皮质骨I型胶原的提取及胶原明胶支架材料的制备

1、皮质骨I型胶原的提取及胶原-明胶支架材料的制备【摘要】探讨一种较理想的皮质骨I型胶原的提取方式并制备胶原-明胶支架材料。方式以牛皮质骨为原料，经低温液氮粉碎、梯度脱水、脱脂、脱钙处置成为脱钙骨基质粉。通过酶溶解法处置脱钙骨基质粉，经溶解、离心、透析、冻干等步骤取得皮质骨胶原，SDSPAGE电泳、氨基酸分析等方式鉴定其特点；再以胶原、明胶通过冷冻干燥技术制备神经支架材料，扫描电镜观看其内部结构。结果所得胶原经SDSPAGE电泳、氨基酸分析等方式鉴定符合I型胶原特点；制备的支架材料外观呈圆柱状，内部为孔径均匀平行排列的微管结构，具有仿生成效。结论皮质骨中能够取得纯度较高的I型胶原，可用于胶原材料的

2、制作。【关键词】组织工程胶原提取神经支架Abstract：ObjectiveTodevelopanidealmethodforextractingtypeIcollagenfromcorticalboneandtoprepareacollagengelatinscaffold.MethodThecorticalbonewasdisintegratedintobonematrixpowderinahighspeedmillandwassubsequentlydehydratedinalcohol,decalcificatedinhydrochloricacidanddefattedinchlor

3、oform:methanol(1:1,v/v).Theosseinswereextractedusingimprovedpepsindigestionmethodafterthebonematrix powderwasdissolved,centrifuged, dialyzed andlyophilized.TypeIcollagenwasthencharacterizedbySDSPAGEandaminoacidcompositionanalysis.ThebiomaterialwasmadeoftypeIcollagenandgelatinusingfreezedryingmethod,

4、andthealignmentregularitiesofmicroscopicchannelsandtheircoursedirectionswereobservedunderthescanningelectronicsizeofthemicroporesandthefactorofporositywerealsomeasured.ResultThecollagenextractedwasconfirmedtobetypeIcollagenbySDSPAGEandaminoacidcompositionanalysis.Allthescaffoldslookedlikecircularcyl

5、inder,themicroscopicchannelswerearrangedinparallelmanners,andtheporesizesofthechannelswereuniform.ConclusionOsseinextractedfromcorticalboneisarealtypeIcollagenthatcanbeappliedintheconstructionofcollagenproducts.Keywords：tissueengineering;collagen;extraction;nervescaffold周围神经缺损后的修复再生和功能恢复一直是神经科学领域的难点

6、和热点。由于周围神经结构和功能上的特殊性，损伤后大多数情形下无法直接对拉吻合，自体神经移植又有诸多限制，因此寻觅一种神经替代物来修复缺损是十分必要的。最近几年来，随着组织工程技术的进展，用于神经修复研究的材料品种愈来愈多。目前I型胶原蛋白制品为组织工程修复神经研究中应用较多的生物材料之一EloI型胶原通常来自牛腱、鼠尾或皮肤，由于上述组织中含有大量其它种类的胶原和非胶原成份，提取及纯化工艺复杂。骨中I型胶原含量丰硕，占骨基质中有机成份的95%以上，本实验将传统的酶提取法加以改良，提取牛皮质骨中I型胶原并制备神经支架材料。1材料与方式骨基质粉的制备取新鲜牛长骨，去除软组织、骨膜、骨端松质骨及骨髓

7、，然后将皮质骨劈成骨块，乙醇（60%、70%、80%、90%）梯度脱水，液氮冷冻后放入高速组织粉碎机中，粉碎为直径2mm骨粉，持续搅拌下加入甲醇:氯仿（1：Lv/v）脱脂48h,每24h换脱脂液1次；mol/L盐酸脱钙84h,别离于第1二、3六、60h换脱钙液，脱钙终止后去离子水洗涤3次备用。胶原的提取将50g牛皮质骨基质粉浸在500mlmol/L冰醋酸和500mg胃蛋白酶混合溶液中，持续搅拌96h。待混合物变成无色、透明、粘稠液体后高速低温离心20min(10000r/min),以去除未溶解杂质。其上清即为液态粗制胶原。在上清中缓慢加入NaCL搅拌留宿，离心20min(15000r/min)

8、,去上清，沉淀物加入mol/L冰醋酸溶解，离心20min(15000r/min),取上清加入5mol/LNaOH调pH至，缓慢加入NaCl,搅拌留宿，离心20min(15000r/min),去上清,沉淀物加入mol/L醋酸中透析溶解，离心10min(15000r/min),去沉淀，上清装入透析袋中持续透析72h,每4h改换透析液1次。最终收成无色透明粘性液体，浓缩冻干。以上液体及操作在47进行。支架材料的制备称取样品150mg、明胶(Sigma公司)75mg溶于mol/L冰醋酸溶液,4条件下搅拌90min(18000r/min),负压抽真空后于4冰箱中留宿，充分混合成凝胶状悬浊液后将其注入长1

9、0cm、内径3mm的硅胶管中，密封两头，顺轴向以自制微型调速仪以2义10-5111/s的速度浸入冷凝剂中，将悬浊液-硅胶管冷冻物放入预冷的铝盘中，于-40、lOOmTorr条件中冻干48h,制得干燥成形的胶原蛋白支架材料2。材料用戊二醛交联，60C。消毒密封备用30胶原的鉴定取样品2Ug溶于420U1加样缓冲液（1mol/LTrisHC1缓冲液，10%SDS,2%筑基乙醇，50%甘油，微量滨酚蓝）留宿，100,5min,离心10min（12000r/min）,取上清20U1加样，进行SDSPAGE垂直平板电泳，浓缩胶5%,分离胶8%,电极缓冲液SDSTris甘氨酸系统，浓缩胶电压40V,分离胶

10、电压80V,%考马斯亮蓝R250染色，以牛腱I型胶原标准品（Sigma公司）作为对照。将冻干样品水解后，应用Beckman121MB型氨基酸自动分析仪进行氨基酸分析。用U2001紫外可见分光光度计测定胶原最大光吸收波长。支架材料内部扫描电镜观看以扫描电镜观看上述制备的胶原蛋白支架材料横截面和纵切面并测量材料内部微孔的直径。2结果选择适那时刻点换脱钙液，持续脱钙84h,可将骨粉中的钙离子含量降到较低水平（图1）。胶原样品鉴定结果提取的样品冻干后呈疏松的白色海绵状，具有吸潮性（图2）。SDSPAGE电泳结果显示，提取的胶原样品与I型胶原标准品相同（图3）0最大光吸收波长查验结果样品在230nm波优

11、势显示较强的光吸收,符合胶原特性。样品氨基酸分析结果甘氨酸占氨基酸总量的临羟脯氨酸占氨基酸总量的，脯氨酸占氨基酸总量的临羟脯氨酸与脯氨酸之比约，氨基酸组成比符合I型胶原特性（表1）。表1皮质骨磁针原氨基酸组成扫描电镜观看结果支架材料外观为表面封锁的圆柱状结构，电镜下见纵切面为轴向平行排列的微管结构，横切面上微管结构呈内径均一的蜂巢状散布，孔径在20100nm,接近于坐骨神经结构（图4、5）o3讨论最近几年来,应用组织工程技术构建种子细胞和具有良好生物相容性的支架材料复合体一一人工神经修复外周神经损伤成为研究的重点。人工神经研究的关键之一在于如何选择适合的支架材料，以便复合种子细胞、神经营养因子

12、从而更好的发挥促神经再生作用。目前，以天然的细胞外基质为原料制备支架材料成了研究的新方向。胶原是细胞外基质的要紧成份，普遍散布于骨、肌腱、韧带、皮肤、软骨等结缔组织中，约占动物体内蛋白质总量的1/41/3,在细胞的分化、运动化趋向、结缔组织修复等方面发挥重要作用，同时具有生物可降解性、低抗原性、低毒性、能诱导细胞再生及易取得性等诸多优势，可参与组织愈合进程，在软骨细胞再生诱导4、角膜移植:51人工皮肤制备6等方面取得普遍应用，应用在周围神经损伤修复中亦能刺激改善神经的再生7。图1钙离子浓度转变图2冻干样品图3样品电泳图谱图4扫描电镜下观看支架材料横切面(X400)图5扫描电镜下观看支架材料纵切

13、面(X200)以往胶原的提取多集中在相对易于处置的牛腱、猪皮和鼠尾腱。由于胶原是一个大的蛋白家族，从上述组织中提取时分型、纯化难度较大,程序复杂，而且耗时较长，易致使胶原变性。骨胶原的提取纯化报导较少，而骨中有机质90%以上为胶原，要紧为I型胶原，有望作为制备I型胶原的重要来源。作者将传统的酶溶解法加以改良应用于骨胶原的提取，在骨粉颗粒直径、脱脂脱钙时刻、酶促溶解、抽提次数等方面加以细化，省去分型、纯化等冗长程序，耗时较短，经济简便。I型胶原的氨基酸组成中，甘氨酸约占氨基酸总量的1/3;含有羟赖氨酸和羟脯氨酸，一样蛋白质中那么不存在羟赖氨酸，羟脯氨酸也很少见;羟肺氨酸与脯氨酸之比约为。本实验样

14、品胶原氨基酸分析符合工型胶原的组成特点，最大光吸收波长在230nm周围，电泳分析其区带与I型胶原标准品区带相同。结果显示，作者通过实验取得了纯度较高的I型胶原。作者以实验取得的I型胶原和明胶为要紧原料，构建了具有微管排列结构的支架材料，其内径在20100Um,三维结构上接近于坐骨神经，具有必然的仿生成效。实验说明8,将具有增进轴突再生功能的骨髓基质干细胞(BMSCs)种植在支架材料并共培育后，细胞黏附在支架材料内部，生长状况良好，显示支架材料具有良好的生物相容性。综上所述，作者制备的皮质骨胶原，具有较高的纯度，并可用于胶原蛋白材料的制备，具有较好的有效价值。参考文献:【参考文献】1蒋挺大.胶原

15、与胶原蛋白门.北京：化学工业出版社，2006,242-245.2 EtohS,TakakudaK,KawabataK,etal-EvaluationofcrosslinkingproceduresofcollagentubesusedinperipheralnerverepairJ.Biomaterials,2002,23：4475-4481.3梁伟，罗卓荆，王树森，等.修复神经缺损的组织工程支架材料的研制及其生物相容性研究J.中华创伤骨科杂志，2004,9：1037-1041.4 WahlDA,SachlosE,LiuC,etal.Controllingtheprocessingofcollagenhydroxyapatitescaffoldsforbonetissueengineeringj.JMaterSciMaterMed,2007,2：201-209.5 LiuY,GanL,CarlssonDJ,etsimple,crosslinkedcollagentissuesubstituteforcornealimplantationJ.InvestOphthalmolVisSci,2006,5:1869-1875.6 IsmarulIN,IshakY,IsmailZ,etal.Characterizationofcollagen/chitosanfilmsf