西索米星发酵工艺规程

1、STP-FJGY-05-00西索米星发酵生产工艺规程20-22原料药事业部*生物工程有限公司题 目：西索米星(Sisomicin )发酵工艺规程第1页共20页制定人：黄启鹏日期：编 码：STP-FJGY-005-01审核人：日期：生效日期：批准人：日期：颁发部门：质量部分发部门：生产副总、总工程师、生产部、质量保证部、发酵车问l目的建立西索米星发酵工艺规程，作为制定西索米星发酵部分SOP的依据；供生产管理人员统一操作，保证工艺要求明确可行，产品质量合格，保证发酵持续稳定生产。2适用范围西索米星发酵生产。3责任者西索米星发酵车间工艺员、车间负责人、生产部负责人、品保部负责人、总工程师对 此工艺规

2、程负责。1 产品概述 22 原材料质量规格 43 生物合成过程、生产工艺、设备流程 64 工艺过程 85 生产控制和技术检查 126 技术安全及防火 167 综合利用及“三废”治理 178 操作工时与生产周期 179劳动组织、岗位定员 1810主要生产设备一览表 1911原材料、动力消耗定额和技术经济指标 1912物料平衡 2013附页 201产品概述西索米星(Sisomicin ,又译成西梭霉素、紫苏霉素)产生菌由美国先令公司 Weinstein 等于1970年发现，匈牙利、日本等国也相继筛选出来。Micromonosporainyoensis( 伊尼 奥小单 抱菌)； Micromonos

3、pora rosa ； Micromonospora Cyaneogramalata的发酵产物主要是西索米星。西索米星 1976年才用于临床。我国 于八十年代初由福建、江苏微生物研究所先后筛选出野生型小单抱菌T- 125(即伊尼奥小单抱澄江变种，M. . inyoensis Var. Chengjiangensis) 和小单抱菌 M 41。我公司该产生菌源于T- 125,经过二十多年来的菌种选育与工艺探索，己成功筛选出一些新的较高产、组分纯的菌种，其中Y-系列菌种作为现今生产菌；而培养基配比与用料等工艺条件也有很大改进。其半合成抗生素奈替米星(Netilmicin) 也在我们公司批量生产，广泛

4、应用于临床。抗生素名称西索米星化学名称O-3-去氧-4-C-甲基-3-甲胺基-L-阿拉伯糖叱喃糖基(1 4)-O-2 , 6-二氨基-2,3 , 4, 6-四去氧-D-甘油基-4-烯己叱喃糖基-(16)-2-去氧-L-链霉胺。结构式西索米星及其主要小组分、衍生物R1R2R3合成方式西索米星H3C-OH-H生物合成主组分奈替米星H3C-OH-C2H5半合成抗生素66-40BHO-H-H生物合成小组分抗生素66-40DH -OH-H生物合成小组分主要产品产品名称分子式分子量西索米星碱（用于半合成）C19H37N5O7447.72硫酸西索米星(C19H37N5O7)2 5H2SO41385.43硫酸

5、余替米星(C21H41N5O7)2 5H2SO41441.54抗菌谱西索米星是一种广谱抗菌素，与庆大霉素 （Gentamicin）相似，对G+细菌（除链霉菌），包括结核分枝杆菌的活性很强。对G一细菌，包括多数绿脓杆菌具有相当活性。区别来看，前者总体活性强2倍，对绿脓杆菌活性则强5倍。2.原材料质量规格序 号原材料名称规格控制项目质量标准备注1土豆淀粉工业外观 含量 水分洁白的粉末，具有光泽。78%20%2黄豆饼粉工业外观 蛋白质 水分含油量细度淡黄色粉末（无霉味）37.0 %12 %冷榨：9%13%热榨： 10.0 %80目通过 72%3葡锢糖工业外观含量 水分无色结晶或白色结晶性或颗粒性粉末

6、，无臭、味甜。75.0 %14%4玉米浆工业外观 蛋白质 （干品） 干物质黄色或棕褐色浓稠液体。40.0 %40.0 %5工业外观干燥失重 蛋白质灰份淡黄色至浅黄棕色颗粒或粉末8.5 %44.0 %8%6蛋白陈工业外观 水分 总氮浅黄色至土黄色粉末7.0 %13.0 %7蛋氨酸外观含量白色粉末99.0 %8硫酸镁工业外观含量干燥失重白色粉末99.0 103.0 %48.0 % 52.0 %9水合氯化钻分析纯外观含量杂质含量红色或紫色结晶99%1 %10片碱工业外观含量白色片状99.5 %11液体淀粉酶外观酶活力棕黑色液体2000u/ml12豆油食用外观酸值淡黄色粘稠液体4.0mgKOH/g13

7、泡敌G.P.E工业外观酸值无色至淡黄色透明油状液体0.5mgKOH/g14碳酸钙（轻质）工业外观含量白色粉末97.0 %3生物合成过程、生产工艺、设备流程3.1生物合成过程途径：(a)加入D葡萄糖胺(b)加入D 葡萄糖(c) C 一 3 : N-甲基胺化(d) C 4":甲基化和差向异物化(e) C 一 6, ：胺化失去3 , 4 - ( OH 2和4 5 不饱和(g) C 6, ：胺化和4 -5 不饱化(h) C 4":甲基化和差向异物化Anti.一 AntibioticGM- Gentamicin3.2工艺流程330.5 C341 C种子培养485小时摇瓶种子>一

8、级种子培养液48h2h二级种子培养液33 0.5 C种子培养285h发酵培养液32 1 C,中间补料12次放罐发酵周期80- 120小时3.3发酵设备流程图4.工艺过程西索米星采用生物合成法，本公司产生菌源于伊尼奥小单抱澄江变种(M. inyoensis var . Cheng. Jiangensis) ,如今生产菌命名为 Y系列。西索米星生产采用纯种深层、通气搅拌及液体发酵。培养基消毒沿用饱和蒸汽实 消法。各级培养基以土豆淀粉为主碳源，以黄豆饼粉、玉米浆为主氮源。4.1 发酵生产培养基配方级别配规格SIMF-I一级种子罐 %SIMF-II二级种子罐 %SIMF-IV 发酵罐%SIMF-V补料

9、 %土豆淀粉工业2.74.56.56.0黄豆饼粉工业0.92.03.753.75蛋白陈工业0.2750.20gwe工业0.2750.50葡锢糖工业0.50玉米浆工业0.500.80.8淀粉酶工业0.1 ml/kg0.12 ml/kg0.12 ml/kg氯化钻CP2r/m12r/m1硫酸镁工业0.045蛋氨酸工业0.120.15泡敌工业0.00450.02250.0150.015豆油食用0.090.1750.060.06碳酸钙工业0.180.50.050.5消前pH7.5 0.17.5 0.17.5 0.17.5 0.14.2 菌丝形态划分：抗生素发酵生产过程中，产生菌菌丝在不同生长代谢阶段体现

10、不同。西索米星 发酵生产亦然，经过长期镜检总结，我们将其划分为六个阶段。编号菌丝形态阶段菌丝特征号1丝状、轮状分枝、小朵（并存）丝状弯曲而走势舒展，分枝不定点，长短 不一，分枝渐多成小朵。形状不一，染色较深。II小朵、中朵（并存）小朵继续分枝达到中朵，染色较深。III大木、局郃成网、疏网状大朵继续分枝扩展,根基部出现二至三倍 于原菌丝宽度的粗菌丝。朵朵相连，局部成网， 而后整体成疏网状。染色仍较深，有些空抱。IV密网状疏网很快生长成密网。染色较深，有些空 抱。V父联密网状密网进一步生长，互相交联。染色由深渐 浅。镜检涂片应摊薄，或以无菌水稀释，以分 辨菌丝。菌丝空抱明显增多。VI菌丝自溶菌丝染

11、色浅，镜检菌丝模糊难辨，可见空 抱点点。稀释镜检，方可分辨菌丝形状，视野 背景仍清晰。4.3 种子罐接种当一级种子罐罐温按规定时间达到工艺规定要求时，先关闭门窗与通风装置，并 用过氧乙酸喷洒接种罐周围空间。用压差接种法接种，即先迅速将接种口与摇瓶口对 接，然后升高罐压至0.8-1.0MPa后随即降低罐压，将摇瓶种子液压入一级种子罐。当 摇瓶种子液全部压入一级种子罐后，调节罐压在工艺要求范围内。4.4 培养基配制4.4.1 种子罐配料在洗净的小罐配料槽内先放水至搅拌处，开动搅拌，按工艺员所开配料单，严格 检查仓库送来的物料，准确称取物料，倒入配料槽，搅拌均匀，再加水至配料体积， 调pH至工艺要求

12、，加入轻质碳酸钙，搅拌均匀后，经泵输送至一级罐内。1.1.2 二级罐配料在洗净的大罐配料槽内先放水至搅拌叶处，开动搅拌，按工艺员所开配料单，严 格检查仓库送来的物料，准确称取小料，对不溶解的物料按量由大到小次序投料，再 将可溶性小料投入，加消沫豆油及泡敌，边搅拌边加水至所需体积，调pH5工艺要求，加入轻质碳酸钙，搅拌均匀经泵输送至二级罐内。1.1.3 大罐（发酵罐、补料罐）配料在洗净的大罐配料槽内先放水至搅拌叶处，开动搅拌，按工艺员所开配料单，严 格检查仓库送来的物料，准确称取小料，按量的大小，水溶性的难易次序先后加入， 最后量入豆油及泡敌，搅拌均匀后加水至配料体积差0.5m3,用调pH5工艺

13、要求，投入配料量轻质碳酸钙，搅拌均匀后由泵输送到指定的大罐内，槽内残料用0.5 m3的清水洗涤一并输送入罐。4.6 培养基消毒4.6.1 一、二级罐培养基实消拆检取样阀，锁紧罐盖，打好料，排尽夹套内冷凝水，打开罐上排气口，依次从取样管道、罐底管道、空气管道通入蒸汽进行消毒，升温至 100 1C,罐压0.08 MPa 时，打开冲视镜阀门，通过调整上述三路蒸汽阀门及罐上排气阀，直接升温至罐压0.10-0.12MPa,罐温123 2c时，保压30 1分钟。消毒结束，再依次关闭各路蒸汽阀，并 调节排气阀。当罐压低于分过滤器压力 O.04 O.05MPat入无菌空气。使一级罐压维持 0.03 0.04M

14、pa,二级0.02 0.03Mpa ,开启夹套冷却水进水阀进行冷却。当罐温达 40 0.5 C,开启冰水进行冷却。待罐温冷至35c即可接种。（备注：一级种子罐有接种口，消毒时必须排气。）4.6.2 大罐（发酵罐、补料罐）培养基消毒拆检取样阀，锁紧罐盖，料打好后，开动搅拌（消毒搅拌转速设定为70rpm）,打开工业水回水阀。开大罐排气阀，依次从取样进汽管道，空气进汽管道、罐底进汽管道通入饱和蒸汽进行消毒。通过调节后二路蒸汽及罐上排气，将罐温升至 100 1 C,收小 排气，微开冲视镜蒸汽阀，继续将罐压升至 0.10-O.12MPa ,罐温123 2 C,保压30 1 分钟。保压结束，再依次关闭各路

15、蒸汽，调节排气阀，使罐压低于分过滤器0.04-O.05MPq通入无菌空气，使压保持 0.01MPa （补料罐压保持 0.05 O.06MPO）。从蛇管 道通入工业水进行冷却，待罐温冷却至40 C,开冰水进行降温，罐温 33 c即可接种。4.7 发酵设备消毒4.7.1 粗过滤器介质的安装粗过滤器介质采用上海一鸣过滤器有限公司生产的高效空气过滤滤芯，为定型的产 品，按规格要求安装。使用前用空气吹，排空一段时间后，即可使用。不能用蒸汽消毒。 4.7.2预过滤器，精过滤器的安装空气分过滤器的滤芯采用上海一鸣过滤器有限公司生产的高效膜过滤器。分为预过滤 器、精过滤器、以及用来消毒用的蒸汽过滤器。过滤器内

16、介质按规格要求安装。4.7.3 分过滤器消毒只消精过滤器，不消预过滤器。蒸汽管道的冷凝水排尽，精滤及附属管道泄压后， 压力在0.2MPa以上的饱和蒸汽经蒸汽过滤器通入精过滤器，调节相关小排汽，使压力 在0.10 0.11MPa之间，以免损坏超滤膜，消毒 30±1分钟（新过滤器安装后第一次消 毒应消40分钟），关蒸汽，通入空气吹干，直至无水分，方可使用。4.7.4 空罐消毒（以60吨大罐为例）在洗净发酵罐后，打开排气，打开工业水排水阀，即可通入蒸汽消毒，先后通入取样管道、空气管道、 罐底管道各路蒸汽，待罐的压力升至0.100.11MPa,温度121c时，再通入冲视镜蒸汽，开相关小排汽，

17、调节控制罐压在0.10-0.15MPa,罐温121-125 C, 保压40分钟，消毒结束，依次停止通入蒸汽。打开下水道阀门，排掉罐内冷凝水，吹 干备用。4.7.5 移种管道消毒总蒸汽压力在0.2MPa以上时，将蒸汽通入接种罐与移种罐之间的管道，待移种末 端有蒸汽排出，控制各路排汽。保持管道有 0.10-0.15MPa以上活蒸汽，消毒60分钟， 即可移种。4.7.6 补料管道消毒总蒸汽压力在0.2MPa以上时，将蒸汽通入补料罐和接料罐之间的管道，待接料末 端有蒸汽排出，控制各路排汽。保持管道有0.100.15MPa以上活蒸汽，消毒60分钟，即可补料。5 .生产控制和技术检查5.1各级工艺控制点工

18、艺控制工序及岗位工艺控制点一级种子罐接种量：0.004-0.006 %培亦时间：48 5小时搅拌转速：200rpm空气流量：15-18 m3/hr培养温度：33 0.5 C罐压：0.03-0.04MPa二级种子罐接种量：812%搅拌：200rpm罐压：0.02-0.03MPa空气流量：130-160 m3/hr培养温度：33 0.5 C培亦时间：28 5时间发酵罐接种量：15 20%培养温度：32 1 C培养时间：80 120小时罐压：0.01MPa搅拌转速：70 140rpm发酵过程工艺：发酵前期补全料12m；发酵中期补全料空气流量：800-1000 m3/hr12m5.2各级中间质量控制标

19、准岗位级别项目质量要求无菌度镜检无杂菌，同时做无试跟踪。发 酵 工 段一级 种 子外观呈淡姜黄色，粘度达 80 CPo以上，有些小气泡。代谢情况消后：pH 6.57.2;移前：pH 7.37.6。菌丝形态菌丝染色较深，有空抱，为较密网状。无菌度镜检无杂菌，斜面与肉汤检测呈阴性发 酵 工 段二 级 种 子外观呈淡姜黄色，粘度达 150 CPo以上，有些小气泡代谢情况消后：pH 6.57.2;移前：pH 7.07.5。菌丝形态菌丝染色较深，有空抱，为网状、密网状、局密网状。无菌度镜检无杂菌，斜面与肉汤无试检测呈阴性。发 酵 工 段发酵罐外观密度逐步长浓，于 15小时左右达到 250CPO以上， 补

20、料后仍迅速长浓。产抗期粘度维持在 400800CPO 较好。颜色较深，较长时间维持在委黄色。代谢情况pH:消后6.8 -7.2。发酵前期，pH略有下降，而 后略上升，补料后略降，又略升。产抗期pH在7.2 7.5。放罐 pH 达 7.1-7.5菌浓：发酵生产期，菌浓逐渐增长。产抗期，菌浓 维E 3050%,通皿 40 5%。总糖：消后 6.5 7.0g/100ml每12小时耗糖 0.4 0.8g/100ml , 12 20小时补 料一次，36-42小时再补料一次，引起糖值略有上升。 放罐残糖为1-3g/100ml 。氨基氮：消后至整个发酵过程略有起伏，具值在 40-80mg/100ml 波动。

21、效价：35hr起步300u/ml以上，放罐达 700u/ml 以上。菌丝形态按菌丝形态划分中田、IV、V、叫阶段无菌度镜检无杂菌，斜面与肉汤无试检验呈阴性发 酵 工 段放 罐外观姜黄色粘稠液体。生化指标pH: 7.1 -7.5 ;粘度：400-800CPO；残糖：1-3g/100ml ;氨基氮：40-100mg/100ml ;预计效价：700u/ml（根据发酵过程生化参数估计）菌丝形态未稀释涂片，可发现菌丝模糊一片，空抱点点。摊平涂 薄或稀释涂片，可以镜检染色浅的密网状菌丝及一些菌 丝残段。无菌度镜检无杂菌5.3中间体分析检查岗 位检查 名称检查时间检查项目要求（标准）检查方法取样人检查人一级

22、 种 子 罐种 子 培 养 液消后及接 后每12小 时一次pH值按中间质量控制标准pH计测车间化验员化验员接后每12 小时一次粘度粘度计消后移前总糖化测氨基氮化测消后及接后每12小时一次菌丝形态按中间质 量控制标准镜检车间无试人员工艺员无菌度无杂菌肉汤斜面 镜检二 级 种 子 罐种 子 罐 培 养 液消后及接 后每12小 时一次pH值按中间质量控制标准pH计测车间化验员化验员接后每12小时一次粘度粘度计消后及移 前各一次总糖化测氨基氮化测接后每12 小时一次菌丝形态按中间质量控制标准镜检车间无试人员工艺员消后及接 后每12小 时一次无菌试验无杂菌肉汤斜面 镜检岗位检查 名称检查时间检查项目要求

23、（标准）检查方法取样人检查人发酵罐发 酵 培 养 液消后及 接后每12 小时一次pH值按中间质量控制标准pH计测化验员化验员粘度粘度计菌浓离心机总糖化测氨基氮化测菌丝形态镜检无试人员工艺员消后60小时前每12小时一次无菌试验无杂菌肉汤斜面镜检车间无试人员工艺员约35小时后每12 小时一次生物效价起步300500u/ml 每档增加约100u/ml生测车间 化验员生测组6 .技术安全及防火技术安全及防火知识，是企业生产车间每个职工必备的。它关系到国家财产以及个人的生命安全。发酵工段及菌种部门在日常生产中，涉及压力容器（如水罐、发酵罐、空气贮罐等）、电气设备、高压饱和蒸汽、浓酸、强碱、易燃性酒精，以

24、及一 些有毒的化学诱变剂（如氮疥、NTG?）、强辐射物理诱变剂（如Co-60放射线），这些 对人体都会带来不安全因素，因而车间对技术安全和防火知识教育特别重视，以保 障车间安全生产。6.1 防火规程6.1.1 一切易燃品不准随便放在车间内，如生产上需要应放在指定的安全处，车间 内外通道，严禁堆放物品，应保持道路畅通。6.1.2 防爆区域内不能随便烧焊，如必须焊接则应得到安全部门批准，办好动火证， 将附近易燃品移去，并备好防火用具方可动火。6.1.3 蒸汽管路上不得放置棉花、衣服、手套等棉织品，谨防燃烧。6.1.4 在防火防爆区内绝不能有明火，所有人员不得携带火种，严禁吸烟。6.1.5 禁止穿铁

25、钉的鞋进入防爆区及车间，在防爆区和生产现场严禁强烈敲打铁器，搬运溶媒桶时，禁止在地面上抛掷、拖拉、碰撞，避免产生火花。6.1.6 为了防止输送溶媒时产生静电，工艺管道的法兰，阀门二边均要以导体相连。有接地装置，接地总电阻不超过 10。6.1.7 防爆区、所用电器设备，如开关、照明、马达均需用防爆型，并均需接地， 电器设备发生意外时要迅速切断电源，润湿的物体、手、工具、金属等不可接触有 电部位。6.2 如遇以下情况发生时，应迅速处理。6.2.1 一般化学品着火，可用泡沫灭火器或用沙土遮盖，隔绝空气。6.2.2 电器着火，首先切断电源后用四氯化碳灭火器。6.2.3 发现有人触电，必须先立即切断电源

26、，千万不可直接接触触电人。6.2.4 被酸烫伤时，应用大量水冲洗后，以10%的碳酸俊或碳酸氢钠溶液洗涤，若溅入口腔或眼内，应用 5%碳酸氢钠溶液漱口或冲洗。6.2.5 被碱烫伤时，用大量水冲洗后，用36%的醋酸溶液或1-2 %盐酸溶液洗涤，若溅入口腔，用3%的醋酸溶液涮口。若溅入眼内，用1 %的硼酸溶液洗涤。6.2.6 氨中毒时，应把患者抬到室外新鲜空气里。7 .综合利用及三废治理发酵分厂各车间主要担负西索米星生产，根据市场情况，部分罐批生产核糖霉素、新霉素，其废液主要是发酵菌丝体残液，而废酸、碱、结晶废母液的治理将在提炼工 艺中介绍。放罐的发酵液中含大量的菌丝体及其它未分解物质。西索米星、核

27、糖霉素、新霉 素发酵液经提炼离子交换吸附后，其菌丝渣过筛，悬浮液由泵打入厂内一级污水处理 站。对于染噬菌体、染菌等异常罐批的处理也应除渣，悬浮液送污水处理站。滤渣可 供农业作肥料，污水处理站处理后中性废液排下水道，废液排放标准：SS<500PPM8 .操作工时与生产周期：岗位操作单元操作时间罐体检修0.5小时进料、消毒冷却2.5小时级m隹种子罐培养48 5小时移种1小时洗罐0.5小时罐体检修0.5小时进料、消毒冷却4小时._*徼由隹一级罐培乔28 5小时移种1小时洗罐0.5小时罐体检修0.5小时进料、消毒冷却5小时发酵罐补料、消毒冷却 发酵培养4小时80 120小时放罐0.5小时洗罐1小