抗FMDV基因疫苗的研究进展.docx

1、第39卷第4期西南民族大学学报-自然科学版JournalofSouthwestUniversityforNationalitiesNaturalScienceEditiondoi:10.3969/j.issn.)003-4271.2013.04.02抗FMDV基因疫苗的研究进展严亨秀，唐冬梅，付丽新(西南民族大学生命科学与技术学院，成都610041)摘要：口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的猪、牛、羊等偶蹄动物一种高接触性传染病.口蹄疫一旦爆发和流行，会使家南生产性能降低，给养殖户造成重大损失，给公共卫生造成重大的影响.随着弱毒苗禁用和灭活苗的戒少使用，新型疫苗的研究成为热点.自1990年首次出现基因疫

2、苗的研究报道之后、及因疫苗已经成为疫苗研究领域中的一大热点，因此该文对近年来国内外口蹄疫基因疫苗研究的主要进展进行绦述：关键词：口蹄疫：FMDV;基因疫苗中图分类号：S852.65;S855.3文献标识码：A文章编号：1003-4271(2013)04-0495-06口蹄疫(foot-and-mouthdisease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)所引起的牛、羊、猪等偶蹄动物的一种急性、热性传染病.该病具有传播速度快、流行范围广、对畜牧业危害较大的特点.该病一旦发生爆发流行，会使家畜生产性能降低，给公共卫生造成重大的影响.我国将此病规定

3、为一类动物传染病,世界动物卫生组织也将其列为A类传染病.世界各国都十分重视对该病的防控.我国是发病国之一，主要流行0型、A型、Asial1型口蹄疫.目前我国防治口蹄疫主要采取综合防治措施：以疫苗计划免疫为主同时辅以疫区封锁和扑杀.传统的口蹄疫疫苗主要有弱毒疫苗和灭活疫苗.但由于口蹄疫病毒易发生变异，弱毒疫苗遗传性不确定，所以从上个世纪70年代开始，弱毒苗已经停止研究与应用.同时由于灭活疫苗的潜在风险，欧盟于1992年宣布停用FMDV灭活苗.因此，研制安全、高效的新型疫苗已成为未来疫苗发展的趋势，其中基因疫苗作为一种新型疫苗成为研究的热点.本文就目前猪FMD基因疫苗国内外进展作些探讨.1 FMD

4、V结构口蹄疫的病原为口蹄疫病毒(FMDV),该病毒属于单股正链无囊膜RNA病毒，是小RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员.FMDV共有7个血清型，根据其核酸同源性大小又分为两个群.第1群分为O、A、和AsiaI型；第二群分为SAT1、SAT2、SAT3.目前为止，已经发现FMDV至少拥有80个亚型，且各血清型之间也存在着一些交叉免疫的现象.FMDV的病毒粒子包括衣壳和RNA两部分.在病毒的中心是一条单链的正链RNA,大约由8000个碱基组成，是病毒感染和遗传的基础；周围包裹着的蛋白质决定了病毒的抗原性、免疫性和血清学反应能力；病毒的衣壳为对称的20面体.其由VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白

5、组成网.由于结构蛋白突显在病毒粒子表面，承受了较大的选择压力，而且VP1蛋白暴籍在病毒粒子表面部分多，因此VP1基因容易发生变异.这些变异常常导致毒株的抗原性以及毒力的变化，给口蹄疫防治造成了很大困难.VP1代表了口蹄疫病毒的免疫原性以及遗传性方面的特点，因此在决定病毒的抗原性方面有着重要作用.经研究发现，在口蹄疫O型，有位于VP12140、141160、200213位氨基酸上的3个中和性抗原.其中141160及200213位氨基酸为B细胞的表位，能引发相关的体液免疫反应.从口蹄疫病毒衣壳蛋白中分离出VP1可以诱导动物产生中和性抗体.研究者们开始尝试用病毒衣壳蛋白上的相关抗原表位来设计基因工程

6、抗原，并用来检测和预防疾病同.收稿日期：2013-05-21作者简介：严亨秀(I97I-),女,副教授，博士，Email:yanhengxiu基金项目:四川省科技厅项目：2011JYOO33;西南民族大学研究生学位点建设项目(2011XWD-S0906)2 FMDV基因疫苗基因疫苗是将需要的外源基因克隆整合到用作真核表达的栽体上，再把重组质粒转到动物机体内，使外源性基因在动物机体内得到相关表达，并产生抗原、激活机体的免疫反应叫疫苗原理是：质粒DNA本身没有或者有微弱的免疫原性，不能够引起相关的免疫应答，但是在被感染宿主细胞内，模拟病毒感染，从而诱发有用的应答反应.同传统疫苗相比，基因疫苗具有很

7、多优点，比如无感染性，较好的热稳定性，易操作等“I.在早期研究中发现，质粒DNA能够刺激并产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应.质粒中所包含的相关抗原基因被翻译后，提呈给机体免疫系统时，可以诱导B细胞和T细胞免疫反应IW.同传统的疫苗相比，基因疫苗能够引起广泛的免疫应答，包括先天免疫、体液免疫和细胞免疫Mm】.同时，基因疫苗拥有多种免疫方式，包括注射免疫、基因枪法和电穿孔法等，当以基因枪法或者电穿孔法进行免疫时，往往产生较强的体液免疫；而进行肌肉注射、皮内注射、腹腔注射时则会产生较强的细胞免疫口蹄疫基因疫苗一般是保护性抗原基因和真核表达质粒载体这两部分组成.保护性的抗原基因可以是：能编码VP1

8、的抗原位点上的表位口-24】，单个基因(如VP1)四)，一组基因I2&29,也可以是编码基因和有协同保护作用的基因连在一起列.用作口蹄疫基因疫苗的真核表达质粒载体有多种，而研究者通常选择PCDNA3.I系列.从结构上看,pCDNA3.1具有大肠杆菌的Ori位点，使它能在原核细胞中进行大量复制，因而目的基因可以随宿主细胞的分裂跟随胞浆遗传给新生子细胞而保证目的基因的稳定表达；它是一种高效的真核表达质粒，含有T7多克隆位点，以便于外源基因插入；包含有高效增强子SV40,这种增强子是能促进基因转染活性的调控元件,在目的基因前多克隆位点前装有功能很强的基因启动结构T7PCMV,这样使得目的基因的表达得

9、以保证.3 FMDV基因疫苗的发展抗FMDVDNA疫苗的研究开始于20世纪80年代末和20世纪90年代初【尬31).Wolff时等将质粒DNA接种于小鼠肌肉，取得了较好的免疫效果.Ward时等首次将FMDV血清型A12的cDNA连接在真核表达质粒载体上,转染BHK-21细胞后产生病毒粒子.Beard,54等人首次报道了FMD病毒基因疫苗免疫小鼠后能产生抗FMDV结构蛋白VP1的特异性抗体，用其免疫猪后也诱发了较强的免疫反应，证实了FMD病毒基因疫苗能引起特异性免疫应答反应HuangH1351等，利用猪IgG序列融合蛋白基因构建的基因疫苗，在不同的早、晚期启动子控制下，免疫豚鼠均均可诱导中和抗体

10、的产生和脾细胞的增殖.在口蹄疫基因疫苗的研究中，研究者们最初仅选择编码VP1表位的核酸区段进行免疫，结果发现表位所诱导的免疫反应持续时间较短且表现很弱.WongNI等尝试着克服这一点，将FMDVVP1140160和200213位氨基酸残基编码区基因同猪【gG的重链恒定区编码基因相连，构建了一个真核表达质粒(pCElS),然后在小鼠(腹部)和猪(耳部、腿部)分别进行免疫.免疫腹部的小鼠和免疫耳部的猪都产生了体液免疫和细胞免疫，并在攻毒中获得全部保护，但在腿部进行免疫的猪没有被保护.赵凯、陈光辉38】等首先缺失掉IgGH链基因中的抗原互补决定区(CDR3区)，再将所剩两个基因片段分别与质粒pBlu

11、escript口SK(+)和质粒pBluescriptHKS(+)相连接.其中与质粒pBluescriptflSK(+)相连接的片段再与编码FMDVVP1的141160和200213位禽基酸残基所构成的串联片段相连接.然后将之前的片段和串联片段切下与真核表达载体pET28b再次连接，构建出新的表达质粒pET28b-FH,将其转入大肠杆菌中，表达出64kD分子量的蛋白质.实验证明这种蛋白抗O型FMDV活性；将该种蛋白通过肌肉注射豚鼠和猪.在攻毒实验中发现，质粒pET28b-FH对豚鼠产生了保护作用;Benvenisti1281等将FMDV结构基因Pl和非结构基因2A、3CD进行串联后，再连接上脑

12、心肌炎病毒的核格体基因.通过检测发现了在机体外有病毒蛋白表达，再利用基因枪将产生的蛋白注射到猪皮肤中，结果发现部分猪获得了抵抗FMDV强毒攻击的能力.随着研究的进行，一些学者开始关注一些细胞因子的作用.比如IL-2、1L.1、IL-6、IL.15、IL9、IL-18、OX40L和4-IBBL(属于TNF受体家族)，但只有IL-2和IL18在自然易感动物进行了实验刊.Wong等用400瞄pCEIS和400昭pCEIS-IL-2分别来免疫猪仲，所有组都产生了相同的B细胞免疫应答，但是T细胞免疫在PCEIS-IL-2组较强，且这组中的所有猪都在攻毒中获得全部保护.以上早期研究中，尽管学者们所用的免疫

13、方案简单有效，但基因疫苗所产生的保护效率还很有限.Shieh1251将基因免疫与亚单位疫苗联合起来进行免疫，希望以此增强疫苗的免疫效果.首先用负载口蹄疫病毒基因VP1的质粒免疫鼠，接下来用VP1多肽偶合物(P292KLH)加强，免疫后的小鼠产生高滴度的抗体.这些抗体具有中和口蹄疫病毒的活性.在Shieh的研究基础上，Jin1451等改进免疫方案，用FMDV基因疫苗进行初次免疫后,FMDVVP1蛋白加强免疫，比较该种免疫方案和传统基因疫苗方案的不同.结果显示免疫后的小鼠和绵羊均获得很强的体液免疫和细胞免疫.人们发现增强免疫、联合免疫等方式都有刺激免疫增强的作用.基因疫苗中抗原肽的多样性可能是部分

14、基因疫苗免疫效果不佳的原因所在，因此一些研究人员开始研究针对B细胞和T细胞特定表位的FMDV基因疫.Zhang等研究了FMDV多种结构表位组合的基因疫苗作用，包括FMDV的五个结构位点：SG(sites1,2,4,3,5,VP1T-cellepitope);N4(sites1,2,5,1T-cellepitope);N51(sites2,3,4,VP1T-cellepitope);T51(sites2,5,VP1T-cellepitope);和51(sites1and5),以SG、N4和T51为抗原的基因疫苗能诱发显著的抗FMDV和抗体和脾细胞增殖，表明基因疫苗中的抗原位点应该来自VP1的1,

15、5区和T细胞表位.Guo,47)等研究在缺失其他免疫刺激物的情况下，将一种T细胞表位(位于非结构蛋白3D上)的内含物加入免疫，观测其能否提高临床保护.用600昭包含VP1,2A和3C(pCDNA.3.1P12X3C)的质粒DNA和1.5mg纯化3D免疫豚鼠，结果都产生了细胞免疫，但所产生的抗体水平普遍较低.攻毒后，对豚鼠不能产生保护.值得一提的是用不含3D的pCDNA.3.1P12X3C进行免疫时，产生了较高的抗体水平和临床保护.进入21世纪，人们开始关注DNA疫苗的载体、如何更佳趋化免疫细胞、以及限制病毒复制等问题.如果这些问题得到很好的解决，将可以大大降低DNA的用量和它的潜在风险.人们已

16、开始尝试在不同部位免疫、用PLG包裹DNA、阳离子脂质体、电穿孔法、佐剂等方法提高免疫效力.也有学者直接用免疫增强剂来提高FMDV基因疫苗的活力，包括tween80、丁哌卡因、BCG、C3d、壳聚精、板兰根提取物、CD40等甄罚；尽管大部分佐剂被证明有加强体液免疫和细胞免疫的作用，但是到目前为止，这些佐剂还未在自然易感动物中进行测试，其潜力仍待探索.Niborski和Li等用PLG微粒，阳离子微脂囊，明矶和羊的GM.CSF分别与CedilloBarron等使用的质粒结合免疫研究其免疫效果阡叫同时他们也研究接种部位和剂量对免疫效果的影响.研究显示，当以1.2mgPLG微粒负载DNA皮注或肌注免疫

17、绵羊时，产生了最好的体液免疫和细胞免疫，在进行天然气溶胶攻毒时，绵羊获得全部保护.Li等发现，对羊进行皮注和肌注结合免疫时产生了很强的免疫反应，这是首次考虑由接种部位不同而产生不同的免疫效果，对今后评估基因疫苗的有效性具有重要启示作用.Wang1541等探究使用包含多种疾病编码基因的基因疫苗免疫能否提高免疫应答.使用三种质粒：含。型FMDV5个表位的质粒，含伪狂犬病毒株(Ea)的gD基因的质粒，猪高热病病毒的E2基因的质粒.分别以150昭DNA进行电穿孔法免疫后都获得了体液免疫和细胞免疫.但当每种剂量减少到150熙再结合进行免疫时，抗FMDV的体液免疫和细胞免疫被抑制.这启示我们应该仍需进一步

18、研究抗FMDV的基因疫苗能否与其他疫苗一起使用.Lif551等用初免一加强法：先以1.2mgpcDNA3/P12A3C3D质粒和800昭表达pGM-CSF的质粒进行初免,再以灭活146SFMDV抗原和重组3D蛋白构建的结合蛋白来加强免疫.结果在猪上产生了中和抗体，并在攻毒中得到保护.这次免疫中使用相对较高的DNA剂量和灭活的FMDV抗原进行加强.Borrego1561等将来自pCMV-BTT的表位同APCH1的单链可变区结.Ganges等用pCMV-BTT和pCMV-spBTT分别免疫猪，并进行攻毒.结果除了一只注射了pCMV-spBTT的猪检测到抗体外，其余猪上均未检测到中和抗体.Borre

19、go1571等按Ganges的方法使用相同DNA剂量进行实验，获得了不同结果.在研究中，有两只猪获得全部保护，另有两只获得部分保护(临床症状减轻).另外Ba*】将结构基因PI和一种核酸依赖型RNA聚合蛋白D3进行重组结合，构建质粒并免疫小鼠，结果获得了相应的体液和细胞免疫应答.WangG【列等人用包含编码FMDV衣壳蛋白和牛IL.6基因的阳离子PLGA纳米颗粒作为鼻内载体免疫大鼠后，结果获得较强的细胞免疫.4基因疫苗的应用及展望基因疫苗相对于传统疫苗有很多优点，比如不会发生活体病毒感染，不会对病毒非结构蛋白产生一些免疫反应等，但用于实践的疫苗还不多，主要是由于此类新型疫苗的免疫原性较弱，需要大

20、量应用或者急性重复注射.因此，研究人员采用了很多方法试图来解决这些问题，比如将多肽与T细胞表位或折B细胞表位连接，增加多肽拷贝数，增强疫苗在机体内部的免疫反应等I60叫.基因疫苗自研究以来始终伴随着各种质疑.例如基因有可能会整合到宿主的基因中，外源抗原的持续表达也许会产生不良后果，质粒DNA上所携带的抗原基因不可进行调控，质粒DNA有可能会诱导自身免疫反应等安全性问题.但在目前实际研究中，还未发现上述可能情况，这也有可能是当前的研究还未显现其不安全的状况.所以，疫苗的安全性仍是研究者们需要关注的重要方向.随着对基因疫苗的研究越来越多，如何将科研与临床应用相结合，如何在实际中推广，仍然面临很多困

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