sop无菌检查操作规程

1、颁发部门无菌检查操作规程接收部门生效日期操作标准-质量制定人制定日期文件编号审核人审核日期文件页数共 7 页批准人批准日期分发部门1.目的:建立无菌检查的标准操作规程，确保检验结果的准确性。2 .范围：适用于本厂质监科化验室对本厂生产的注射剂进行无菌检查。3 .责任：化验员有责任按本操作规程操作，并对检验结果负责。4 .定义：无菌检查法系指检查药品是否无菌的一种方法。5 .内容：5. 1 无菌操作设备：无菌操作室或超净工作台，无菌衣、口罩、帽子、消毒鞋、酒精灯等。5.1.1 无菌室分无菌操作室和缓冲问。在缓冲间内应有洗手盆、干手器、无菌衣放置架及挂钩、拖鞋等。无菌操作室应具有空气除菌过滤的层流

2、装置，局部洁净度 100 级超净工作台。缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外光灯和照明灯，操作室或工作台应保持空气正压。5.1.2 无菌室应每周和每次操作前用 0.1%新洁尔灭或 2%甲酚液擦拭操作台及可能污染的死角，开动无菌空气过滤器及紫外光灯杀菌 1 小时。在每次操作完毕，同样用 2%甲酚或 0.1%新洁尔灭溶液擦拭工作台面，用紫外光灯杀菌半小时。5.1.3 无菌室的无菌程度检查：无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数。取直径 90mn（碟，在接种室内点燃酒精灯，在酒精灯旁，以无菌操作，将双碟半开注入溶化的营养琼脂培养基约 20ml,制成平板：在 35-37C

3、预培养 48 小时， 证明无菌后将 3 个平板以无菌方式带入无菌操作问的洁净区域左、 中、 右各放 1 个； 打开碟盖扣置， 平板在空气中暴露 30 分钟后将盖盖好， 置 35-37C培养 48 小时，取出检查，3 个平板上生长的菌落数相加总数不得超过 10 个。无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度，应达到 100 级（一般用尘埃粒子计数仪）,检测尘埃粒径 05m 的粒数不得超过 3.5 个/升；空气流量应控制在 0.75-1.0m3/s;细菌菌落数平均1 个，可根据无菌状况定期置换过滤器。5.1.4 无菌室内应准备好盛有消毒用 5%甲酚的玻璃缸、酒精灯、火柴、银子、75%酒精

4、棉及拖鞋等。仪器、用具：真空泵、恒温培养箱、生物显微镜、托盘天平（精度 0.1g）、抽滤瓶（500ml）、三角瓶（100、500ml）、移液管（1、10ml）、注射器（要求规格）、试管、双碟（9cM、注射针、银子、剪刀、白金耳、橡皮管、纱布、棉花（原棉）、不锈钢吸管筒、接种环、微孔滤膜（直径约 5cM,孔径应在 0.450.02m）载玻片、洒精灯、取样勺、吸耳球、喷雾瓶。用具的包扎：82a移液管在移液管上端管内，松松地塞进少许原棉，然后放入不锈钢灭菌筒内。82a试管在管口塞上纱布棉塞。82a无菌衣、裤、帽、口罩将洗净的衣裤、帽子、口罩配套后装入布袋，扎紧袋口，再用牛皮纸包好。82a注射器洗涤干

5、净的注射器及注射针头装配好后，放入垫有纱布的带盖容器内（饭盒）一层层放好，上面盖上纱布，然后盖上容器的盖子，用牛皮纸包好。82a滤器将检验合格后微孔滤膜先有水中浸泡湿润，取出后固定在细菌过滤器的滤板上，滤板下、滤膜上均用耐高温垫圈垫好，上好滤器。在灭菌前滤器的螺勿拧太紧，滤器上口用 8 层纱布及牛皮纸包扎，装妥后放入容器内，再将盛滤器的容器盖好盖子，用牛皮纸包扎。用具的灭菌：将包扎好的用具，在 1210.5C 蒸汽灭菌柜中灭菌 30 分钟，物品取出时切勿立即置冷处，以免急速冷却灭菌物品内蒸汽冷凝造成负压，易致染菌，应置温箱或或加温烘干。培养基、试剂：一般采用商品干燥培养基， 临用时按照使用说明

6、书进行配制， 需注意培养基的 pH值应符合规定，否则必须校正后，灭菌使用。使用前，按要求分装灭菌好的细菌培养基须经 30-35C 培养 48 小时，真菌培养基须经 20-25C 培养 72 小时，证明无菌生长后方可使用。制备的需气菌、厌气菌培养基应半个月内用完，在供试品接种前，培养基指示剂氧化层的颜色不得超过培养基深度约 1/5,否则须经水浴煮沸加热，只限加热一次。革兰氏碘液：先用 3-5ml 蒸储水溶解 2.0g 碘化钾，再加入 1.0g 碘片，搅拌溶解后，加蒸储水稀释至 300ml,摇匀。置密闭棕色瓶中备用。结晶紫染色液：将结紫 1.0g 溶解于 20m195%醇中后，与 80ml1%t

7、酸钱溶液相混合，静置 48 小时使用。此液稳定，置密闭的棕色瓶中可储存数月。沙黄染色液：将 0.2g 沙黄溶解于 10m195K 醇中，待完全溶解后再加蒸储水至 100ml。生理盐水：称取 9g 氯化钠，加水 1000ml 溶解，分装后于 1210.5C 湿热灭菌 30 分钟。供作稀释剂用。75%乙醇量取无水乙醇 75ml,加水稀释至 100ml,摇匀，即得。0.1%新洁尔灭：量取 5 麻洁尔灭 20ml,加水稀释至约 1000ml,摇匀，即得。培养基灵敏度检查：新购的干燥培养基或采用不同牌号原材料的新鲜培养基，其质量均应符合灵敏度检查要求。取藤黄微球菌MicrococcusluteusCMC

8、C(B)28001的营养琼脂斜面和白色念珠菌CandidaalbicansCMCC(F)98001的真菌培养基琼脂斜面的新鲜培养物，分别用 0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液；取生抱梭菌ClostridiumsporogenesCMCC(B)64941不含琼脂的需气、厌气培养基新鲜培养物，用灭菌毛细管将其吸至灭菌离心管内，离心，弃去上清液，沉淀菌体用 0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀菌悬液。然后以 10 倍系列稀释后，制成 1ml 中含 10-100 个菌并计数。取藤黄微球菌、生抱梭菌的需气、厌气培养基新鲜培养物，白色念珠菌的真菌培养基琼脂斜面的新鲜培养物，取接种至霉菌培养基内，20-25C

9、 用 0.9%无菌氯化钠溶液作 10 倍稀释，制成 1ml 中含 10-100 个菌并计数。将藤黄微球菌的上述(1)或(2)的稀释液各 1ml,分别接种至每管装量为 9ml 的需气、厌气菌培养基 3 管，生抱梭菌的上述(1)或(2)的稀释液各 1ml,分别接种至每管装量为12ml 的需气、厌气菌培养基 3 管，白色念珠菌的上述(1)或(2)的稀释液各 1ml,接种至每管装量为 9ml 的真菌培养基 3 管，以未接种的培养基作对照，按规定的温度培养 5 天并逐日记录结果。结果判定：以每株菌接种后的培养基不得少于 2 管呈现生长，即该培养基的灵敏度检查符合要求。配制的培养基应在凉暗处保存，一般不得

10、超过 2 周，临用前细菌和霉菌培养基分别经 30-35C 和 20-25C 培养不少于 48 小时和 72 小时，证明无菌生长后方可使用。需气菌、厌气菌培养基在试管中装量高度不得少于 7Cm 其指示剂氧化层不得超过培养基深度的 1/5,否则须经水浴煮沸 10 分钟，但只限加热一次。无菌试验培养时间结束时，指示剂氧化层应不超过培养基深度的 1/2。对照用菌液的制备：试验用菌种、菌种的复苏、菌种的接种与保存等均应按照“抗生素微生物检定法”标准操作规程项下操作。金黄色葡萄球菌菌液用接种环取金黄色葡萄球菌Staphy-lococcusaureusCMCC(B)26003的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，接

11、种至营养肉汤培养基内，在 30-35C 培养 16-18 小时后，用灭菌生理盐水稀释成 1:106生抱梭菌菌液用接种环取生抱梭菌CMCC(B)64941的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物 1 白金耳，接种至相同培养基内，在 30-35C 培养 18-24 小时后，用灭菌生理盐水稀释成 1:106。白色念珠菌菌液用接种环取白色念珠菌CMCC(F)98001的真菌琼脂培养基斜面新鲜培养物 1 白金耳，接种至真菌培养基内，在 20-25C 培养 24 小时后，用灭菌生理盐水稀释成 1:105o上述制备的菌液，一般当日使用。进入无菌室的操作要点：根据试验程序，将用具物品搬入缓冲间，打开紫外光灯和空气过滤

12、装置并使其工作 1 小时以上。操作人员用肥皂水刷洗双手，关闭缓冲间紫外光灯，进入缓冲间内，关闭第一层门，用 2 豚苏尔或 0.1%新洁尔灭溶液洗双手，用消毒毛巾擦干，换上无菌衣、帽、口罩及消毒鞋。关闭无菌室内紫外光灯，进入第二层门并将用具搬至无菌室内，关闭无菌室门。凡进入无菌室后不应再外出取物品，因此，在每次试验中所用物品必须计划好，并准备好备用物品。从进入第一层门直至无菌室内，随操作人员的进入应喷雾 2 啾苏尔或 0.1%新洁尔灭溶液。检查法：无菌检查法包括：直接接种法和薄膜过滤法。前者适用于非抗菌作用的供试品；后者适用于有抗菌作用的或大容量的供试品。操作时，应先用 0.1%新洁尔灭浸泡或擦

13、拭容器表面后，以无菌的方法取内容物。凡无菌检查中，均应取相应溶剂和稀释剂同法操作，作阴性对照。供试品制备：用灭菌银取出注射器，在火焰旁将针芯插入针管并安上针头，盖为橡皮塞时，用注射器在已消毒好的橡皮塞中心位置刺入吸取药液。按规定须稀释或灭活的供试品，可直接或将瓶内供试液抽出至灭菌玻璃容器内进行灭活处理并稀释至规定的体积和浓度；抽取瓶中内容液体时，应将供试品倒置并使针头在液面下。直接接种法：按规定量取供试品，以无菌操作将该供试品分别接种于需气菌、厌气菌培养基 6 管，其中 1 管接种金黄色葡萄球菌液 1ml,作阳性对照，另接种于真菌培养基 5 管。轻轻摇动，使供试品与培养基混合。需气菌、厌气菌培

14、养基管置 30-35C、真菌培养基管置 20-25C 培养 7 日。在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。阳性对照管在 24小时内应有菌生长，如在加入供试品后，培养基出现浑浊，培养 7 天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或斜面培养基上继续培养，细菌培养 2 日，真菌培养 3 日，观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长，或用接种环取培养液涂片，染色，用显微镜观察是否有菌。薄膜过滤法：将微孔滤膜过滤装置、抽滤瓶、排气管与真空泵相连，真空泵可置无菌室外。取规定量供试品，按规定的方法处理后，加入 0.9%无菌氯化钠溶液 100ml中，混合后，通过装有孔径不大于

15、0.45 仙 m 的薄膜过滤器，减压抽干后，用 0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜 3 次，每次至少 100ml,取出滤膜分成 3 等份，分别加入上述二种培养基中，按规定温度和时间培养。阳性对照管应根据供试品特性加入相应对照菌液 1ml（抗细菌药物，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗厌氧菌药物，以生抱梭菌为对照菌；抗真菌药物，以白色念珠菌为对照菌）。阳性对照管细菌应在培养 24-48 小时，真菌应在培养 24-72 小时有菌生长。结果判断：第 7 页/共 7 页当阳性对照管显浑浊并确有菌生长，阴性对照管呈阴性时，可根据观察所得的结果判定：如需气菌、厌气菌及真菌培养基管均为澄清或虽浑浊但经证明并非有菌生长，均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及真菌培养