Protocol蛋白质纯化步骤

1、Protocol蛋白质纯化方法（锦柱）柱前操作1.IPTG 诱导后，收菌，8000rpm/min（r/m）离心 10min;2 用 BindingBuffer（BB）溶解（每100ml 原菌液加 BB20ml）,超声裂解 30min（工作：5s 停止：5s）,1500r/m 离心 10min,去除杂质；3.取上清，12000r/m 离心 20min,得包涵体；4.用含 2M 尿素的 BB 洗包涵体，12000r/m 离心 20min,（上清做电泳）；？5.用含 6M 尿素的 BB 溶解包涵体，12000r/m 离心 20min,（上清做电泳）；6. 对照电泳结果，将上清或包涵体溶解液上柱；平衡

2、柱子（柱体积：V）7. 3V（3 倍柱体积）ddH2O（洗乙醇）；8. 5VChargeBuffer（CB）;?9. 3VBB;柱层析10. 上样;11. 10VWashingBuffer（WB）；12. 6VEluteBuffer（EB）;13. 分管收集，每管 12ml.各种缓冲液配方1.8BB:4MNaCl,160mMTris-HCl,40mMimidazole（咪坐）,pH=7.91000mlNaCl:58.444=233.76gTris-HCl:121.1416W0-3=19.3824gImidazole:68.0840*0-3=2.7232g2. 8CB:400mMNiSO4100

3、0mlNiSO4:262.8400M0-3=105.12g3. 8WB:4MNaCl,160mMTris-HCl,480mMimidazole,pH=7.91000mlNaCl:233.76g,Tris-HCl:19.3824g,Imidazole:32.6784g4. 4EB:2MNaCl,80mMTris-HCl,4Mimidazole,pH=7.91000mlNaCl:118.688g,Tris-HCl:9.6912g,Imidazole:272.32g5. 6M 尿素1000ml尿素：60.066=360.36gNi 柱纯化蛋白注意事项(2011-10-1316:01:39)使用 Ni

4、 柱纯化带有 His 标签的融合蛋白，是我们大家再熟悉不过的实验操作了。我们对整个操作的流程及注意事项，很可能是师从兄师姐那里获得的。这些经验都是大家智慧的结晶。同时，这也有一定的不足之处，那就是我们学习到的是局部，还有一些我们不常用或者基本不会接触到的面儿，那些知识我们应该从哪里掌握呢？给大家推荐一个办法，那就是参考那些大公司的实验手册。一般像 GEQiagen 等知名公司，都有 Ni 柱柱材料的产品，因此关于柱材料的各种性质参数，以及使用方法和注意事项都有详细的说明。下面我就列举一些我从这些实验手册里总结出来的一部分 Tips,仅供参考。1 .避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH

5、4 甘氨酸，精氨酸，Tris,等等;2 .各种缓冲液中不能有强螯合剂，如 EDTAEGTA 等等；3 .各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，比如 DTT 防止二价 Ni 被还原；4 .不能含离子型的去垢剂，比如 SDS 防止 Ni 流失；5 .在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如 0.1-1mM 的 PMSF 防止目的蛋白被降解；6.缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达 50%(v/v7 .应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质；8 .缓冲液里 NaCl 的浓度应在 300mMiU2M 之间；9 .可加入变性剂促溶，盐酸胴(最高可 6M,尿素(最高可

6、 8M10 .可加入非离子型去垢剂，如 Triton,TweenNP40 等，最高 2%可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染；？Ni 柱纯化 His-tag 蛋白质一非变性条件下抽提 His-Tag 蛋白质下列方法适用于从细菌中抽提通常含有连续 6 个组氨酸尾(HisTagProtein)的具有天然结构的可溶性重组蛋白质(NativeProtein)。 其他来源的蛋白质样品，如果目标蛋白质具有 His-Tag结构，提供的层析方法可供参考。1）准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的 pET 载体表达系列，在细胞 OD600=0.5-0.8 时，用 1mMIPTCW 导 1-3 小时，可以获得理想

7、的表达效率。收集细胞，置于-70 度或立即进行步骤 2 操作。2）加入 1/20 细胞生长体积的 NTA-0Buffer（20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol）和 PMSFPMSIffi 无水乙酉 I 配制成 200mM 储存液，-20 度或 4 度保存；PMS 梗用的工彳住衣度位1mM 注意：PMSF 见水分解，需要在使用前加入。该步骤冰上操作。3）将细胞悬浮起来，加入溶菌酶（工作浓度位 0.2-0.4mg/ml,如果表达的宿主细胞内含 pLysS 或 pLysE,可以不加溶菌酶），混匀，冰上放置 30 分钟，超声或匀浆破碎细胞。该步骤冰上操作。4）力

8、口入 10%TritonX-100,使 Triton 的终浓度为 0.05%,充分混匀，冰上放置 15 分钟，间或混匀）；冰上超声破碎细胞，同时降低粘稠度。5）加入 1MMgCl2 使 MgCl2 的终浓度为 1mM 混匀。加入 DNase,使DNaseW 终浓度为 10mg/ml,混匀，室温放置 10 分钟。？6）5000 转/分（20,000 xg 以上），4 度离心 15 分钟以上。取上清，置于冰上备用或-20 度保存。2.层析1）将 NTA 树脂装入合适的层析柱，层析用 10 倍 NTA积的 NTA-0Buffer洗。2）将样品（步骤 2）加到 NTA!析柱中，流速控制在 15ml/小

9、时左右，收集穿透部分，用于 SDS/PAG 分析蛋白质的结合情况。3）层析用 5 倍 NTA 体积的 NTA-0Buffer 洗，流速控制在 30ml/小时左右。4）分另 U 用 5 倍 NTA 体积的NTA-20,NTA-40,NTA-60,NTA-80,NTA-10QNTA-200,NTA-1000Buffer 洗脱，流速控制在 15ml/小时左右，收集洗脱液，每管收集一个 NTA 体积。5）确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是 SDS/PAG分析。 也可以用 BBST 勺 Bradford 蛋白质测定试剂盒， 快速确定蛋白质的含量，然后用 SDS/PAG 分析蛋白质的分布

10、。6）目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。附溶液配方：NTA-0Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,NTA-20Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,20mMmidazole（咪口坐）NTA-40Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,40mMmidazole（咪口坐）NTA-60Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glyce

11、rol,60mMmidazole（咪NTA-80Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,80mMmidazole（咪口坐）NTA-100Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,100mMImidazole（咪口坐）NTA-200Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,200mMImidazole（咪口坐）NTA-1000Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,1000mMmidazole（

12、咪噪）二变性条件下从包涵体中纯化 His-Tag 的蛋白质有些蛋白质细菌或其他细胞中表达效率很高，但溶解性很差，通常形成包涵体。这些蛋白质的溶解通常需要用盐酸服或尿素。与 MB 所口 GST勺亲和层析材料相比，NTA 树脂可以在 6M 的盐酸服存在的情况下与具有HisTag 的蛋白质结合。 整个层析过程都是在有盐酸服的条件下进行。 纯化后的蛋白质需要进行复性，正确复性的蛋白质才具有生物学活性。下列方法（步骤 4-5）用于从细菌中抽提含 His-Tag 位于包涵体变性蛋白质。1）准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的 pET 载体表达系列，在细胞 OD600=0.5-0.8 时，用 1mMIP

13、TCW 导 1-3 小时，可以获得理想的表达效率。收集细胞，置于-70 度或立即进行步骤 2 操作。2）加入1/20细胞生长体积的GuNTA-0Buffer（ 20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,6MGuanidiumHCl ） 和PMSFPMSFffi 无水乙醇配制成 200mMW 存液，-20 度或 4 度保存；PMS梗用的工作浓度位 1mM 注意：PMS 现水分解，需要在使用前加入。3）将细胞悬浮起来，冰上超声破碎细胞，降低粘稠度。4）室温放置 30 分钟，间或混匀或用磁力搅拌。5）15000 转/分（20,000 xg 以上），4 度离心 15

14、 分钟以上。取上清，置于冰上备用或-20 度保存。2.层析1 ） 将 NTA 树 脂 装 入 合 适 的 层 析 柱 ， 层 析 用 10 倍 NTA 体 积 的GuNTA-0Buffer 洗。2）将样品（步骤 2（5）加到 NTA!析柱中，流速控制在 15ml/小时左右，收集穿透部分，用于 SDS/PAG 分析蛋白质的结合情况。3）层析用 5 倍 NTA 体积的 GuNTA-0Buffer 洗，流速控制在 30ml/小时左右。4）分别用5倍NTA体积GuNTA-20GuNTA-40GuNTA-60GuNTA-100GuNTA-50 酰脱，流速控制在 15ml/小时左右，收集洗脱液，每管收集一

15、个 NTA 体积。5）确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是SDS/PAG 分析。也可以用 BBS 晒 Bradford 蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用 SDS/PAG 分析蛋白质的分布。6）目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。7）纯化的目标蛋白质需要复性，复性常用的手段可以参考有关手册确定的原则，根据蛋白质的特性来摸索具体的方案。附溶液配方:GuNTA-0Buffer:GuNTA-20Buffer:20mMImidazoleGuNTA-40Buffer:40mMImidazoleGuNTA-60Buffer:60mMImidazoleGuNTA-1

16、00Buffer:100mMImidazoleGuNTA-500Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,6MGuanidiumHCl20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,6MGuanidiumHCl,20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,6MGuanidiumHCl,20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,6MGuanidiumHCl,20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,6MGuani

17、diumHCl,20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,6MGuanidiumHCl,500mMImidazole附：NTA 树脂的再生NTAW 脂在使用若干次数(3-5 次)后，结合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高树脂的使用寿命和蛋白质的结合效率。注意：NTA树脂再生前需要从层析柱下端流干所有溶液，估计出 NTA 的树脂体积，按下列次序将再生试剂加到层析柱里，在等上一再生溶液流干后，再加下一再生溶解。 用户需要自行准备 25%,50%,75%,100%(v/v)乙醇和去离子水。NTA 再生步骤：(1)从层析柱下端流干所有溶液，用 2 倍 NTA 树脂体积的 0.2MAceticAcid/6MguanidineHCl 洗。(2)用 2 倍体积的去离子水洗。(3)用 3 倍体积的 2%SDS 洗。(4)用 1 倍体积的 25%乙醇洗。(5)用 1 倍体积的 50%乙醇洗。(6)用 1 倍体积的 75%乙