甘蓝叶片卷曲关联基因BoHB12和BoHB7的克隆与功能研究

1、甘蓝叶片卷曲关联基因BoHBI加口BoHB7的克隆与功能研究结球甘蓝(Brassicaoleraceavar.capitataL.),是十字花科芸薹属作物,简称甘蓝,是世界上最重要的叶用类蔬菜作物之一,在我国蔬菜生产与周年供应中具有重要的地位。甘蓝的营养生长经历幼苗期、莲座期和结球期,球叶向上向内卷曲生长,在结球期呈现半抱合状态。对多数植物来而言,叶片卷曲破坏了叶片的平展性,影响其叶片正常的生理功能包括呼吸作用、光合作用、蒸腾作用等,但对以叶球为食用器官的结球甘蓝等作物而言却是一种极有用的农艺性状。球叶的数量与卷曲程度直接影响结球甘蓝产品器官的单球重和叶球紧实度这两大商品性状。结球甘蓝叶球的形

2、成受内源激素、光照、温度、营养、水分等因素的影响,是一个在环境因素诱导下的基因调控下的复杂生物学发生过程。叶片向内向上卷曲是结球甘蓝结球的重要特征,这为研究结球甘蓝叶片卷曲的机制提供了材料。植物体接受外界信号刺激从而展开发育的关键环节是其基因的表达与调控,所以对结球甘蓝结球过程中叶片卷曲关联基因与其表达的研究,将有助于解析结球甘蓝结球的分子机制,并为利用分子育种技术培育高产优质的结球甘蓝品种提供理论依据。作为一类植物中与发育有关的重要转录因子,同源异型盒(homeobox,HB潼白最显著特征就是具有同源异型域(homeodomain,HD),它是由61或60个氨基酸组成的一个高度保守的结构域。

3、植物同源异型盒蛋白家族根据同源异型域序列和位置的差异,以及它两侧序列的同源性与其他保守结构域的不同,可以分为六大类,其中作为高等植物中特有的一类转录因子同源异型-亮氨酸拉链蛋白(HD-Zip),在植物细胞分化过程中有重要调控作用，HD-Zip又分I、H、m、IV四个亚类。已有研究发现拟HYL1 (HYPONASTICArabidopsisthaliana(L.)HeynhLEAVES1)M节HD-Zipin基因的表达是通过介导miRN林进行的，HYL1基因缺失突变体hyll表现叶片向内卷曲，增量表达PHBPHVREV3个HD-Zipm基因,说明HD-Zip类基因与叶片卷曲调控相关联。为了进一步

4、了解在甘蓝结球过程中球叶卷曲调控中同源异型盒基因的作用。本研究以结球性良好的519甘蓝品系为试材,从转录组测序出发,以同源异型盒基因为研究对象,通过甘蓝莲座期叶片与球叶形态和组织结构比较研究、与甘蓝结球过程中叶片卷曲相关的同源异型盒基因的克隆与分析、目的基因启动子GUSft达分析以及目标基因转化甘蓝的研究，阐述了同源异型盒基因在甘蓝结球过程中对叶片卷曲的重要调节作用。本研究主要获得了以下几个方面的结果：1.甘蓝莲座期叶片和结球期球叶的形态与组织结构比较通过同等大小的甘蓝莲座期叶与球叶的形态学观察,并且通过石蜡切片法对叶片不同区域部位组织结构进行细胞学观察,结果表明：相对于绿色有叶柄叶片平展的莲

5、座期叶片,甘蓝球叶浅黄色,无叶柄,叶片向上卷曲,叶形指数较小；相对于莲座叶,球叶的叶片厚度增加,叶片中叶肉细胞分化发育相对莲座叶延迟,只在叶片顶部区域分化发育出细胞排列紧密的栅栏组织和松散的海绵组织,叶片中部区域没有分化发育出栅栏组织和海绵组织,而莲座叶在叶片中部区域就已经分化发育出了栅栏组织和海绵组织。对甘蓝植株进行了高温胁迫和压叶处理后的球叶形态变化观察。结果表明：在自然状态下519甘蓝第34片叶为卷曲的球叶,而在30高温处理下和压叶处理后,第34片叶的形态变得更接近莲座叶。这说明了高温、光照等外界环境条件的变化对甘蓝的结球与叶片卷曲有影响。2. 通过转录组分析筛选出的甘蓝同源异型盒基因的

6、克隆与表达分析通过结球期茎尖和叶片以及莲座期茎尖和叶片的转录组分析,从中筛选出表达差异显著的4个HB类基因,分另I为BoHB12.BoHB7BoHAT2和BoHB27。进一步对上述4个基因以及调控拟南芥叶片卷曲但在结球甘蓝转录组中未检测到表达差异的BoPHBBoPHV和BoREV!行了同源克隆。序列分析表明上述7个基因都含有同源异型域,具有同源异型盒蛋白家族的典型结构特征。BlastP（蛋白序列与蛋白库做比对）表明它们与拟南芥的同源蛋白相似性高,来自结球甘蓝的BoHB12、BoHB7、BoHAT、2BoHB27、BoPHV、BoPHB、BoREVf拟南芥中的ATHB12ATHB7HAT2ATH

7、B27PHVPHBREV®白同源,它们的同源性分别为80%、79%、86%、60%、95%、94%和96%。BlastP比对和进化树分析结果表明，BoHAT2属于HD-ZipII类,BoHB12和BoHB7!于HD-ZipI类,BoHB27属于ZF-HD,BoPHBBoPH卡口BoREVi于HD-Zip出类。BoHB12BoHB7,BoHAT2BoHB27BoPHBBoPHVBoREVS结球甘蓝莲座期到结球期的茎尖和叶片中均有表达,BoHB12和BoHB7在结球期叶片中表达量显著增高,分别是莲座期叶片的38.1倍和6.2倍,其余基因表达量差异不明显,表明BoHB12ffiBoHBTW

8、能在结球甘蓝球叶自然卷曲过程中的起到了主效调控作用。3. BoHB12与BoHB7基因的启动子在转基因烟草中的表达特性分析本研究分别构建了BoHB12与BoHB7两个基因的启动子的含GUS艮告基因的植物表达载体pCABarBoHB12PGUSpCABarBoHB7PGUS,通过农杆菌介导转化获得了相应的烟草转基因植株。通过转基因植株的GUSfe色分析，结果表明，BoHB12的启动子在植株中在叶、茎部和根尖都有表达,而在幼叶中只在基部和叶尖表达,而且活性低；BoHB7勺启动子在植株中叶、茎和根部都有表达，在幼叶中活性较低。4. BoHB12BoHB7S因的甘蓝遗传转化研究在构建中间载体时，通过酶

9、切连接,同时将一个基因分两个方向随机插入到载体pBI525上,然后用其上游引物+NOS-的物进行PCFT增，鉴别该基因的插入方向，这就同时构建了一个基因的正义链中间载体和反义链中间载体。又通过酶切连接将正义链和反义链分别插入植物表达载体PCAMBIA1300-barh，构建了正义表达载体pCABarBoHB12ffipCABarBoHB7r反义表达载体pCABaranti-BoHB12和pCABaranti-BoHB7四个植物表达载体,并通过农杆菌介导和组织培养的方法转化获得了相应的甘蓝转基因植株（35S:anti-BoHB7转基因不定芽未能生根）。其中BoHBI农义基因转化获得的甘蓝35S:anti-BoHB12转基因植株的表型发生明显变化,莲座期叶片变小,叶面褶皱,叶片向下卷曲,不能形成叶球,与非转基因植株叶片完全不同。通过对35S:BoHB12转基因植株和35S:anti-BoHB12转基因植株莲座期叶片中的BoHB12、BoGA20ox、1BoGA20ox、2BoASA1、BoILL6、BoIAA12、BoTCP