酶制剂的生产及在食品工业中的应用

1、酶制剂的生产及在食品工业中的应用谢玉锋 生物工程学院 学号：12909002摘要：酶制剂由于其高效专一性的特点应用越来越广泛，微生物酶制剂的发酵生产也越来越引起了人们的关注。本文主要从酶制剂的发酵、纯化、稳定性进行了分析，并且对微生物酶制剂在食品工业生产中的主要应用做了论述。关键词：酶制剂；发酵；纯化；应用酶是一种生物催化剂，催化效率高、反应条件温和和专一性强等特点，已经日益受到人们的重视，应用也越来越广泛。生物界中已发现有多种生物酶，在生产中广泛应用的仅有淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、脂肪酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶等十几种。利用微生物生产生物酶制剂要比从植物瓜果、种子、动物组织中获得

2、更容易。因为动、植物来源有限，且受季节、气候和地域的限制，而微生物不仅不受这些因素的影响，而且种类繁多、生长速度快、加工提纯容易、加工成本相对比较低，充分显示了微生物生产酶制剂的优越性。现在除少数几种酶仍从动、植物中提取外，绝大部分是用微生物来生产的。1 主要酶制剂及产酶微生物酶制剂可以由细菌、酵母菌、霉菌、放线菌等微生物生产。微生物产生的各种酶以及它们在食品工业中的应用见下表微生物酶制剂及其在食品工业中的应用 酶用 途来源淀粉酶普鲁兰酶蛋白酶脂肪酶纤维素酶果胶酶葡萄糖氧化酶乳糖酶凝乳酶水解淀粉制造葡萄糖、麦芽糖、糊精水解淀粉成直链低聚糖软化肌肉纤维、啤酒果酒澄清、动植物蛋白质水解营养液用于制

3、作干酪和奶油，大米、大豆、淀粉制造用于大米、大豆、玉米脱皮，提高果汁澄清度等用于柑桔脱囊衣，饮料、果酒澄清、防止食品褐变制造转化糖，防止高浓度糖浆中蔗糖析出，防止糖乳糖酶缺乏的乳品制造，防止乳制品中乳糖析出细菌、霉菌细菌、霉菌细菌、霉菌酵母、霉菌霉菌霉菌霉菌、细菌霉菌霉菌1.1 微生物酶制剂生产1.1.1 菌种选择 任何生物都能在一定的条件下合成某些酶。但并不是所有的细胞都能用于酶的发酵生产。一般说来，能用于酶发酵生产的细胞必须具备如下几个条件：酶的产量高。优良的产酶细胞首先具有高产的特性，才有较好的开发应用价值。高产细胞可以通过筛选、诱变、或采用基因工程、细胞工程等技术而获得；容易培养和管理

4、，要求产酶细胞容易生长繁殖，并且适应性较强，易于控制，便于管理；产酶稳定性好。在通常的生产条件下，能够稳定地用于生产，不易退化。一旦细胞退化，要经过复壮处理，使其恢复产酶性能；利于酶的分离纯化。发酵完成后，需经分离纯化过程，才能得到所需的酶，这就要求产酶细胞本身及其它杂质易于和酶分离；安全可靠。要使用的细胞及其代谢物安全无毒，不会影响生产人员和环境，也不会对酶的应用产生其它不良的影响。1.1.2 产酶培养 酶的发酵生产是以获得大量所需的酶为目的。为此，除了选择性能优良的产酶细胞以外，还必须满足细胞生长、繁殖和发酵产酶的各种工艺条件，并要根据发酵过程的变化进行优化控制。1) 固体培养法 固体培养

5、是以皮麸或米糠为主要原料，另外添加谷糠、豆饼等为辅助原料。经过对原料发酵前处理，在一定的培养条件下微生物进行生长繁殖代谢产酶。固体培养法比液体培养法产酶量高。同时还具有原料简单、不易污染、操作简便、酶提取容易、节省能源等优点。缺点是不便自动化和连续化作业，占地多、劳动强度大、生产周期长。2) 液体培养法 液体培养法的优点是：占地少、生产量大、适合机械化作业、发酵条件容易控制、不易污染，还可大大减轻劳动强度。其培养方法有分批培养、流加培养和连续培养三种，其中前两种培养法广为应用，后者因污染和变异等关键性技术问题尚未解决，应用受到限制。在深层液体培养中，pH值、通气量、温度、基质组成、生长速率、生

6、长期及代谢产物等都对酶的形成和产量有影响，要严加控制。深层培养的时间通过监测培养过程的酶活来确定，一般较固体培养周期(17d)短，仅需15d。与固体培养法相比，3) 产酶条件的控制 提高微生物酶活性和产率的途径是多方面的，其中控制营养和培养条件是最基本也是最重要的途径。改变培养基成分，常常能提高酶活性，改变培养基的氢离子浓度和通气等条件，可以调节酶系的比例，改变代谢调节或遗传型，可以使酶的微生物合成产生成千倍的变化。上述的这些措施，对于微生物产酶的影响并非孤立的，而是相互联系、相互制约的。所谓最佳培养条件与培养基的最佳组成，都是保证酶合成达到最高产率的控制条件。通常，菌种的生长与产酶未必是同步

7、的，产酶量也并不是完全与微生物生长旺盛程度成正比。为了使菌体最大限度地产酶，除了根据菌种特性或生产条件选择恰当的产酶培养基外，还应当为菌种在各个生理时期创造不同的培养条件。 培养基a 碳源碳水化合物是微生物细胞的重要组成材料、能源和酶的组成部分，也是多种诱导酶的诱导物。不同微生物要求的碳源不同，是由菌种自身的酶系（组成酶或诱导酶）所决定。综合起来有如下几点值得注意：葡萄糖、蔗糖等易利用的碳水化合物，对促进细胞的呼吸与生长有利。高浓度下，对产酶有抑制作用，如蛋白酶和-淀粉酶等就是如此，也有与此相反的情况；有些微生物不能利用复杂的碳水化合物，必须使用葡萄糖等简单的碳水化合物时，可采用流加法等避免出

8、现"葡萄糖效应"现象；有时近似的碳源，也会因某些原因，出现不同的产酶情况，如黄青霉（葡萄糖氧化酶产生菌）在甜菜糖蜜作碳源时不产酶，以甘蔗糖蜜作碳源时产酶量显著增高。此外，碳源类型除了影响产酶外，还能影响微生物胞内酶与胞外酶的比例。b 氮源 氮源是蛋白质的组成成分，它能起到诱导和阻遏酶形成的作用。在蛋白酶生产中，蛋白质能诱导酶的形成，而它的水解物就不及它本身好。氨基酸的作用变化很大，有的有利，有的抑制。 氮源对于微生物生长与产酶有几方面影响：既促进微生物生长，又促进产酶；只促进微生物生长，不促进产酶；只促进产酶，不促进微生物生长；既不促进微生物生长，又不促进产酶。在严格选定氮

9、源类型之后，还应当注意碳源浓度，即碳氮比、无机氮与有机氮的浓度比例、无机氮的种类等。在曲霉淀粉酶的生产过程中，如果碳源不足，不能得到充分的能源，菌丝体对于氮源的消耗显著降低，影响淀粉酶的合成。c 无机盐有些金属离子本身就是酶的组成部分。盐对产酶的效应比较复杂，现分述如下： 磷：多数情况对产酶有促进作用，在蛋白酶中比较明显；钙：Ca2+对蛋白酶有明显的保护和稳定作用。Ca2+对-淀粉酶的作用更为明显，纯化的-淀粉酶在50以上容易失活，但有大Ca2+存在时，酶的热稳性增加。不同的菌种热稳性提高到65至90。 pH的稳定范围也从57扩展至511。Na+、Cl-对提高枯草杆菌液化型-淀粉酶的耐热性的作

10、用尤为显著。 添加适量的Mg2+，Zn2+，Mn2+，Co2+，Fe2+等能提高蛋白酶和-淀粉酶等的产酶量。在一种情况下，一种离子可能是活化剂，在另一种情况下却成了抑制剂。不同的酶往往需要不同的离子作它的活化剂。d 生长因子多种氨基酸维生素是微生物生长与产酶的必要成分，有些维生素甚至就是酶的组成部分。麦芽根、酵母膏、玉米浆、米糠、曲汁、麦芽汁、玉米废醪中均含有不同程度的微量生长因素，对促进产酶有显著效应。磷酸酰环己六醇也是微生物的重要生长因素之一。 培养条件a pH值 同一菌种产酶的类型与酶系组成可以随pH值的改变而产生不同程度的变化。如用黑曲霉使腺苷酸氧化脱氨转变为肌苷酸时，培养在pH值6.

11、0以上的环境中，果胶酶活性受到抑制，pH值改变到6.0以下就形成果胶酶。pH值还决定酶系的组成，泡盛曲霉突变株在pH值6.0培养时，以产生-淀粉酶为主，糖化型淀粉酶与麦穿糖酶产生极少。在pH值2.4条件下培养，转向糖化型淀粉酶与麦穿糖酶的合成，-淀粉酶的合成受到抑制。 在蛋白酶生产中，pH低有利于酸性蛋白酶生成，pH高有利于中性和碱性蛋白酶生成，这是相一致的。产酶pH值常同酶反应最适pH值接近，但酶反应的最适pH也许对某些酶最不稳定，在这种场合下只能选择尽量靠近的pH值。 在有些情况下，由于pH不同，出现胞内和胞外酶的产量比例不同，如-半乳糖苷酶在PH4.8至6.0范围内，其胞内酶占74%。当

12、pH升高时胞外酶的比例就升高。b 温度 温度对产酶的影响有以下几种情况： 产酶温度低于生长温度。酱油曲霉蛋白酶合成的适宜温度在28，比生长温度40条件下产酶量高出24倍。在异淀粉酶生产中也有这种情况； 产酶温度与生长温度一致。如链霉菌合成葡萄糖异构酶约在30； 产酶温度高于生长温度。例如产生糖化型淀粉酶的适宜温度在35，而它生长的最适温度为30。链霉菌产生淀粉酶的温度以35合适，而生长温度则以28最好； 此外，温度还能影响酶系组成及酶的特性。例如，用米曲霉制曲时，温度控制在低限，有利于蛋白酶合成，而-淀粉酶活性受到抑制。c 通气和搅拌 以枯草杆菌产生-淀粉酶为例。将细菌的生理时期划分为三个阶段

13、：菌体繁殖期，接种后513h；芽胞产生期；产酶期。这三个阶段对于供氧要求是不同的。如果第二时期维持缺氧状态，有助于抑制芽胞形成，第一和第三生理时期充分供氧，可以促进菌体繁殖并提高产酶量，证明不同时期，对通气量要求不同。d 种龄过老或过嫩，不但延长发酵周期，而且会降低产酶量。一般种龄在30至45h的酶活性最高。1.2 分离提纯 微生物酶的提取方法，因酶的结合状态与稳定性的不同，对产品的纯度要求不同，而有一定的区别。如果提取到的酶是一种可溶于水的复杂混合物，则需要进一步加以纯化。适用于大生产的提纯方法总是以降低成本、提高效能而同时又提高产品纯度和质量为前提，事先应当经小试验规模充分对比，从中加以选

14、择。理想的提纯方法应满足二个条件，即比活性的提高与总活性的回收高，但实际上往往难以兼得。1.2.1 盐析法 盐析剂中性盐的选择： MgS04，(NH4)2S04，Na2SO4，NaH2P04是常用的盐析用中性盐。其盐析蛋白质的能力随蛋白质的种类而不同，但一般说来这种能力按上述顺序依次增大。一般可以说含有多价阴离子的中性盐其盐析效果好。但实际上(NH4)2S04是最多用的盐析剂，这是因为它的溶解度在较低温度下也是相当高的。有的酶只有在低温下稳定，而低温下Na2S04，NaH2P04的溶解度很低，常常不能达到使这种酶盐析的浓度。 盐析剂用量的决定：不同的酶使之盐析沉淀的盐析剂用量是不同的，随共存的

15、杂质的种类和数量而有所差异。因此适当的使用量只能根据实践决定，并根据数据可以绘制出盐析曲线。 pH和温度的影响：蛋白质的溶解度在无盐存在下，以在等电点时为最小，在稀盐状态时大致也是这样。但在高浓度的中性盐溶液中，原有蛋臼质溶液pH的影响不大。实际上溶液最终的pH为盐析剂所决定。 在无盐或稀盐溶液中，温度低，蛋白质的溶解度也低，但在高浓度盐溶液中，温度高则蛋白质的溶解度反而低。因此一般说来盐析时不要降低温度，除非这种酶不耐热。盐析法的优点是在常温沉淀过程中不会造成酶的失活，沉淀物在室温下长时间放置也不会失活，在沉淀酶的同时夹带沉淀的非蛋白质杂质少，而且适用于任何酶的沉淀。它的缺点是沉淀物中含有大

16、量的盐析剂。如用硫酸按一次沉淀法制取的酶制剂，就含有硫酸铵的气味，如果这种制剂不经脱盐直接用于食品工业，不但影响食品的风味和工艺效果，而且工业硫酸铵中可能含有毒性物质，不符合卫生要求。1.2.2 有机溶剂沉淀法 有机溶剂的选择 有机溶剂沉淀蛋白质的能力随蛋白质的种类及有机溶剂的种类而不同，对曲霉淀粉酶而言，有机溶剂的沉淀能力，丙酮>异丙醇>乙醇>甲醇。这个顺序还受温度、pH、盐离子浓度所影响，不是一成不变的。 有机溶剂的用量 有机溶剂的沉淀能力受很多因素影响，特别是溶存盐类的影响尤为显著。当存在少量中性盐(0.10.2mol/L以上)时能产生盐溶作用。蛋白质在有机溶剂水溶液中

17、的溶解度升高。多价阳离子如Ca2+，Zn2+与蛋白质结合，就能使蛋白质在水或有机溶剂中的溶解度降低，因而可以降低使酶沉淀的有机溶剂的浓度。工艺参数的影响a 温度有机溶剂沉淀蛋白质的能力受温度的影响很大。一般言之，温度愈低沉淀愈完全。局部区域有机溶剂过浓，能够严重破坏蛋白质的空间结构造成酶的变性失活，在温度较高的条件下尤为显著。b pH值 蛋白质在等电点的溶解度最低，但很多酶的等电点在pH45值之间，比其稳定的pH值范围低。在这种情况下必须采用目的酶稳定的pH值，然后是尽可能靠近其等电点。 沉淀时酶液的温度和pH值不但对目的酶的收率具有决定性的影响，而且对酶的组成(各共存酶的比率)及单位重量沉淀

18、物中目的酶的活力都有重要的关系。1.2.3 吸附法 白土及活性氧化铝吸附法 白土类是以硅酸铝为主要成分的粘土，随其种类不同，能吸附酶或蛋白质的种类和数量也不同，一般在弱酸性条件下吸附酶或蛋白质，在中性或弱碱性条件下解吸。白土先用2mol/L盐酸活化。 活性氧化铝也是最常用的吸附酶或蛋白质的吸附剂之一。可以用明矶、硫酸铵等调制，加热使之活性化。酶或蛋白质一般在弱酸性条件下吸附，在弱碱性条件下解吸。 淀粉吸附-淀粉酶的方法一定的酶只作用于特定的基质，这一事实说明两者之间有一种特别的亲和力。因此用基质吸附那种对基质具有特定作用的酶，可以达到很好的效果。但作为吸附剂的基质首先必须是固相物；其次在吸附酶

19、的过程中，这种基质不会被它所吸附而又专门能作用于它的酶所分解，或分解程度极微；第三是单位重量的基质吸附这种特定酶的能力均应该足够大。现发现生淀粉对-淀粉酶的吸附是比较接近于上述条件的。1.3酶制剂化和稳定化处理浓缩的酶液可制成液体或固体酶制剂。酶制剂的出售是以一定体积或重量的酶活计价，所以生产出的酶制剂在出售前往往需要稀释至一定的标准酶活。同时为改进和提高酶制剂的储藏稳定性，一般都要在酶制剂中加入一种以上的物质，它们既可作酶活稳定剂，又可作抗菌剂及助滤剂，它们若制成干粉，则可起到填料、稀释剂和抗结块剂的作用。可用作酶活稳定剂的物质很多，如辅基、辅酶、金属离子、底物、整合剂、蛋白质等，最常用的有

20、多元醇、糖类、食盐、乙醇及有机钙。有时用一种稳定剂效果不明显，则需要几种物质合用，如明胶对细菌淀粉酶及蛋白酶有稳定作用，但效果不明显，若同时加人些乙醇和甘油，稳定效果就显著了。2 酶制剂在食品工业中的应用2.1酶制剂在食品保鲜方面的应用随着人们对食品的要求不断提高和科学技术的不断进步，一种崭新的食品保鲜技术-酶法保鲜技术正在崛起。酶法保鲜技术是利用生物酶的高效的催化作用，防止或消除外界因素对食品的不良影响，从而保持食品原有的优良品质和特性的技术。由于酶具有专一性强、催化效率高、作用条件温和等特点，可广泛地应用于各种食品的保鲜，有效地防止外界因素，特别是氧化和微生物对食品所造成的不良影响。葡萄糖

21、氧化酶是一种氧化还原酶，它可催化葡萄糖和氧反应，生成葡萄糖酸和双氧水。将葡萄糖氧化酶与食品一起置于密封容器中，在有葡萄糖存在的条件下，该酶可有效地降低或消除密封容器中的氧气或者在有氧条件下，将产品中的的少量葡萄糖除去，从而有效地防止褐变，起到食品保鲜作用，提高产品的质量。溶菌酶是一种催化细菌细胞壁中的肽多糖水解的水解酶。它专一地作用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的-1，4键，从而破坏细菌的细胞壁，使细菌溶解死亡。一般可从鸡蛋的蛋清中得到。用溶菌酶处理食品，可以有效地防止和消除细菌对食品的污染，起到防腐保鲜作用。溶菌酶由于其专一地作用于细菌的细胞壁，使细菌溶解，而对没有细胞

22、壁的人体细胞不会产生不利的影响，所以广泛地应用于医药、食品等需要杀灭细菌的领域。2.2 酶制剂在淀粉类食品生产中的应用在淀粉类食品的加工中，多种酶被广泛地应用，其中主要的有-淀粉酶、-淀粉酶、糖化酶、支链淀粉酶、葡萄糖异构酶等。现在国内外葡萄糖的生产绝大多数是采用淀粉酶水解的方法。酶法生产葡萄糖是以淀粉为原料，先经-淀粉酶液化成糊精，再利用糖化酶生成葡萄糖。果葡糖浆是有葡萄糖异构酶催化葡萄糖异构化生成果糖，而得到含有葡萄糖和果糖的混合糖浆。若将异构化反应完成后，混合糖液经过脱色、精制、浓缩等过程，得到固形物含量达71%左右的果葡糖浆。糊精是淀粉的低级程度水解产物，广泛应用于食品增绸剂、填充剂和

23、吸收剂等。糊精和麦芽糊精可用酸法和酶法生产，现在大多采用酶法水解的方法生产。2.3 酶在蛋白质食品生产中的应用蛋白酶是一类催化蛋白质水解的酶。来自微生物的蛋白酶主要是枯草杆菌蛋白酶、黑曲霉蛋白酶等。蛋白质在加酶水解之前必须经过一定的处理，以破坏其完整的空间结构，使其变性，以利于酶的水解。一般可以采用加热处理的方法。也可采用生化分离技术将蛋白质先提取出来，再进行酶解。用蛋白酶水解法生产氨基酸时，要根据所使用的蛋白酶的动力学特性，选择并控制好各种水解条件，使蛋白质完全水解成氨基酸。2.4 酶在果蔬食品生产中的应用在果蔬类食品的生产过程中，为了提高产量和产品质量，常常使用各种酶。常用果胶酶处理果汁、果酒、果胨、果蔬罐头等的生产。在果汁生产过程中，应用果胶酶处理，有利于压榨、提高出汁率。在沉淀、过