realtimePCR和RT-PCR详解及其区别要点

1、real-timePCR 技术的原理及应用摘要：一、实时荧光定量 PCRM 理（一）定义：在 PCR5 应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个 PCF0 程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。（二）实时原理 1、常规 PCRK 术： 对 PCFT 增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准一、实时荧光定量 PC 丽理（一）定义：在 PC 皈应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个 PCF0 程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。（二）实时原理1、常规 PCRK 术：对 PCFT 增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法

2、对扩增反应实时检测。2、实时定量 PC 敬术：利用荧光信号的变化实时检测 PCFT 增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过 Ct 值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量?通过 Ct 值和标准曲线对起始模板进行定量分析4、几个概念：(1)扩增曲线：每个循环进行一次荧光信号的收集(2)荧光阈值:荧光信号阈值荧光信号阈值(threshold)工工 前15个循环信号作为荧光本底信号baseline.既样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是315个循环的毅光信号的惊准储差的10倍 手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的黄光最高值,同时要尽量选择进入指

3、数期的最初阶段， 并且保证回归系数大于099 真正的信号:荧光信号超过域值(3)Ct 值:黄帮程测元件统壁标扩增循环数(Cycte，级坐标:荧光atftUUBftUUB。凿JWLLJWLLCt值的定义：PCR扩增过程中， 扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Ct值的特点工值的特点工相同模板进行9敬扩增，终点处产物量不恒定3织轴：黄光信号量C(f)valueCT 值的重现性:寸与Replicties横轴 mPCR反映循环数CycIeHumber-Ct值则极具重现性5、定量原理：理想的 PC 皈应：X=X0*2n非理想的 PCR5 应：X=Xo(1+Ex)n:扩增反应的循环次数X

4、:第 n 次循环后的产物量X0：初始模板量Ex:扩增效率5、标准曲线模板模板DNA量越多量越多, ,荧光达到域值的循环数越少荧光达到域值的循环数越少, ,即即Ct值越小值越小Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品出标准曲线，根据样品Ct值值, ,就可以计算出样品中所含的模板量就可以计算出样品中所含的模板量6、绝对定量1)确定未知样品的 C(t)值2)通过标准曲线由未知样品的 C(t)值推算出其初始量7、DNA 勺荧光标记:非特异性荧光标记：1、SYBRGreen特异性荧光标记:、工四Man，3、Mo

5、lecularBeacon二、实时荧光定量 PCR 勺几种方法介绍方法一：SYBRGreen 法（一）工作原理1、SYBRGreen 能结合到双链 DNA 勺小沟部位Tm值，DNA解链一半时的温度SGSGSGSGEmssionilliiiiiFIiIIiiiiHinIrF11i111H11mir13O.JH.Ullin,mimin11in1J.UIUJ.1.111UU.Miu_引SGSGSG2、SYBRGreen 只有和双链 DNA 吉合后才发荧光3、变性时，DN 敏链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链 DNASYBRGreen 发荧光，在此阶段采集荧光信号NoEmissionExcita

6、tio将温度与荧光强度的变化求导。（-dl/dT）模板模板DNA量越多，荧光达到量越多，荧光达到攵越少攵越少9qErw9qErw804)804)Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值值. .就可以计算就可以计算PC 皈应体系的建立及优化1、SYBRGreen 使用浓度：太高抑制 Taq 酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3、MgCl2 勺浓度：可以降低到 1.5mM,以减少非特异性产物4、反应 Buffer 体系的优化5、反应温度和时间参数：由酶和引物决定6、其他与常规 PCN 目同（二）应用范围

7、1、起始模板的测定；2、基因型的分析；3、融解曲线分析：可以优化 PCR5 应的条件，对常规 PCRt 指导意义，如对 primer 的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。（三）优点及缺点优点：对 DNAJI 板没有选择性；适用于任何 DNA 使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏；便宜。缺点：容易与非特异性双链 DNA 吉合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；对引物特异性要求较高。方法二：TaqMan-水解型杂交探针与目标序列互补*5端标记有报告基团(Reporter,R)*3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)*探针完整，R 所发射的荧光能量被

8、Q 基团吸收，无荧光，R与 Q 分开，发荧光*Taq 酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针(一)工作原理注意：每扩增一条 DN 粉子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光PC 皈应的建立：1、引物、探针的设计:ProbeReporterQuencher,如 FAMVIC 等探针 Tm 为 68-70C,30bp,5不能有 G,G 可能会淬灭荧光引物尽量靠近探针，扩增片段400bp,引物 Tm为59-60C2、反应参数的确定：一般为：94C,10-20S60C,30-60S（Taq 酶 53外切核酸酶活性在 60C 最高）也可通过温度梯度优化退火温度 72C,45S,3、优化引物和探

9、针浓度：获得最小 Ct 值，信号/背景比值的最大引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM4、其他与常规 PCRlf 同（二）优缺点优点：对目标序列的高特异性-阴性结果确定设计相对简单-与目标序列某一区域互补重复性比较好缺点：只适合一个特定的目标；委托公司标记，价格较高；不易找到本底低的探针Real-timePCR 与 RT-PCRt 匕较2009-08-2016:50:02 来源：未知【大中小】评论：条摘要：Real-timePCR 与 RT-PC 幅两种不同的 PC 昉法，适用范围也不同。Real-timePCR 中文译作实时聚合酶链反应， 是一种最新发展的定量 PCRK术。该技

10、术借助于荧光信号来检测 PCFT 物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到 PC 陶循环一次就收集一个数据，建立实时扩Real-timePCRt 段的合适琼脂糖浓度琼脂糖浓度（）线性 DNAt 段的有效分离范围（kb）0.51-300.70.8121.10.5101.20.4-70.2-3六、需注意的问题：1、注意避免有毒、有害试剂伤害自己和他人：氯仿、澳化乙锭（EB）、酚、异硫富酸服、紫外线等2、注意避免试剂污染3、始终注意避免 RNA1 的污染：4、保管好自己专用的试剂，公用试剂保管好，相互协调，注意实验室卫生RealtimePCR 跟 RT-PCRt 什么区别关键词：reajtimeP

11、CRRT-PCR 区别 I?2008-07-2300:00 来源:丁香园点击次数：4932实时荧光定量 PCRM 理所谓实时荧光定量 PC 做术，是指在 PC 皈应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCFffi 程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。.内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测， 即 PCRIU 达平台期后进行检测， 而 PCRg过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在 96 孔 PCFa上做 96 次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。.实时荧光定量 PCRB 需内标实时荧光定量 PCRK 术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品 Ct 值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量 PCRB 需内标是建立在两个基础之上的：Ct 值的重现性PCR