土壤中微生物的分离与纯化

1、 微生物学试验报告 试验名称：土壤中微生物的分别与纯化 课程名称 环境微生物学试验 学 院 环境科学与工程学院 专业班级 2011级环境科学（1）班 学 号 3111007364 姓 名 刘迪鸿 联系方式2013年 12 月 10 日试验报告土壤中微生物的分别与纯化刘迪鸿（广东工业高校11级环科（1）班）摘要：各种微生物生长所需条件存在差异，依据需要配制不同的培育基可以得到只含目标菌株的纯培育。关键词：选择培育基，分别，纯化一、 试验目的与要求1. 明确培育基的配制原理，并通过对微生物培育基的配制，把握配制培育基的一般方法和步骤。2. 把握依据需要选取不同的环境以找到

2、目标菌株的基本方法，学习分别纯化微生物的基本操作技术，进一步娴熟和把握微生物无菌操作技术，把握微生物培育方法以及接种方法。二、试验方案1. 试验原理培育基是人工的将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合养分基质，用以培育或分别各种微生物，因此，培育基质应当有微生物所能利用的养分成分（包括碳源，氮源，能源，无机盐，生长因素。）和水，依据微生物的种类和试验目的地不同，培育基也有不同的种类和配置。在土壤，水，空气及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们期望获得某一种微生物时，就必需从混杂的微生物类群中分理它，以得到只含有这一种微生物的纯培育，这种获得纯培育的方法称

3、为微生物的分别与纯化。为了获得某种微生物的纯培育，一般是依据该微生物对养分，酸碱度，氧等条件的要求不同，而供应它适宜的培育条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分别法等分别纯化微生物，直至得到纯菌株。2. 试验材料1) 培育基与试剂牛肉膏蛋白胨培育基配方：牛肉膏2.0g，蛋白胨4.0g，氢氧化钠2.0g，琼脂68g，水400mL。高氏一号培育基配方：可溶性淀粉4g，硝酸钾0.4g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，硫酸亚铁0.004g，琼脂68g，水400mL。马铃薯蔗糖培育

4、基配方：马铃薯80g，蔗糖8g，琼脂68g，水400mL。马铃薯葡萄糖培育基配方：马铃薯80g，葡萄糖8g，琼脂68g，水400mL。2) 仪器以及其他用品高压灭菌彩。高压灭菌锅，超净工作台，培育皿，移液器，250毫升锥形瓶250毫升烧杯。均玻璃珠，接种环，就金丹，显微镜，称量纸等。3. 试验方法1) 试验流程图培育基的制备灭菌微生物的分别土壤取样2) 试验步骤A. 土壤取样广工正门对面山坡，即取即用。B. 培育基的配制C. 灭菌将配制好的培育基，用报纸包扎好的培育皿，用橡胶塞封好的盛有9mL无菌水的试管，枪头盒装有45mL蒸馏水与玻璃珠的锥形瓶，玻璃珠放到高压灭菌锅进行高温蒸汽灭菌。D. 微

5、生物的分别a) 倒平板 将牛肉膏蛋白胨培育基，高氏一号琼脂培育基，马铃薯蔗糖琼脂培育基，马铃薯葡萄糖琼脂培育基溶化。待冷却至55至60时，在高氏一号培育基中加入1mL的0.5%重铬酸钾，在马铃薯蔗糖培育基中加入1mL的1%的链霉素，然后分别倒平板。b) 制备土壤稀释液 称取土样5g，放入盛有45mL无菌水并带有玻璃珠的烧瓶中。震荡摇摆约二格外钟，使土样与水充分混合，将菌分散，配制成10-1土壤溶液，用一支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤悬液注入盛有无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀，然后再用一支无菌吸管从今试管中吸取1mL土壤悬液注入另一盛有9mL无菌水的试管中，以此类推制成10-2，10-

6、3，10-4,10-5,10-6各种稀释度的土壤溶液。c) 分别微生物操作步骤：u 分别细菌i. 涂布 将牛肉膏蛋白胨两个平板底面分别用记号笔写上10-5和10-6两种稀释度，然后用两支1mL无菌吸管分别由10-5和10-6两管土壤稀释液中各吸取200uL对号放入已写好稀释度的平板中，加入八个灭菌的玻璃珠轻轻晃动，涂布均匀，然后将玻璃珠倒出。ii. 培育 倒置于37温室中培育12天u 分别放线菌i. 涂布 将高氏一号两个平板底面分别用记号笔写上10-3和10-4两种稀释度，然后用两支1mL无菌吸管分别由10-35和10-4两管土壤稀释液中各吸取200uL对号放入已写好稀释度的平板中，加入八个灭

7、菌的玻璃珠轻轻晃动，涂布均匀，然后将玻璃珠倒出。ii. 培育 倒置于37温室中培育35天u 分别酵母菌与霉菌(如图1)i. 涂布 各取两个葡萄糖与蔗糖平板底面各自用记号笔写上葡10-4、葡10-5和蔗10-4和蔗10-5两种稀释度，然后用1mL无菌吸管分别由10-4和10-5两管土壤稀释液中各吸取200uL对号放入已写好稀释度的平板中，加入八个灭菌的玻璃珠轻轻晃动，涂布均匀，然后将玻璃珠倒出。ii. 培育 倒置于37温室中培育35天E. 挑菌划线分别 使用接种环从待纯化的菌落中蘸取少量菌种，细菌接种在牛肉膏蛋白胨培育基上面，霉菌和酵母菌接种在马铃薯葡萄糖琼脂培育基与马铃薯蔗糖琼脂培育基上、放线

8、菌接种在高氏一号培育基上进行划线分别.F. 保存菌种图1.分别微生物流程示意图三、试验结果在你所试验的四种培育基平板上，长出的菌落分属于那个类群？简述它们的菌落形态特征，并将菌落形态特征填入表1。答：高氏一号培育基上的菌落分属于放线菌，其菌落形态特征菌落背面有同心圆形纹路，菌落较小。马铃薯葡萄糖培育基和马铃薯蔗糖培育基上的菌落是霉菌和酵母菌，其菌落形态特征：酵母菌：菌落为淡黄色，光滑，半透亮，比细菌菌落大。霉菌：菌落大型，肉眼可见很多毛状物。牛肉膏蛋白胨培育基上的菌落为细菌，其菌落形态为较小的圆形菌落，颗粒状。表1.菌落特征表 图1.纯化的细菌 图2. 纯化的放线菌 图3. 纯化的酵母菌 图4

9、. 纯化的霉菌四、问题与争辩1. 如何确定平板上某单个菌落是否为纯培育？请写出试验的主要步骤。答：观看菌落形态 一个平板上的单个菌落形态全都，基本可以确定是纯培育。革兰氏染色法测定 使用接种环从该菌落中蘸取少量菌种，然后进行革兰氏染色，显微镜下观看是否为纯菌。划线分别 使用接种环从该菌落中蘸取少量菌种，针对不同的细菌接种在不同的培育基上进行划线分别。如，细菌接种在牛肉膏蛋白胨培育基上面，霉菌和酵母菌接种在马铃薯葡萄糖琼脂培育基与马铃薯蔗糖琼脂培育基上、放线菌接种在高氏一号培育基上进行划线分别。然后放在适宜的条件下进行培育，看是否消灭杂菌，若没有，则确定为纯培育。2. 假如要分别得到酵母菌，在什

10、么地方取样品为宜？并说明理由。答：酵母是单细胞微生物，它属于高等微生物的真菌类，简洁生长，空气中、土壤中、水中、动物体内都存在酵母。有氧气或者无氧气都能生存。要分别得到酵母菌，则应选择酵母菌含量较多而其他菌种较少的样品，虽然酵母菌在自然界分布广泛，但主要还是生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中。而腐烂的水果酵母菌的含量是比较多的，因此可以考虑从腐烂的水果中取样，如腐烂的葡萄、苹果。酵母在有氧和无氧环境下都能生存，属于兼性厌氧菌，要获得纯度比较高的酵母，还可以从酒糟里猎取。五、心得体会把握依据需要选取不同的环境以找到目标菌株的基本方法，学习分别纯化微生物的基本操作技术，进一步娴熟和把握微生物无菌操作技术，把握微生物培育方法以及接种方法。之前的微生物试验就有配制过培育基，而本次试验，让我对培育基的配制学问有了更大的提升，对培育基的配制原理有了更深的了解。通过对微生物培育基的配制，还让我把握了配制培育基的一般方法和步骤。本次试验的培育基，其作用是起到选择培育的目的，依据需要选取不同的环境可以挂念我们找到目标菌株。试验过程中，我还学会来分别纯化微生物