2细胞培养实验

1、l 上海交通大学医学院上海交通大学医学院l 瑞金临床医学院瑞金临床医学院l 洪秀华教授洪秀华教授 l 从生物体内取出组织或细胞，在体从生物体内取出组织或细胞，在体外外(in vitro)(in vitro)模拟体内生理环境，在无模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，对这菌、适当温度和一定营养条件下，对这些组织或细胞进行孵育培养，使之保持些组织或细胞进行孵育培养，使之保持一定的结构和功能，以便于我们观察研一定的结构和功能，以便于我们观察研究，这种方法就是细胞培养（究，这种方法就是细胞培养（cell cell cultureculture）。有时细胞培养也称为组织培）。有时细胞培养也

2、称为组织培养（养（tissue culturetissue culture），二者可作为同），二者可作为同义语使用。义语使用。l细胞培养的工作始于细胞培养的工作始于2020世纪初目前广泛世纪初目前广泛应用于生物学、医学的各个领域，并且应用于生物学、医学的各个领域，并且是各种细胞工程技术的基础。哈里森是各种细胞工程技术的基础。哈里森（ HarrisonHarrison，19071907），因此被称为），因此被称为“组织培养之父组织培养之父”l（一）培养细胞的类型及其特点（一）培养细胞的类型及其特点l体外培养细胞大多培养在瓶皿等容器中，体外培养细胞大多培养在瓶皿等容器中，根据它们是否能贴附在支持物

3、上生长的根据它们是否能贴附在支持物上生长的特性，可分为贴附型和悬浮型两大类。特性，可分为贴附型和悬浮型两大类。l 大多数培养细胞均为贴附型，它大多数培养细胞均为贴附型，它们必须贴附在支持物表面生长，这类们必须贴附在支持物表面生长，这类细胞在体内时各自具有其特殊的形态，细胞在体内时各自具有其特殊的形态，但在体外培养时贴附于支持物后形态但在体外培养时贴附于支持物后形态上表现单一化而失去体内原有的某些上表现单一化而失去体内原有的某些特征，多呈上皮样或成纤维细胞样。特征，多呈上皮样或成纤维细胞样。l贴附细胞型贴附细胞型MRC-5成纤维细胞成纤维细胞 贴附型细胞正常猴肾单层上皮细胞贴附型细胞正常猴肾单层

4、上皮细胞l接触抑制：接触抑制：正常贴附型细胞具有接触抑正常贴附型细胞具有接触抑制的特性，细胞相互接触后可抑制细胞制的特性，细胞相互接触后可抑制细胞的运动，因此细胞不会相互重叠于其上的运动，因此细胞不会相互重叠于其上面生长。面生长。l密度抑制：密度抑制：细胞生长、汇合成片后，虽细胞生长、汇合成片后，虽发生接触抑制，但只要营养充分，仍可发生接触抑制，但只要营养充分，仍可增殖分裂，但当细胞数量达到一定密度增殖分裂，但当细胞数量达到一定密度后，由于营养的枯竭和代谢物的影响，后，由于营养的枯竭和代谢物的影响，细胞分裂停止，称为密度抑制。细胞分裂停止，称为密度抑制。l肿瘤细胞的接触抑制及密度抑肿瘤细胞的接

5、触抑制及密度抑制往往减弱或消失，因此细胞制往往减弱或消失，因此细胞可向三维空间发展，导致细胞可向三维空间发展，导致细胞堆积，并可生长至较高的终末堆积，并可生长至较高的终末细胞密度。细胞密度。l少数细胞在培养时不贴附于支持物上，少数细胞在培养时不贴附于支持物上，而以悬浮状态生长，包括一些取自血、而以悬浮状态生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞，以及一些肿瘤细胞。胞，以及一些肿瘤细胞。l 细胞悬浮生长时可以呈单个细胞或细小细胞悬浮生长时可以呈单个细胞或细小的细胞团，胞体为圆形。的细胞团，胞体为圆形。l其优点是在培养液中生长，生存空间大，其优点

6、是在培养液中生长，生存空间大，允许长时间生长，便于大量繁殖。允许长时间生长，便于大量繁殖。l培养细胞的生命期培养细胞的生命期l 培养细胞的生命期（培养细胞的生命期（life span）指的）指的是细胞在培养中持续增殖和生长的时间，是细胞在培养中持续增殖和生长的时间，一般可分为原代培养期、传代期和衰退一般可分为原代培养期、传代期和衰退期。从体内取出细胞接种培养到第一次期。从体内取出细胞接种培养到第一次传代叫原代培养，一般持续传代叫原代培养，一般持续1-4周。周。l 原代细胞一经传代后便称为细胞系原代细胞一经传代后便称为细胞系（cell line），进入传代期，此期在全），进入传代期，此期在全生命

7、期中持续时间最长，细胞增殖旺盛，生命期中持续时间最长，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体的核型。一般情况下可并能维持二倍体的核型。一般情况下可传代传代10-50次，随后细胞增殖缓慢以至次，随后细胞增殖缓慢以至完全停止，细胞进入衰退期，最后死亡。完全停止，细胞进入衰退期，最后死亡。l 肿瘤细胞系可无限增殖而无衰肿瘤细胞系可无限增殖而无衰退期，正常细胞系也可在传代期退期，正常细胞系也可在传代期末期或衰退期发生自发转化，细末期或衰退期发生自发转化，细胞获得永生性即永久增殖的能力，胞获得永生性即永久增殖的能力，称为无限细胞系或连续细胞系。称为无限细胞系或连续细胞系。l 培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或培养细

8、胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间相对孤立，营养是有其它容器，生存空间相对孤立，营养是有限的。当细胞增殖至一定密度后，则需分限的。当细胞增殖至一定密度后，则需分离出一部分细胞接种到其他容器，并及时离出一部分细胞接种到其他容器，并及时更新培养液，否则将影响细胞的继续生存，更新培养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫这一过程叫传代传代（passage 或或subculture）。）。l 从细胞接种到下一次传代再培养的从细胞接种到下一次传代再培养的一段时间叫一代。需要注意的是一段时间叫一代。需要注意的是细胞培细胞培养一代养一代与与细胞倍增细胞倍增（doubling）的概念）的概念是不同

9、的，细胞倍增指的是细胞数增加是不同的，细胞倍增指的是细胞数增加一倍。一般地，细胞培养一代的过程中，一倍。一般地，细胞培养一代的过程中，细胞可倍增细胞可倍增2-6次。次。l细胞传一代以后，细胞群体一般要经过细胞传一代以后，细胞群体一般要经过潜伏期潜伏期、指数增长期指数增长期与与平台期平台期三个阶段。三个阶段。l以贴附型细胞为例说明如下：细胞接种以贴附型细胞为例说明如下：细胞接种后呈悬浮状态，在后呈悬浮状态，在05-4 h内贴附于支持内贴附于支持物，进入物，进入潜伏期潜伏期，此期细胞无增殖发生，此期细胞无增殖发生，原代细胞持续约原代细胞持续约24-96 h，而肿瘤细胞或，而肿瘤细胞或无限传代细胞仅

10、需无限传代细胞仅需6-24 h。l随着分裂相细胞的出现并逐渐增多，细随着分裂相细胞的出现并逐渐增多，细胞群体进入指数增长期，此期又称胞群体进入指数增长期，此期又称对数对数期期，细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最，细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，佳，适于进行实验研究适于进行实验研究；此期时间长短；此期时间长短因细胞本身特性及接种密度、因细胞本身特性及接种密度、血清浓度血清浓度而不完全相同，一般可持续而不完全相同，一般可持续3-5天。天。l随着细胞数量的逐渐增多，细胞相互接随着细胞数量的逐渐增多，细胞相互接触汇合成片，因接触抑制及密度抑制细触汇合成片，因接触抑制及密度抑制细胞停止分裂繁殖，进入胞停止

11、分裂繁殖，进入平台期平台期，细胞数，细胞数目不再增加，但仍维持一定时间的活力，目不再增加，但仍维持一定时间的活力，此时应此时应及时及时分离传代，否则细胞将因中分离传代，否则细胞将因中毒而发生改变甚至死亡。悬浮型细胞一毒而发生改变甚至死亡。悬浮型细胞一般没有潜伏期，接种并添加新鲜培养液般没有潜伏期，接种并添加新鲜培养液后即可迅速进入指数增长期。后即可迅速进入指数增长期。l 培养细胞需要特定的培养基和培养细胞需要特定的培养基和培养设备。培养细胞在培养器皿中培养设备。培养细胞在培养器皿中生长，浸浴于生长，浸浴于培养液培养液，并需要特有，并需要特有的的环境环境，包括一定的，包括一定的温度、湿度和温度、

12、湿度和气体成分。气体成分。培养细胞的生存条件培养细胞的生存条件培养皿培养皿或培养瓶或培养瓶 温度、湿温度、湿度和气体度和气体由由CO2恒温孵恒温孵育箱提供育箱提供 生长生长培养液培养液1020的血清的血清 维持维持培养液培养液25的血清的血清 营养物质营养物质糖、糖、氨基酸、维生氨基酸、维生素、无机离子、素、无机离子、微量元素等微量元素等 l培养细胞所需营养物质与体内细胞相同，培养细胞所需营养物质与体内细胞相同，包括糖、氨基酸、维生素、无机离子、微包括糖、氨基酸、维生素、无机离子、微量元素等。细胞在体外生存于含各种营养量元素等。细胞在体外生存于含各种营养成分的培养基中。成分的培养基中。l来自于

13、动物体液和分离组织提取的天然培来自于动物体液和分离组织提取的天然培养基有血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液养基有血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等，但制作过程复杂，批间差异大，已逐等，但制作过程复杂，批间差异大，已逐渐被渐被合成培养基合成培养基取代。取代。l按其物质状态，分半固体培养基（如软按其物质状态，分半固体培养基（如软琼脂培养基）和液体培养基两类，其中琼脂培养基）和液体培养基两类，其中液体培养基（即培养液）使用最为广泛。液体培养基（即培养液）使用最为广泛。目前市场上有多种配制好的细胞培养液目前市场上有多种配制好的细胞培养液出售，但价格较昂贵。实际工作中多用出售，但价格较昂贵。实际工作中多用市售

14、培养基干粉来配制培养液。市售培养基干粉来配制培养液。l配制培养液时，尚需配制培养液时，尚需加一定量的动物血清加一定量的动物血清（胎（胎牛或小牛血清）。配制时根据添加血清量的多牛或小牛血清）。配制时根据添加血清量的多少，构成作用不同的培养液，用于不同细胞和少，构成作用不同的培养液，用于不同细胞和不同研究目的。一般情况下需添加不同研究目的。一般情况下需添加10 20的血清，以维持细胞较快的生长增殖速度，的血清，以维持细胞较快的生长增殖速度，称为称为生长培养液生长培养液；为维持细胞缓慢生长或不死，；为维持细胞缓慢生长或不死，加加2 5血清含量即可，称为血清含量即可，称为维持培养液维持培养液。l此外为

15、防止污染，培养液中尚需此外为防止污染，培养液中尚需加一定量的抗加一定量的抗生素生素（多用青霉素（多用青霉素100单位单位/ml和链霉素和链霉素100g/ml）。）。1、MEM(minimum essential media)l含有含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺，种必需氨基酸、谷氨酰胺，8种维生素及必要的无机盐，成种维生素及必要的无机盐，成分简单，易于分简单，易于添加某种特殊成分添加某种特殊成分适应某些特殊细胞的培养。适应某些特殊细胞的培养。2、DMEM（ Dulbeccos modified Eagle medium)l是由是由Dulbecco等人在等人在MEM培养基的基础培养基的基础上研制而

16、成。相比上研制而成。相比MEM增加了各成分的增加了各成分的用量。分用量。分高糖型和低糖型高糖型和低糖型，各自葡萄糖，各自葡萄糖含量为含量为4500g/L、1000g/L。高糖型有利于。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适合于生长细胞停泊于一个位置生长，适合于生长较快、附着较困难的肿瘤细胞。较快、附着较困难的肿瘤细胞。3、IMDM（Iscoves modified Dulbeccos medium）l含有含有42种成分，较种成分，较DMEM增加了许增加了许多非必须氨基酸及一些维生素，增多非必须氨基酸及一些维生素，增加了加了HEPES，葡萄糖含量为高糖型。，葡萄糖含量为高糖型。适合于细胞密度较低

17、、细胞生长较适合于细胞密度较低、细胞生长较困难的情况，如白细胞融合之后杂困难的情况，如白细胞融合之后杂交细胞的筛选培养，交细胞的筛选培养，DNA转染后转转染后转化细胞的筛选培养。化细胞的筛选培养。4、RPMI1640l其成分较为简单，适合于许多种类其成分较为简单，适合于许多种类细胞的生长，如肿瘤细胞或正常细细胞的生长，如肿瘤细胞或正常细胞、原代培养或传代培养的细胞。胞、原代培养或传代培养的细胞。RPMI1640是目前应用最为广泛的培是目前应用最为广泛的培养基之一养基之一。5、HamF10、HamG12l特点是在配方中加入了一些微量元特点是在配方中加入了一些微量元素和无机离子，可以在加入很少血素

18、和无机离子，可以在加入很少血清的情况下使用，特别适合于进行清的情况下使用，特别适合于进行单细胞分离培养。单细胞分离培养。 HamG12培养基培养基也是无血清培养基中常用的基础培也是无血清培养基中常用的基础培养基养基7、McCoys 5AlMcCoys 5A培养基是培养基是McCoy T.A等等人在人在1959年研制成功的，是一种专年研制成功的，是一种专门为肉瘤细胞设计的培养基，后来门为肉瘤细胞设计的培养基，后来发现它特别适合于原代细胞培养，发现它特别适合于原代细胞培养，适合于较难培养的细胞的生长。适合于较难培养的细胞的生长。l没有固定标准，以下为参考：没有固定标准，以下为参考：1、建立某种细胞

19、株所用的培养基应该是培、建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。着可以参考文养这种细胞首选的培养基。着可以参考文献，或在购买细胞株时咨询。献，或在购买细胞株时咨询。2、本实验室惯用的培养基不妨试一试，许、本实验室惯用的培养基不妨试一试，许多培养基可以适合于多种细胞。多培养基可以适合于多种细胞。3、根据细胞株的特点、实验的需要来选择、根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选择培养基。如小鼠细胞株多选择RPMI1640；进行细胞杂交、基因转移实验，可选择进行细胞杂交、基因转移实验，可选择IMDM。4、用多种培养基培养目的细胞，观察其生、用多种培养基培养目的细胞，

20、观察其生长状态，可用生长曲线、集落形成率等长状态，可用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。基，这是最客观的方法，但比较繁琐。l无血清培养基即不需要添加血清就可维无血清培养基即不需要添加血清就可维持细胞在体外生长较长时间生长繁殖的持细胞在体外生长较长时间生长繁殖的合成培养基。合成培养基。l用于观察一种生长因子对某种细胞的作用于观察一种生长因子对某种细胞的作用（这时需要排除其他生长因子的干扰，用（这时需要排除其他生长因子的干扰，而血清中可能含有各种生长因子）；或而血清中可能含有各种生长因子）；或需要测定某种细胞

21、在培养过程中分泌某需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质的能力；或大规模的培养某种细种物质的能力；或大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物的时候。胞，以获得它们的分泌产物的时候。l无血清培养基分为无血清培养基分为基础培养液基础培养液和和添加组分添加组分两大部两大部分。基础培养液以分。基础培养液以HamF12和和DMEM最为常用，最为常用，一般两者以一般两者以1:1混合。混合。l添加组分包括：添加组分包括： 1、促贴壁物质促贴壁物质： 一般是细胞外基质，如纤连蛋白（一般是细胞外基质，如纤连蛋白（FN）、层粘）、层粘连蛋白（连蛋白（LN）等。它们还是重要的分裂素以及）等。它们还是重要的分裂素

22、以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要的作用。殖和分化，起着重要的作用。2、促生长因子及激素促生长因子及激素l如表皮生长因子（如表皮生长因子（EGF）、神经生长因子）、神经生长因子（NGF）、内皮细胞生长因子（）、内皮细胞生长因子（ECGF）等。）等。3、酶抑制剂酶抑制剂l终止胰酶的消化作用，达到保护细胞的目的。终止胰酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶抑制剂。最常用的是大豆胰酶抑制剂。4、转铁蛋白和牛血清白蛋白转铁蛋白和牛血清白蛋白5、微量元素微量元素 硒最为常见。硒最为常见。l1、NaHCO3溶液溶液l2、

23、HEPES液液l 是一种弱酸是一种弱酸羟乙基哌嗪乙硫磺酸。羟乙基哌嗪乙硫磺酸。HEPES对细胞无毒性，可防止对细胞无毒性，可防止pH值迅速值迅速变动变动l常用的是青链霉素，俗称常用的是青链霉素，俗称“双抗溶双抗溶液液”l青霉素使用的终浓度为青霉素使用的终浓度为0.1g/L。一。一般配成般配成100倍浓缩液，可用倍浓缩液，可用PBS或或培养基配制。培养基配制。l 谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺容易降解，所以都是由于谷氨酰胺容易降解，所以都是使用前添加。谷氨酰胺使用终浓度使用前添加。谷氨酰胺使用终浓度

24、为为0.002mol/L。一般配制为。一般配制为100倍浓倍浓缩液。缩液。1、培养器皿、培养器皿2、培养环境：、培养环境：CO2恒温孵育箱恒温孵育箱lCO2恒温孵育箱是目前普遍应用的细胞培养设恒温孵育箱是目前普遍应用的细胞培养设备，备，l箱内应置水槽以维持箱内温度、湿度和避免培箱内应置水槽以维持箱内温度、湿度和避免培养液蒸发，养液蒸发，l蒸馏水需无菌水并应加无腐蚀性和无挥发性的蒸馏水需无菌水并应加无腐蚀性和无挥发性的防腐剂以防生霉。应定期对箱内进行消毒。防腐剂以防生霉。应定期对箱内进行消毒。l另外，细胞培养过程中进行换液、传代等工作另外，细胞培养过程中进行换液、传代等工作时需在无菌工作台上进行

25、。时需在无菌工作台上进行。l二氧化碳培养箱二氧化碳培养箱（培养箱）提供箱（培养箱）提供箱内一定浓度内一定浓度二氧化二氧化碳气体和相对湿度碳气体和相对湿度，创造了细胞与微生创造了细胞与微生物正常生命活动的物正常生命活动的环境条件，使之在环境条件，使之在脱离复杂机体内环脱离复杂机体内环境的直接影响，在境的直接影响，在体外能生长体外能生长瀪瀪殖。殖。 l培养箱的结构培养箱的结构l以水套式以水套式CO2CO2培养箱培养箱为例，培养箱基本有为例，培养箱基本有三壁结构三壁结构箱体、控制箱体、控制中心（包括键盘、显中心（包括键盘、显示器、指示器等）、示器、指示器等）、CO2/O2CO2/O2传感器、增湿传感

26、器、增湿盘等。盘等。l可分为单可分为单 双内舱水套培养箱两种。双内舱水套培养箱两种。l箱内传感器箱内传感器有热传导有热传导(T/C(T/C）和红外（）和红外（IRIR）传）传感器两种。感器两种。l水套注入口水套注入口( (用于注满水用于注满水) )。 水套排水口水套排水口（在（在水套注满过程中或热胀冷缩时让空气逸出，水套注满过程中或热胀冷缩时让空气逸出，不能覆盖）。不能覆盖）。l水套排气口水套排气口（用于迅速排空水套）。（用于迅速排空水套）。l加热式内门（为了保持箱内干燥）。加热式内门（为了保持箱内干燥）。l箱内气体取样口箱内气体取样口（可使用（可使用FyriteFyrite或类似工具或类似工

27、具提取箱内样本的含量）。提取箱内样本的含量）。l1细胞分离和原代培养细胞分离和原代培养l 原代培养也叫初代培养，指从供原代培养也叫初代培养，指从供体取得组织，分离得到所需细胞体取得组织，分离得到所需细胞后接种于培养瓶，进行首次培养。后接种于培养瓶，进行首次培养。细胞分离细胞分离原代（初代）培养原代（初代）培养消化法传代消化法传代 组织块剪切组织块剪切,消化消化法使组织进一步法使组织进一步分散分散 制备获得细胞悬获得细胞悬液计数后，加入液计数后，加入营养液稀释成一营养液稀释成一定浓度细胞悬液定浓度细胞悬液孵箱中进行培养孵箱中进行培养 细胞悬液细胞悬液计数后，计数后，加入营养加入营养液稀释成液稀释

28、成一定浓度一定浓度细胞悬液细胞悬液孵箱中进孵箱中进行培养行培养将原代细胞培将原代细胞培养物用胰酶和养物用胰酶和EDTA消化处理消化处理后，收集后，收集洗涤，洗涤，再分装至再分装至 含有含有新鲜营养液的新鲜营养液的培养瓶中继续培养瓶中继续培养培养 l 培养材料为血液、羊水、胸水和腹培养材料为血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液时，可采用离心法分离。水等细胞悬液时，可采用离心法分离。一般用一般用5001000rpm的低转速，时间约的低转速，时间约510min。如果一次离心样品量很多，。如果一次离心样品量很多，时间可适当延长，但离心速度过大、时时间可适当延长，但离心速度过大、时间过长，会挤压细胞造成损伤

29、甚至死亡。间过长，会挤压细胞造成损伤甚至死亡。l 培养材料为组织块时，首先要把组培养材料为组织块时，首先要把组织块剪切至尽量小，然后用消化法使组织块剪切至尽量小，然后用消化法使组织进一步分散，以获得细胞悬液。对细织进一步分散，以获得细胞悬液。对细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等可用胰蛋白酶消化；对于纤维肝、肾等可用胰蛋白酶消化；对于纤维性组织和较硬的上皮组织、癌组织等可性组织和较硬的上皮组织、癌组织等可使用胶原酶消化。使用胶原酶消化。l胰酶（胰酶（Trypsin）：）：0.1%0.25%，用，用D-HanKS液配制，最佳液配制，最佳pH89lEDTA

30、 ：0.02%，作用于细胞间连接尤其对，作用于细胞间连接尤其对贴壁的细胞适用贴壁的细胞适用l胶原酶（胶原酶（Collagenase）：）：0.10.3mg/L(20万万u/L)， pH6.5，Ca2+，Mg2+不抑制其活性，不抑制其活性，作用于胶原组织，适用于上皮类原代细胞。作用于胶原组织，适用于上皮类原代细胞。l细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代；进行一次分培养瓶的过程称之为传代；进行一次分离培养称之为传一代。离培养称之为传一代。 培养细胞传代根培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。据不同细胞采取不同的方法。l贴壁生长的细胞多用消化法

31、传代，传代贴壁生长的细胞多用消化法传代，传代中常用到二乙烯四乙酸二钠（中常用到二乙烯四乙酸二钠（EDTA）。）。EDTA能从组织生存环境中吸取能从组织生存环境中吸取Ca2+、Mg2+，这些离子是维持组织完整的重要，这些离子是维持组织完整的重要因素。但因素。但EDTA单独使用不能使细胞完单独使用不能使细胞完全分散，因而常与胰蛋白酶按不同比例全分散，因而常与胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果较好。混合使用，效果较好。l吸除或倒掉瓶内旧培养液，向瓶内加入少量约吸除或倒掉瓶内旧培养液，向瓶内加入少量约12ml消化液（一般含胰蛋白酶、消化液（一般含胰蛋白酶、EDTA），），轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有

32、细胞表面；轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面；l然后在然后在37环境下孵育环境下孵育1-3min，把培养瓶放置，把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即倒掉消化液，加入增大后，应立即倒掉消化液，加入Hanks液冲液冲洗一次以终止消化；洗一次以终止消化；l然后加入少许培养液，用弯头吸管吸取瓶内培然后加入少许培养液，用弯头吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，使之脱落形成细胞养液，反复吹打瓶壁细胞，使之脱落形成细胞悬液，以悬液，以1：2或或1：3的比例接种在新的培养瓶的比例接种在新的培养瓶内。内。l悬浮生长的细胞可直接添加新鲜

33、悬浮生长的细胞可直接添加新鲜培养液，或离心收集，接种到新培养液，或离心收集，接种到新培养瓶。培养瓶。l通常在通常在45天需传代，一般以天需传代，一般以1:4稀释传代。稀释传代。l培养细胞在传代中性质易发生改变培养细胞在传代中性质易发生改变, 有支有支原体污染的危险。研究工作也要求细胞原体污染的危险。研究工作也要求细胞株的代数应维持在一定期限内。解决这株的代数应维持在一定期限内。解决这些困难的方法就是将细胞冻存，需要的些困难的方法就是将细胞冻存，需要的时候再行复苏。细胞冻存在液氮中，从时候再行复苏。细胞冻存在液氮中，从理论上讲贮存时间是无限的理论上讲贮存时间是无限的。l在不加保护条件下直接冻存细

34、胞时，细在不加保护条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成胞内和外环境中的水会形成结晶结晶，能导，能导致细胞内发生一系列变化而引起细胞死致细胞内发生一系列变化而引起细胞死亡。亡。l如向培养基中加入如向培养基中加入保护剂保护剂甘油或二甲基甘油或二甲基亚砜（亚砜（DMSO），可使冰点降低，在缓），可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。结前透出细胞外。l溶解细胞时，速度要快，使之迅速通溶解细胞时，速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的过细胞最易受损的50后，细后，细胞仍能生长，活力不受任何损害。胞仍能生长，活力不受任何损害。l细胞

35、冻存与复苏的原则是细胞冻存与复苏的原则是“慢冻快慢冻快融融”。冻存时选用对数生长期细胞，冻存时选用对数生长期细胞，用常规方法收集细胞。在液氮中可长用常规方法收集细胞。在液氮中可长期保存期保存。l冻存细胞复苏时，将冻存于液氮中冻存细胞复苏时，将冻存于液氮中的冻存管取出，迅速放入的冻存管取出，迅速放入3740水浴中使其在水浴中使其在1min内融化。在无菌内融化。在无菌条件下打开冻存管，取出细胞悬液条件下打开冻存管，取出细胞悬液至离心管中，补加至离心管中，补加10ml培养液，培养液，5001000rpm低速离心低速离心5min，去上，去上清，加入新鲜培养液适量，转入培清，加入新鲜培养液适量，转入培养

36、瓶中置养瓶中置37培养。培养。l细胞培养过程中操作不当时，易引发微细胞培养过程中操作不当时，易引发微生物污染。微生物污染一旦明确，多数生物污染。微生物污染一旦明确，多数将无法救治。为了防止污染的蔓延，还将无法救治。为了防止污染的蔓延，还应及时丢弃污染细胞。应及时丢弃污染细胞。l（1）霉菌和细菌污染）霉菌和细菌污染 霉菌和细菌繁殖霉菌和细菌繁殖迅速，能在很短的时间内压制细胞生长迅速，能在很短的时间内压制细胞生长或排出有毒物质杀灭细胞，因此霉菌和或排出有毒物质杀灭细胞，因此霉菌和细菌污染较易发现。细菌污染较易发现。l霉菌污染后多在培养液中形成白色或浅霉菌污染后多在培养液中形成白色或浅黄色飘浮物，一

37、般肉眼可见，较易被发黄色飘浮物，一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不混浊，倒置显微现，短期内培养液多不混浊，倒置显微镜下可见于细胞之间有纵横交错穿行的镜下可见于细胞之间有纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝，并悬浮飘荡丝状、管状及树枝状菌丝，并悬浮飘荡在培养液中；很多菌丝在高倍镜下可见在培养液中；很多菌丝在高倍镜下可见到有链状排列的菌珠；念珠菌或酵母菌到有链状排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长。生长。l细菌污染后培养液短期内颜色变黄，细菌污染后培养液短期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明表明有大量酸性物质产生，出现明

38、显混浊现象；有时静置的培养瓶液显混浊现象；有时静置的培养瓶液体初看不混，但稍加震荡，就有很体初看不混，但稍加震荡，就有很多混浊物漂起；倒置显微镜下观察，多混浊物漂起；倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量细小的圆球状可见培养液中有大量细小的圆球状颗粒飘浮，有时在细胞表面和周围颗粒飘浮，有时在细胞表面和周围有大量细菌存在，细胞生长停止并有大量细菌存在，细胞生长停止并有中毒表现有中毒表现。l支原体污染是一个常见而又棘手的问题。支原支原体污染是一个常见而又棘手的问题。支原体是一种大小介于细菌和病毒之间（最小直径体是一种大小介于细菌和病毒之间（最小直径0.2m）并独立生活的微生物，因此可通过滤菌）并独立

39、生活的微生物，因此可通过滤菌器，支原体对热敏感但对一般抗生素不敏感。器，支原体对热敏感但对一般抗生素不敏感。支原体污染细胞后，培养液可不发生混浊，多支原体污染细胞后，培养液可不发生混浊，多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解，因此易被忽视。化也可由于传代、换液而缓解，因此易被忽视。实际上细胞已受到各方面潜在的影响，如细胞实际上细胞已受到各方面潜在的影响，如细胞变性、变性、DNA合成受影响等。个别严重者，可致合成受影响等。个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落。细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落。l相差显微镜检测相差显

40、微镜检测 将细胞接种于事先放置于将细胞接种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油后取出，用相差油镜观察，支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面镜观察，支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间，类似布朗运动。和细胞之间，类似布朗运动。l荧光染色法荧光染色法 荧光染色用能与荧光染色用能与DNA特异性结特异性结合的荧光染料合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含，可使支原体内含有的有的DNA着色，据此可检测支原体。固定细胞着色，据此可检测支原体。固定细胞以以Hoechst 33258染色，然后置荧光显微镜下观染色，然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在

41、于细胞周围或附于细胞察。镜下支原体为散在于细胞周围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。膜表面的亮绿色小点。l电镜检测电镜检测 用扫描电镜方法简便快用扫描电镜方法简便快速，也可以利用透射电镜。速，也可以利用透射电镜。lDNA分子杂交检查或支原体培养分子杂交检查或支原体培养等方法等方法 检出率高，但方法较复杂检出率高，但方法较复杂。l 传代细胞带有潜伏病毒。传代细胞带有潜伏病毒。Hela-HPV18,HSV,逆转录病毒等以前病毒形逆转录病毒等以前病毒形式整合细胞式整合细胞DNA。可通过细胞直接观。可通过细胞直接观察（察（血细胞吸附、包涵体等血细胞吸附、包涵体等）、动物）、动物接种、异种组织培养物生长、电

42、镜观接种、异种组织培养物生长、电镜观察、免疫学方法及察、免疫学方法及PCR方法检查方法检查l防止污染，预防是关键防止污染，预防是关键1、器皿准备中的预防、器皿准备中的预防2、操作前的预防：超净工作台，培养皿，、操作前的预防：超净工作台，培养皿，培养液，操作者培养液，操作者3、操作过程中的预防：瓶口不能于工作台、操作过程中的预防：瓶口不能于工作台风向逆向；火焰烧灼灭菌，专管专用，风向逆向；火焰烧灼灭菌，专管专用，试管斜位，不要交谈，完毕后整理、清试管斜位，不要交谈，完毕后整理、清扫扫1、抗生素排除：联合用药，预防性应用比、抗生素排除：联合用药，预防性应用比污染后使用更好污染后使用更好2、加温除菌

43、：、加温除菌：41oC，510h3、动物接种、动物接种4、与、与共培养共培养l上皮组织上皮组织l内皮细胞内皮细胞血管内皮细胞、淋巴内皮血管内皮细胞、淋巴内皮细胞细胞l单层柱状上皮细胞单层柱状上皮细胞胃粘膜上皮细胞，胃粘膜上皮细胞，肠粘膜上皮细胞，假复层纤毛柱状上肠粘膜上皮细胞，假复层纤毛柱状上皮细胞皮细胞l复层上皮细胞复层上皮细胞表皮细胞，食管粘膜表皮细胞，食管粘膜上皮细胞上皮细胞l成纤维细胞成纤维细胞l 细胞：腹腔，肺泡，肥大细胞，细胞：腹腔，肺泡，肥大细胞，血细胞，淋巴细胞，软骨细胞，血细胞，淋巴细胞，软骨细胞，骨细胞骨细胞l脂肪细胞脂肪细胞l心肌细胞心肌细胞l平滑肌细胞平滑肌细胞l骨骼肌

44、细胞骨骼肌细胞l神经组织，神经元，神经胶质细神经组织，神经元，神经胶质细胞，少突胶质细胞，胞，少突胶质细胞，Schwann细胞细胞l脂肪细胞脂肪细胞l除此之外，尚有器官培养（胚除此之外，尚有器官培养（胚胎干、神经干、造血干、间光胎干、神经干、造血干、间光质干、表皮组织干、胰岛干细质干、表皮组织干、胰岛干细胞培养）等技术胞培养）等技术人脐血管内皮细胞（凋亡）人脐血管内皮细胞（凋亡）人脐血管内皮细胞人脐血管内皮细胞l生物体是一个高度统一的整体，而细胞生物学的生物体是一个高度统一的整体，而细胞生物学的主要对象是生物体内的各种细胞，很显然，在整主要对象是生物体内的各种细胞，很显然，在整体条件下研究单个

45、细胞或某一细胞群在体内（体条件下研究单个细胞或某一细胞群在体内（in vivo）的功能活动是非常困难的。）的功能活动是非常困难的。细胞培养的意细胞培养的意义义主要在于两点，其一是人工培养条件易于改变主要在于两点，其一是人工培养条件易于改变并能严格控制，便于研究各种因素对细胞的结构、并能严格控制，便于研究各种因素对细胞的结构、功能和各种生命活动规律的影响；其二是细胞在功能和各种生命活动规律的影响；其二是细胞在体外培养环境中可以长期存活和传代，可以比较体外培养环境中可以长期存活和传代，可以比较经济地、大量地提供在同一时期、条件相同、性经济地、大量地提供在同一时期、条件相同、性状相似的细胞作为实验样

46、本。因此，大量生物医状相似的细胞作为实验样本。因此，大量生物医学研究工作依赖于细胞培养，许多重要的发现都学研究工作依赖于细胞培养，许多重要的发现都基于培养细胞的工作。基于培养细胞的工作。l细胞培养技术也存在着一定局限性，主细胞培养技术也存在着一定局限性，主要是细胞离体以后失去与体内环境的密要是细胞离体以后失去与体内环境的密切联系，失去了神经体液的调节和不同切联系，失去了神经体液的调节和不同细胞间的相互作用，特定分化基因的表细胞间的相互作用，特定分化基因的表达减弱或停止，而进化中保守的细胞生达减弱或停止，而进化中保守的细胞生长和增殖活动却可维持，遂使体内外细长和增殖活动却可维持，遂使体内外细胞出

47、现了差异，这是应用细胞培养技术胞出现了差异，这是应用细胞培养技术应该注意的问题。应该注意的问题。l细胞培养技术除经典地用于细胞形态结构、功细胞培养技术除经典地用于细胞形态结构、功能和细胞活动研究以外，还成为近年发展起来能和细胞活动研究以外，还成为近年发展起来的细胞工程技术的基础，也就是说细胞培养技的细胞工程技术的基础，也就是说细胞培养技术重要应用就是各种细胞工程技术。因此在此术重要应用就是各种细胞工程技术。因此在此对这些相关技术作一简介。对这些相关技术作一简介。l一般地，一般地，细胞工程细胞工程指应用各种手段对细胞不同指应用各种手段对细胞不同结构层次结构层次(整体、细胞器、核、基因等整体、细胞

48、器、核、基因等)进行改进行改造，如进行细胞融合、核移植、基因转移等，造，如进行细胞融合、核移植、基因转移等，以获得具有特定生物学特性的细胞。以获得具有特定生物学特性的细胞。l在细胞自然生长情况下，或在其他人为添加因在细胞自然生长情况下，或在其他人为添加因素存在下，使同种细胞之间或不同种类细胞之素存在下，使同种细胞之间或不同种类细胞之间相互融合的过程，即为细胞融合（间相互融合的过程，即为细胞融合（cell fusion）。通过细胞融合，可将来源于不同细）。通过细胞融合，可将来源于不同细胞核的染色体结合到同一个核内，结果形成一胞核的染色体结合到同一个核内，结果形成一个合核体的杂种细胞。在实际工作中

49、常采用各个合核体的杂种细胞。在实际工作中常采用各种促融合手段，包括病毒类融合剂如仙台病毒、种促融合手段，包括病毒类融合剂如仙台病毒、化学融合剂如聚乙二醇（化学融合剂如聚乙二醇（PEG）及电激融合法）及电激融合法等。等。l在进行细胞融合反应和适当时间的培养在进行细胞融合反应和适当时间的培养后，需要通过一定方法对两种亲本细胞后，需要通过一定方法对两种亲本细胞融合产生的具有增殖能力的杂种细胞进融合产生的具有增殖能力的杂种细胞进行筛选。筛选方法主要包括药物抗性筛行筛选。筛选方法主要包括药物抗性筛选、营养缺陷筛选和温度敏感性筛选等。选、营养缺陷筛选和温度敏感性筛选等。l细胞融合最典型的应用是单克隆抗体技

50、术。细胞融合最典型的应用是单克隆抗体技术。1975年年Koehler和和Milstein将用绵羊红细胞免疫将用绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞和体外培养能长期繁殖的小鼠骨的小鼠脾细胞和体外培养能长期繁殖的小鼠骨髓瘤细胞融合，获得了具有两种亲本细胞特性髓瘤细胞融合，获得了具有两种亲本细胞特性的杂交细胞，即既能在培养条件下长期生长增的杂交细胞，即既能在培养条件下长期生长增殖，又能分泌特异的抗绵羊红细胞的抗体的殖，又能分泌特异的抗绵羊红细胞的抗体的B淋巴细胞杂交瘤。细胞融合技术的发展和骨髓淋巴细胞杂交瘤。细胞融合技术的发展和骨髓瘤细胞株的建成促成了瘤细胞株的建成促成了B细胞杂交瘤技术的建细胞杂交瘤技术的建

51、立和单克隆抗体技术的成功。立和单克隆抗体技术的成功。l细胞核移植细胞核移植（nuclear transfer）是指将）是指将一个双倍体的细胞核（可来自胚胎细胞一个双倍体的细胞核（可来自胚胎细胞或体细胞）移植到去核的成熟卵母细胞或体细胞）移植到去核的成熟卵母细胞或受精卵中。重组的卵细胞可以植入母或受精卵中。重组的卵细胞可以植入母体，并能发育为与供核细胞基因型相同体，并能发育为与供核细胞基因型相同的后代，因此又称为动物克隆技术。的后代，因此又称为动物克隆技术。1997年诞生的克隆羊年诞生的克隆羊“多利多利”就是体细就是体细胞核移植技术的产物。胞核移植技术的产物。l核移植技术首先是选取合适的受体去核

52、卵细胞核移植技术首先是选取合适的受体去核卵细胞和供体核。目前均以发育至减数分裂中期和供体核。目前均以发育至减数分裂中期II的的成熟卵母细胞为受体，供体核则可以采用胚胎成熟卵母细胞为受体，供体核则可以采用胚胎细胞、未分化的原始生殖细胞、胎儿细胞乃至细胞、未分化的原始生殖细胞、胎儿细胞乃至高度分化的成年动物细胞。核质融合一般是将高度分化的成年动物细胞。核质融合一般是将获得的核转移到已经人工去核的成熟卵母细胞获得的核转移到已经人工去核的成熟卵母细胞卵周隙后，施加微电流脉冲，使核质融合，形卵周隙后，施加微电流脉冲，使核质融合，形成一个重组卵。重组卵需经一定时间的体外培成一个重组卵。重组卵需经一定时间的体外培养，或放入中间受体动物输卵管内孵育，经过养，或放入中间受体动物输卵管内孵育，经过一段时间的培养，有的动物需形成桑椹胚或囊一段时间的培养，有的动物需形成桑椹胚或囊胚，再植入受体子宫里。胚，再植入受体子宫里。l基因转移指向受体细胞中导入外源基因，基因转移指向受体细胞中导入外源基因，是改造细胞遗传性状的常用手段。一般是改造细胞遗传性状的常用手段。一般情况下，能稳定接纳外