微生物限度检查方法及其验证报告(修改)

1、页眉内容页眉内容73021文件编号：微生物限度检查方法及其验证报告目录1样品相关信息1.1基本信息2主要仪器设备和试验耗材信息2.1主要使用的仪器设备2.2试验用培养基2.3试验用试剂2.4试验用菌种3试验环境3.1无菌室3.2洁净工作台3.3生物安全柜4试验方案4.1验证试验目的4.2微生物限度检查方法草案5方法验证试验5.1菌液制备5.2计数培养基适用性检查5.3控制菌检查用培养基使用性检查5.4供试液制备5.5方法验证5.5.1菌落计数方法验证试验5.5.2控制菌检查方法的验证5.6方法验证结论6供试品微生物限度检查结果1样品相关信息1.1基本信息（三批）品名多烯酸乙酯软胶囊或蛹油a亚麻

2、酸乙酯胶丸规格0.25g/粒，30 粒/瓶 或 0.3g/粒，30 粒/瓶批号2主要仪器设备和试验耗材信息2.1主要使用的仪器设备仪器名称型号编号培养箱HH-360ZL-025MJX-150ZL-042SPX-150BZL-046JJ-5ZL-026电子天平JY1001ZL-013超净工作台JH-DCBZL-028生物安全柜BSC-1100U A2ZL-0292.2 试验用培养基2.2.1对照培养基培养基名称批号生产厂家胰酪大豆胨琼脂培养基中国食品药品检定研究院胰酪大豆胨液体培养基沙氏匍萄糖琼脂培养基沙氏匍萄糖液体培养基麦康凯液体培养基麦康凯琼脂培养基RV沙门增菌液体培养基2.2.2试验用培养

3、基培养基名称配制批号胰酪大豆胨琼脂培养基胰酪大豆胨液体培养基沙氏匍萄糖琼脂培养基沙氏匍萄糖液体培养基麦康凯液体培养基麦康凯琼脂培养基RV沙门增菌液体培养基2.3试验用试剂试剂名称配制批号含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液含0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液0.9%氯化钠1%红四氮唑2.4试验用困种菌种名称菌种编号工作用菌种批号及代数信息大肠埃布困CMCC (B) 44 102E3-02枯草芽抱杆菌CMCC (B) 63 501E3-02金黄色葡糖球菌CMCC (B) 26 003E3-02乙型副伤寒沙门菌CMCC (B) 50094E3-02白色念珠

4、菌CMCC (F) 98 001E3-02黑曲霉CMCC (F) 98 003E3-023试验环境中国药典2015版规定，微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局 部洁净度100级的单向流空气区域内进行。本公司微生物限度室、阳性对照室、生物安全柜及超净工作台洁净度检测无 特殊情况下每季度进行一次。3.1无菌室无菌室按医药工业洁净厂房设计规范GB 50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合 GB50457-2008对10000级洁净度要求。3.2超净工作台超净工作台按医药工业洁净厂房设计规范GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要

5、求。超净工作台沉降菌检测记录沉降菌落数左 0中 0右 0空白对照03.3生物安全柜生物安全柜按生物安全实验室建筑技术规范GB50346-2011监测，静态洁净度检测结果符合 GB50457-2008对100级洁净度要求。生物安全柜沉降菌监测记录沉降菌落数左 0中 0右 0空白对照04 试验方案按中国药典2015年版第四部：（通则1105）非无菌产品微生物限度 检查：微生物计数法、（通则1106）非无菌产品微生物限度检查：控制菌检 查法、（通则1107）非无菌药品微生物限度标准及（通则 1121）抑菌效力检 查法规定，本品微生物限度标准为：1g供试品中，需氧菌总数不得过1000cfu, 霉菌和酵

6、母菌总数不得过100cfu，大肠埃希菌不得检出。4.1验证试验目的确认所采用的方法适合于本品的微生物限度检查。即确认本品在该检查量 及该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不计。保证 检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。4.2微生物限度检查方案对三批产品进行3次独立的平行试验。取本品10g，加含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分散均匀，制成1： 10的供试液。取1： 10的供试液1ml，加含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化 钠-蛋白胨缓冲液至9ml，即为1： 100的供试液。微生物计数法，取1： 10的供 试液1ml，注入

7、平皿中，依法检查（中国药典2015年版四部通则1105）;控制菌 检查法，取1： 10的供试液10ml，置胰酪大豆胨液体培养基100ml中，依法检 查（中国药典2015年版四部通则1106）。5 方法验证试验对上述非无菌产品微生物限度检查方法方案进行验证。5.1菌液制备（1）接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽抱杆菌、沙门菌的新鲜培养 物至胰酪大豆胨液体培养基中，3035 °C培养1824小时；接种白色念珠菌的 新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，2025C培养23天。上述培养物用 H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于 100cfu的菌悬液

8、。（2）接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，2025C培养57天，加入3ml 0.05%聚山梨酯80的H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9% 无菌氯化钠溶液，将抱子洗脱。然后，过滤菌丝吸出抱子悬液至无菌试管内，用 0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制 成每1ml含抱子数小于100cfu的抱子悬液。5.2 计数培养基适用性检查（实验时间：取上述制备好的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌菌液各1ml（小于100cfu），分别注入无菌平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每株 试验菌平行制备2个平板，混匀，凝固，置3035C培

9、养35天，计数；取上 述制备好的白色念珠菌、黑曲霉菌液各1ml （小于100cfu），分别注入无菌平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，混匀，凝固，置2025C培养57天，计数；同时，用相应的对照培养基替代被检培养 基进行上述试验。若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均 数的70%，且菌落形态大小与对照培养基的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。试验结果如表1:表1培养基适用性检查结果金黄色葡萄球 菌枯草芽抱 杆菌大肠埃布 菌黑曲霉白色念珠 菌对照培养基12；平均被检培养基12平均回收率%菌落形态大小 是否一致结果判断5.3 控制菌检查用培养基

10、适用性检查（实验时间：5.3.1控制菌（大肠埃希菌）检查用培养基适用性检查麦康凯液体培养基促生长能力和抑制能力检查： 接种不大于100cfu的大肠埃 希菌于被检培养基和对照培养基中， 在4244°C培养2448小时，结果见表2。 接种不少于100cfu的金黄色葡萄球菌于麦康凯液体培养基中，在 4244C培养 2448小时，结果见表2。麦康凯琼脂培养基促生长能力和指示特性检查：接种不大于100cfu的大肠埃希菌与被检培养基和对照培养基中，在3035C培养1872小时，结果见表2。表2控制菌检查用培养基适用性检查结果检测项目培养基试验用 菌促生长能力抑制能力指示特性对照培养基被检培养基对

11、照培养基被检培养基对照培养基被检培养基大肠埃希菌麦康凯 液体培 养基大肠+/金葡/+/麦康凯 琼脂培 养基大肠+/+结论注：表中“ +”标示有能力，“-”标示没有能力，“/”标示不要求做5.4供试液制备（实验时间：取本品10g,加含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至 100ml，振摇至供试品分散均匀，制成1： 10的供试液。取1： 10的供试液1ml， 加含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml，即为1： 100的供 试液。5.5方法验证（实验时间：5.5.1菌落计数方法验证试验（1）菌液组：分别取菌液1ml，采用平皿计数法，测定上述备好的菌液中每毫升的

12、活菌数，测定结果见表3（2）供试品对照组：取1: 10的供试液1ml，注入平皿中，测定供试品本底 的需氧菌总数，测定结果见表 4。取1： 10的供试液1ml，注入平皿中，测定供 试液品本底的霉菌和酵母菌总数，测定结果见表 4.（3）试验组：取1： 10的供试液1ml和上述控制菌菌液1ml （小于100cfu试 验菌）分别注入同一平皿中，测定结果见表 5,回收率见表6。另取1： 10的供 试液的供试液1ml和上述真菌菌液1ml （不大于100cfu试验菌），分别注入同一 平皿中，测定结果见表5,回收率见表6。（4） 稀释剂对照组：取1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 1ml、p

13、H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml分别注入平皿中，测定结果见表 7。 上述已注入供试液的平皿（其中试验组在注入供试液和控制菌菌液后应立即倾注培养基），需氧菌总数，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，待凝固后，置3035C培养35天逐日观察结果，霉菌和酵母菌总数，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，待 凝固后，置2025C培养57天逐日观察结果。表3菌液组菌落计数（cfu/皿）大肠埃布困金黄色葡萄 球菌枯草芽抱杆 菌白色念珠菌黑曲霉12平 均表4供试品对照组菌落计数（cfu）试验次数需氧困总数霉菌和酵母菌总数1ml平均1ml平均123表5试验组菌落计数（cfu）试验 次数大肠埃希菌金黄色葡萄 球菌枯草芽抱 杆菌

14、白色念珠 菌黑曲霉112平均212平均312平均表6试验组回收率测定结果试验次数回收率%大肠埃布困金色葡萄球 菌枯草芽抱杆 菌白色念珠菌黑曲霉123表7稀释液对照组试验次数pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1%聚山梨酯80的pH7.0无 菌氯化钠-蛋白胨缓冲液123平均经上述实验验证，采用上述方法方案进行本品的需氧菌总数、霉菌和酵母 菌总数可使用回收率达到要求。5.5.2控制菌检查方法的验证(实验时间：菌液制备接种大肠埃希菌的新鲜培养物至 10ml胰酪大豆胨液体培养基中，33C培养24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液9ml制成每1ml含菌数为10cfu100cfu菌悬液。(1) 供试品组：取1:

15、 10的供试液10ml，加至胰酪大豆胨液体培养基100ml 中，置33r培养24小时。(2) 阴性对照组：取稀释液10ml，加至胰酪大豆胨液体培养基100ml中，置 33r培养24小时。(3) 取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，置 43C培养24 小时，观察结果，见表7。表8大肠埃希菌检查结果大肠埃布困胰酪大豆胨液体培养基麦康凯液体培养基供试品组阴性对照组表8结果显示，表明本品在该条件下对大肠埃希菌无抑菌作用或其抑菌作 用可以忽略不计。说明采用该法进行本品的大肠埃希菌检查可行。5.6方法验证结论上述验证试验结果证明，非无菌产品微生物限度检查方法方案可行。依据验证结果，制定非无菌产品微生物限度检查方法如下：微生物限度 取本品10g，加含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白 胨缓冲液至100ml，使供试品分散均匀，制成1： 10的供试液。必要时，取1： 10的供试液1ml，置含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至9ml 中，即为1： 100的供试液。需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，分别取1： 10的供试液1ml，注皿，微生物计数法，取1： 10