求量，依配方配制培养基。（三 ） 无菌稀释液1、磷酸二氢钾储备溶液取3.4 g磷酸二氢钾（KH2PO4）溶于50 mL的试剂水中，俟完全溶解后，以 1.0 N NaOH溶液调节 其pH值为7.2 ±0，1然后加试剂水至 100 mL,灭菌（过滤灭菌或 121c高温高压灭菌 15分钟）后储 存于冰箱中备用

7、。4 ±2 下保存期限为3 个月。2、氯化镁储备溶液取 8.1 g 氯化镁 （ MgCl 2? 6H2O） ， 先溶于少量试剂水，俟完全溶解后，再加试剂水至全量为100 mL，灭菌（过滤灭菌或121 高温高压灭菌15 分钟）后，储存于冰箱中备用。4 ±2 下保存期限为3个月。3、无菌稀释液分别取 10 mL 氯化镁储备溶液和2.5 mL 磷酸二氢钾储备溶液再加入试剂水至2,000 mL， 混摇均匀后，分装于稀释瓶中，经121 灭菌 15分钟，作为无菌稀释液备用。如欲用于水样稀释，分装之无菌稀释液灭菌后体积须为90 ±2.0 mL。 4 ±2 下保存期限为

8、3个月。六、 采样与保存（一 ） 盛装水样检验微生物之容器，应使用清洁并经灭菌之玻璃瓶或无菌塑料容器或市售无菌采样袋，且于采样时应避免受到污染。水样若含有余氯时，无菌容器中应加入适量之无菌硫代硫酸钠（采取加氯之废水时，每 100 mL 水样中加入0.1 mL、 10%硫代硫酸钠可还原15 mg/L 余氯。采取含氯之饮用水水样时，每100 mL 之水样如加入0.1 mL 之 3%硫代硫酸钠，可中和之余氯量约为5 mg / L。）。（二 ） 采样前应清洁手部，再行采水样，所采水样应具有代表性。4 ±2 。（三 ） 运送时水样温度应维持在小于10 且不得冻结，而实验室内保存温度应维持在（四

9、）水样应于采样后 24小时内完成推定实验之水样添加步骤（七、步骤 （一）4、），并置入培养箱中培养。（五 ） 水样量须以能做完所需检验为度，但不得少于120 mL。七、 步骤试验分两阶段进行。首先进行推定试验，若推定试验结果为阳性反应，则继续进行第二阶段之确定试验，如结果仍是阳性反应则显示有大肠杆菌群存在。各试验步骤如下述：（一 ） 推定试验1、慎选发酵管中没有气泡且未污染之10 mL、2倍浓度LST试管。2、水样在进行检测或稀释之前必须剧烈摇晃25次以上，以使样品充分混摇均匀。3、视水样中微生物可能浓度范围进行水样稀释步骤，使用无菌吸管吸取 10 mL水样至90 mL无菌稀释液中， 形成10

10、 倍稀释度水样，混合均匀，而后自 10 倍稀释度水样以相同操作方式进行一系列适当之100、1000、 10000 倍等稀释水样，进行稀释步骤时，均需更换无菌稀释吸管，水样稀释步骤如图一所示（注1）。4、以无菌吸管分别取各稀释度10 mL水样至内含10 mL 2倍浓度的LST试管中，每一稀释度各作 5支，小心混合均匀，混合后发酵管内不可产生气泡。5、在35 ± 1蜡养箱中培养48 士卧时，观察并记录发酵情形，若有气体产生则推定试验为阳性反应，若无气体产生则推定试验为阴性反应，但若培养液呈混浊状态，虽无产气，亦应进行确定试验。（二 ） 确定试验若推定试验之发酵管中有气体或混浊产生时，则使

11、用BGLB 进行确定试验：1、慎选发酵管中没有气泡且未污染之BGLB试管。2、利用无菌接种环自产生气体以及混浊之LST培养基试管中，接种一圈培养液至 BGLB培养基试管中。3、在35 ± 1焙养箱中培养 48 士 34时。4、在48 ± 3J、时内，BGLB培养基试管如有气体产生，则确定试验为阳性反应。八、结果处理（一）经确定试验确认 BGLB试管为阳性反应后，应以100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）计算及记录。 5 支发酵管连续三种稀释度之MPN 可查表一。（二）表一所示接种之水样量为10 mL、1.0 mL及0.1 mL,若所用之稀释度有三种以上时，采用最

12、具意义之三种稀释度，查表后再计算100 mL 水中大肠杆菌群最大可能数。稀释度之选取方式如下：1、先选取5管均呈阳性反应的最高稀释度（此时稀释度较低之各组试管必须全部呈阳性反应），再选取下两个稀释度（如表二水样别a）。2、如果稀释度最低的一组并非5管均呈阳性反应，则选取稀释度最低的一组，再选取下两个稀释度（如表二水样别b、 c）。3、如果依据上述原则（1、及2、）选取3个稀释度后，下一稀释度试管组仍有阳性反应试管，则舍弃原先 3 组中稀释度最低的一组，纳入下一稀释度的数据（如表二水样别d）。4、如果依据上述原则（1、至3、）选取3个稀释度后，更高稀释度之试管组仍有阳性反应试管，则把更高稀释度之

13、阳性反应试管数加至原先3 组中稀释度最高的一组（如表二水样别e）。（三 ） 100 mL 水中大肠杆菌群最大可能数（MPN/100 mL ）之计算公式如下：结果小于100 时， 以整数表示（小数字数四舍五入）， 菌落数大于100 以上时，只取两位有效数字：例如110以1.1 X 1表示，16,000以1.6 X 4表示。（四 ） 检测纪录须注明采样时间、培养起始及终了时间、培养基名称、培养温度及各稀释度的数据等相关数据。九、 质量管理（一 ） 微生物采样人员及检测人员应具备微生物基本训练及知识。（二 ） 每批次采样时应进行运送空白。（三 ） 每批次或每10 个水样需进行试剂空白实验。（四 ）

14、新购入之培养基，每批号均须以大肠杆菌群阳性控制菌株（如E. coli、 Enterobacteraerogene、s Citrobacterfreundii）进行测试，以确保数据质量。（五 ） 若一季期间水样均未检出大肠杆菌群，则须以大肠杆菌群菌株进行培养基测试，以确保数据质量。（六 ） 本方法培养所得之细菌可能具有感染性，检测后之培养基及器皿应经高温高压灭菌处理。十、 精密度及准确度略参 考数据（一）APHA. 2005. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21st Edition, Section 9

15、221.American Public Health Association, Washington, D.C.（二）Difco & BBL Manual: Manual of Microbiological Culture Media. 2003. BD Diagnostic Systems.注1:水样如须稀释，建议于稀释后30分钟内完成检测步骤，以免造成细菌死亡或增生，影响实验结果图一水样稀释步骤表一三连续稀释度（10 mL、1 mL、0.1 mL ）五试管重复测试时，阳性结果组合之MPN指数及95%信赖区间阳性反应组合MPN/100 mL95%信赖区间阳性反应组合MPN/100

16、mL95%信赖区间下限上限下限上限0-0-0<1.8一6.84-0-3259.8700-0-11.80.0906.84-1-0176.0400-1-01.80.0906.94-1-1216.8420-1-13.60.70104-1-2269.8700-2-03.70.70104-1-33110700-2-15.51.8154-2-0226.8500-3-05.61.8154-2-1269.8701-0-02.00.10104-2-23210701-0-14.00.70104-2-338141001-0-26.01.8154-3-0279.9701-1-04.00.71124-3-1331

17、0701-1-16.11.8154-3-239141001-1-28.13.4224-4-034141001-2-06.11.8154-4-140141001-2-18.23.4224-4-247151201-3-08.33.4224-5-041141001-3-1103.5224-5-148151201-4-0103.5225-0-0236.8702-0-04.50.79155-0-13110702-0-16.81.8155-0-243141002-0-29.13.4225-0-358221502-1-06.81.8175-1-033101002-1-19.23.4225-1-1461412

18、02-1-2124.1265-1-263221502-2-09.33.4225-1-384342202-2-1124.1265-2-049151502-2-2145.9365-2-170221702-3-0124.1265-2-294342302-3-1145.9365-2-3120362502-4-0155.9365-2-4150584003-0-07.82.1225-3-079222203-0-1113.5235-3-1110342503-0-2135.6355-3-2140524003-1-0113.5265-3-3170704003-1-1145.6365-3-4210704003-1-2176.0365-4-0130364003-2-0145.7365-4-1170584003-2-1176.8405-4-2220704403-2-2206.8405-4-32801007103-3-0176.8405-4-43501007103-3-1216.8405-4-543015011003-3-2249.8705-5-0240707103-4-0216.8405-5-135010011003-4-1249.8705-