基因工程问答题整理

1、名解抗体：B 细胞在抗原的刺激下分化为浆细胞，产生具有与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白，称为抗体。Fab:用木瓜蛋白酶将IgG分子断裂的3个大小相似的片段中能与抗原结合的2个片段Fc：用木瓜蛋白酶将IgG分子断裂的3个大小相似的片段中不能与抗原结合的1个片段免疫球蛋白：具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白。超变区：重链和轻链的V 区各有三个区域的氨基酸组成和排列顺序特别易变化，称为超变区可变区：重链和轻链靠近N 端的约 110 个氨基酸的序列变化很大，称为可变区单克隆抗体：由一个克隆细胞产生、只作用于某一抗原决定基的均一抗体。借助小鼠B 细胞杂交瘤技术，所制备的高度

2、均一（属同一类、亚类、型别）、单一特异性（仅针对特定抗定抗原表位）的抗体ADCC抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，表达Fc受体的细胞通过识别抗体的Fc段直接杀伤呗抗体包被的靶细胞。调理作用：抗体，补体等调理素促进吞噬细胞吞噬细菌等颗粒性抗原的作用J 链：一条由浆细胞合成的富含半胱氨酸的多肽链，可连接Ig 单体形成的二聚体，五聚体或多聚体分泌片：分泌型IgA的一个辅助成分，由粘膜上皮合成，连接IgA二聚体上，使其成为分泌型，保护其铰链区免受蛋白水解酶作用，介导其转运到粘膜表面Ig功能区：Ig分子的每条肽链可折叠为几个功能不同，结构相似的球形功能区， 或称结构域Ig折叠：由几股多肽链折叠形成的 2

3、个反向平行的3片层结构，2个片层结构中心的2个半 胱氨酸残基由一个链内 2硫键垂直连接，可稳定结构域，形成一个3桶状结构，这种折叠方 式称为免疫球蛋白折叠。CDR互补性决定区，即高变区（超变区）Ig:免疫球蛋白同种型：同一种属内所有个体共有的Ig抗原特异性标记同种异型：同一种属不同个体间Ig 分子所具有的不同抗原特异性标志。由若干散在分布的氨基酸序列差异导致。独特型：每一个Ig分子在CDR区氨基酸序列所显示出的免疫性，是每一个Ig分子所特有的抗原特异性标志。多克隆抗体：用含多种抗原决定簇的抗原物质免疫动物，刺激多个B 细胞克隆所获得的免疫血清（含多种抗体的混合物），此为多克隆抗体单克隆抗体：同

4、7基因工程抗体：根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。嵌合抗体：人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。改型抗体：CDR 移植即把鼠抗体的CDR 序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称 CDR 移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。表面重置：对鼠CDR 及 FR 表面残基进行镶饰或重塑，使之类似于人抗体CDR 的轮廓或人FR 的形式补偿交换：在人FR 中选择与CDR 有相互作用，与抗体的亲和力有密切关系或对FR 空间

5、结构折叠起关键作用的残基进行改变，以补偿完全的CDR 移植镶面抗体：以抗体为参照改造替换鼠源单抗的表面氨基酸残基得到的抗体单链抗体：用一编码亲水易折叠多肽的人工合成寡核甘酸，将重链 V区（3，）与轻链V区 （5，）端连接在一起即成单链抗体基因，将此基因克隆入原核或真核表达载体中，在原核或真核系统中表达出的蛋白质即为单链抗体双特异型抗体：能同时识别 2种抗原的抗体。1种为对应肿瘤相关抗原。另 1种为对应效应 成分。即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞，小分子抗体：包才Fab、Fv或ScFv单域抗体及最小识别单位等几种分子量较小的抗体片段。 单链抗体：见27最小识别单位：约为完整分子的1

6、/80-1/70大小，一般由一个 CDR构成，它也保持着抗体的特异性，是比单域抗体更小的分子，仍能与抗原结合，只是亲和力相当低 噬斑印迹：将菌落或噬菌斑直接转移到滤膜上，使溶菌抗体暴露，同标记抗原杂交进行杂交检测，杂后根据杂交信号及其相对应的菌落或噬菌斑的位置，杂交便可从大量菌落或噬菌斑中筛选出含有目的基因的噬菌斑。质粒展示技术：是以“蛋白-DNA复合物”形成为基础，将随机多肽与DNA结合蛋白以融合蛋白的形式表达，通过筛选可以得到目的蛋白及其编码基因序列，融合蛋白在相对还原的 E.coli菌的细胞质内表达和折叠，体内融合蛋白结合于编码质粒的DNA序列上，从而实现目的蛋白“表型-基因型”的结合。

7、 疫苗：是一类接种后能激发人体免疫反应来抵抗某些传染病的生物制品灭活疫苗：灭活疫苗又称死疫苗，是指利用加热或甲醛等理化方法将人工大量培养的完整的 病原微生物杀死，使其丧失感染性和毒性而保持其免疫原性，并结合相应的佐剂而制成的疫苗。 弱毒疫苗：减毒活疫苗又称弱毒疫苗，是指将微生物的自然强毒株通过物理、化学和生物学的方法，连续传代，使其对原宿主丧失致病力，或只引起亚临床感染，但仍保持良好的免疫原性、遗传特性，用这种毒株制备的疫苗就叫减毒活疫苗。 合成多肽疫苗：合成肽疫苗是指使用化学方法合成能够诱发机体产生免疫保护的多肽制成的 疫苗。 亚单位疫苗：亚单位疫苗是指提取或合成细菌、病毒外壳的特殊蛋白结构

8、，即抗原决定簇制成的疫苗，这类疫苗不是完整的病毒，是病毒的一部分物质，故称亚单位疫苗。基因缺失疫苗：使用分子生物学技术去除与毒力有关的基因获得的缺失突变毒株制成的疫苗 重组活载体疫苗：基因工程载体疫苗是指利用微生物做载体，将保护性抗原基因重组到微生物体中，使用能表达保护性抗原基因的重组微生物制成的疫苗。核酸疫苗：指使用能够表达抗原的基因本身，即核酸制成的疫苗。定向突变：采用随机的基因突变或基因重组技术与定向的突变体筛选方法相结合得到分子进 化技术，包括制备突变体文库，突变体文库在适当的表达系统内表达，筛选突变体 盒式诱变：将靶基因的一段 DNA删掉，并用人工化学合成所具有的突变核甘酸的双链寡核

9、 甘酸片段取代 一、名词解释1 .基因：基因-有遗传效应的DNA片段，是控制生物_性状的基本遗传单位2 .基因工程：是以分子因传学为理论基础,以分子生物学和微生物学的现代方法为手段,将 不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子、然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品 3.操纵子4 .何谓接头连接法？DNA接头是一类由人工合成的一头具有某种限制障识别位点的黏性末端，而另一头为 平末端的特殊的双链寡聚植甘酸危片段*当它的平末端与外源DNA片段的平末端连接之 后.就使外源DNA形成具有辄性末端的新的DNA分子，而就于起髅重组”5 .质粒：能自主复制的染色体外

10、 DNA分子，为双链环状，广泛存在于细菌及某些蓝藻、绿 藻和真菌细胞中。6 .限制性核酸内切酶：可以识别 DNA的特异序列，并在 识别位点 或其周围切割双链 DNA的 一类内切酶，简称限制酶7 .PCR :聚合酶链式反应8 .RT-PCRRT-PCR是指以由mRNA逆转录得到的cDNA第一健为模板的PCR反叽这种方法是 一种比较简便易存的分离制药基因的手段,它不需要构建文库，不艘历经漫长的筛选、鉴 定等一系列过乱它的基本原理黑以mRNA为模札IS oligo （dT）为引帆在逆转录爵 的傕化3在体外合成山NA第一集后，在基因（或RNA）序列已知的情况下，设计特定 的引物，通过PCR投靴命便可以

11、蒙得制药基因产帆9 .CDNA文库以mRNA为模板，经反转录酶催化,在体外反转录成 cDNA,与适当的孩隹（常用噬菌体或 质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的 cDNA文库。10 .报告基因：载体分子上有一种特殊意义的基因序列，它们表达的目的是为了证明载体已 经进入宿主细胞，并将含有外源基因的宿主细胞从其他细胞中区分并挑选出来。这种基因就是报告基因。11 .载体:具备自我复制能力的 DNA分子。12 .克隆载体：可携带插入的外源 DNA片段并可转入受体细胞中大量扩增的 DNA分子。该分 子中含有能

12、够在受体细胞中自主复制的序列和筛选标记，常用于外源基因的克隆， 如噬菌体或质粒。13 .表达载体： 在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS终止子等），使目的基因能够表达的载体。14 .转化：某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。15 .转染：真核细胞由于外源 DNA掺入而获得新的 遗传标志的过程。16.质粒载体在由限制性核酸内切酶 修饰过的质粒 DNA序列中插入外源的 目的基因，以质粒为载体，将 目的基因通过转化或转导的方法导进 宿主细胞，进行重组、筛选、扩增的过程。18 .粘性末端：当一种 限制性内切酶 在一个特

13、异性的 碱基序列处切断DNA时，就可在切口处 留下几个未配对的 核下酸片段，即5'突出。这些片断可以通过重叠的 5末端形成的 氢键相连, 或者通过分子内反应环化。因此称这些片段具有粘性，叫做粘性末端。19 .启动子：启动子是位于结构基因 5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板 DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。20 .增强子：增强子（enhancer）指增加同它连锁的基因转录频率的DNA序列21 .选择标记22 .病毒载体（=噬菌体）23 .亲和层析：是一种吸附层析，依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离的。24 .包涵体：是指细菌表达

14、的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。25 .核糖体结合位点：是细胞 mRNA的一个序列，它包括蛋白质合成起始期被30S亚基结合的一个起始密码子 。26 .菌落原位杂交（3）菌落（或噬菌斑）原位杂交（in situ hybridization）符转化细胞培养在琼脂平板 上.当形成菌落（或噬菌扭）后，再将硝酸纤维滤膜贴在平板上，使崩落（或噫豳斑）转印 到硝酸纤维滤膜上c翻转此滤膜并置F另一不含菌的平板上培养，培养后的值膜上可长出菌 落（或噬菌癌八取出滤膜，用裂解液处理使菌体裂解1释放出DNA.再用碱处理，使 DMA变性,经烘烤将变性DNABI定于源膜上.然后用放射性同位素标记的核酸探针进行

15、分子杂交，并经放射自显影，黑点代表杂交上的菌落，即可筛选到阳性克随.通常影卬的滤 腆必须有双份,在一张滤膜上找到阳性克窿后，可在另一光滤膜的相应位置上找到活的细菌 （或噬菌体）克隆.此法优点是可在短时间内从成千上万个克隆中筛选到阳性党建.27.Southern印迹杂交 （4） Souths 口印迹杂交法乂林为凝胶电冰压印杂交技术，是SoutKmF1975年建立 的，它的大致it程为：先进行限制性内切醐酶切待检测的DNA,然后进行琼脂精凝胶电林a 电泳完毕后，将觥胶放入碱性溶液中，使双链DMA变性t解寓为两条单琏，再在雌胶上贴 益硝酸纤维素膜.便凝股上的单耗DNA条带按原来的位置E）到膜上，再将

16、此膜置于含有同 位素标记的核酸探针的杂交液中.按照减基互补配对原理，如果被校测的DNA与核酸探针， 具有互补序列,就能在被检测的DNA区带部位结合成双链的杂交分子.并通过放射自显影 显不出来*28 .Western印迹：Western免疫印迹（WesternBlot）是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体 进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测29 .核酸分子杂交：核酸分子杂交（简称杂交，hybridization ）是核酸研究中一项最基本的实 验技术。互补的核技酸序列通过 Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分

17、子 的过程称为杂交。30 .转化子：转化后的受体菌，称转化子31 .融合蛋白：融合蛋白（fusion protan）是指山克隆在一起的两个或数个不同基因的编码序列组成的 髓合基因转译产生的单一的多肽序列。32 .选择标记33 .整合表达系统：基因整合到基因组中发生的表达。34 .瞬时表达系统：外源基因进入受体细胞后，未整合进受体细胞基因组而立即转录，出现 基因产物。35 .融合标签：融合标签技术是 20世纪末兴起的一种基因重组技术，其主要过程是利用重组DNA技术在靶蛋白编码基因的 3端或5端融合某种标签的编码基因，通过适宜的宿主来表 达重组蛋白质，表达的重组蛋白质可以通过融合的标签与包被在固相

18、基质上的特异配基结合 而进行纯化。36 .抗生素表型法：由于载体含有抗性基因，当转化后宿主细胞即获得该抗性基因的特性，因而可以在涂有该抗生素的培养基上可以生长。否则，不能生长。37 .插入失活法：若把外源 DNA片段插入到载体的选择标记基因中而使此基因失活，丧失其 原有的表性特征，此方法叫插入失活。标记基因多为抗生素抗性基因。鎏小膜健眦髓料脚附N部彼飕 丽 顺频PTR262肛个趣跚涮如螭鸵饰肪脚中航微曲di毓 酬|樽|懈 WTclOWteflS (leII38.插入表达法3el）BMSWBt幅翩翻斶机幡蒯麻髀肿喘施需 岫捕靠版棉触躺麻靴艘脚购流旗幢39 .蓝白筛选法：蓝白斑筛选 是重组子筛诜的

19、一种方法：是根据载体的遗传特征筛选重组子，如“-互补、抗生素基因等40 .Klenow片段：Klenow片段，又名 DNA聚合酶I大片段（克列诺片段，Klenow fragment,或称克列诺酶，Klenow enzyme）: E.coli DNA聚合酶I经胰蛋白酶或 枯草杆菌蛋白酶 部分水 解生成的C末端605个氨基酸残基片段。该片段保留了 DNA聚合酶I的5-3聚合酶和3-5, 外切酶活性，但缺少完整酶的523夕卜切酶活性。41 .T4 DNA连接酶：编号：EC 6.5.1.1。来自感染T4噬菌体的大肠杆菌，催化双链DNA平头末端或黏性末端相邻核酸的5'-PO4和3'-OH

20、连接反应的酶，还可催化双链RNA和双链RNA或DNA连接，但不能催化单链核酸的连接。可修补在双链 DNA、RNA或DNA/RNA杂种分子中的单链切口。42 .Strep 标签43 .Flag 标签44 .钙调蛋白结合肽简答题Race技术的原理（已有）cDNA末端快速扩增 （rapid amplification of cDNA ends,RACE）技术是一种基于 mRNA反转录 和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点 ，扩增基因转录本的未知区域，从而获 得mRNA（cDNA）完整序列的方法。如何构建改性抗体答：抗体的抗原结合区域（V）与空间结构主要由抗体 V区中3个CDRS（互补决

21、定区）所决 定，所以这一抗体的构建是用原鼠IgV区中的CDR区插入到人IgV的框架区。为了构建这类抗体，首先需要测出MabV区的核甘酸序列，根据其中的CDRS列，用全合成或点突变的方法将人 Ig重构成MabV区的CDR/列，然后将这种重构的 V区基因与人IgC 区基因连接，构成完整的人Ig基因，再于骨髓瘤细胞内表达。方法：模板替换：同源FR表面重塑：人 CDR FR轮廓补偿替换：在人FR中选择残基进行变换表面展示：重链10个，轻链4个原则：维持原抗体构像：同源序列框架区影响抗原结合氨基酸CDR两侧的框架区序列N末端序列3简述免疫球蛋白的结构功能区及作用具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统

22、称为免疫球蛋白。可变区：识别并特异性结合抗原恒定区：1激活补体系统2结合FC受体3穿过胎盘与粘膜（不具体）图沙6 免疫球黄百的功能区比较4简述单克隆抗体基本原理由一个克隆细胞产生、只作用于某一 抗原决定基的均一抗体单克隆抗体的制备ImnTnSiw5木过蛋白酶和胃蛋白酶水解片段有何异同1 .木瓜蛋白酶水解Fab Fc2 .胃蛋白酶F (ab') 2pFc6激活补体的能力：IgM大于IgGIgM为五聚体，IgG为单体，M比G多一个功能区 CH47比较单抗与多抗单克隆和多克隆抗体的比较和用途1、用于免疫学检测，辅助临PcAbMcAb床诊断特异性低2、McAb用于亲和层析，分敏感性差强离微量可

23、溶性抗原均一性无有3、标记的McAb用于基础研究，了解细胞分化等4、制备生物导弹用于肿瘤、移植等的临床治疗8如何构建单链抗体用一编码亲水易折叠多肽的人工合成寡核甘酸，将重链 V区（3"）与轻链 V区（5,）端 连接在一起（VH-linker-VL）即成单链抗体基因， 将此基因克隆入原核或真核表达载体中，在原核或真核系统中表达出的蛋白质即为单链抗体（single chain antibodies ）总RZARH/lr淋巴细胞或杂文制铀咆等1烛转求合成。I3ZA第一绘钛加入PUR扩用叮|柳混自叫物下扩增斤I：体霞、晓雎町火区蟠优I1将、ML塔因克降入枕体中.并陋序 =用（。0小"

24、;人连接门本姑田;|蒂MU、511用带道为醐助I位点的小物犷照：SMy.1等PC也产物酶切件与羟过对|司处理的技体世彳连接I连相产物耨化入肠打侬一，却造Ml件克降I5d全许列的测定图3-2。构延g链抗体的流程示总9如何构建单链抗体抗体库噬菌体抗体库噬菌体表达小分子抗体口建立噬菌体抗体库ScFv Fab Fv+Fd固相化抗原口吸附=洗脱 p扩增10.噬菌体表面展示技术噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的 DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。核糖体展示技术将正确折叠的蛋白及其 mRNA同时结

25、合在核糖体上，形成mRNA-核糖体-蛋白质三聚体,使目的蛋白的基因型和表型联系起来，可用于抗体及蛋白质文库选择、蛋白质体外改造等。11如何利用细菌战士技术筛选高亲和力抗体外源蛋白与载体蛋白结合方式? C端融合（N端锚定在外膜）? N端融合（C端锚定在外膜）?夹心融合（有些蛋白本身具有信号肽序列及锚 定于外膜的序列，内部合适位点插 入外源蛋白）亲和筛选分为固相筛选和液相筛选，主要有ELIS母口磁珠 法。Hanes等认为,ELIS防法中，抗原包被在塑料 表面上，而塑料表面的疏水作用有可能会影响吸 附蛋白的空间构象，从而导致筛选出的抗体分子 不能识别抗原的天然表位；磁珠法是在抗原上连接 捕获标签，如

26、生物素，然后在形成抗原-抗体复合 物后,采用磁珠-链霉亲和素捕获该标签，进行亲和 筛选。12基因工程疫苗的优点及缺点和研发方向(') 基因工程疫苗 gene engineering vaccine基因工程疫苗，也称遗传工程疫苗( geneticengineering vaccine),指使用重组 DNA技术克隆并表达保护性抗原基因，利用表达的抗原产物 ,或重组体本身制成的疫苗。主要包括基因工程亚单位疫苗，基因工程载体 疫苗，核酸疫苗，基因缺失活疫苗，及蛋白工程 疫苗等五种。1、基因工程亚单位疫苗(gene engineeringsubunit vaccine基因工程亚单位疫苗，主要是指

27、将基因工程表达 的蛋白抗原纯化后制成的疫苗。优点：产量高；纯度高；安全性高；用于病原体难于培养或有潜在致癌性，或有免 疫病理作用的疫苗研究。缺点：与传统亚单位疫苗相比，免疫效果较差增强其免疫原性的方法：调整基因组合使之表达成颗粒性结构是在体外加以聚团化，包入脂质体或胶囊微球加入有免疫增强作用的化合物作为佐剂( adjuvant )2、基因工程载体疫苗 (gene engineering vector vaccine基因工程载体疫苗是指利用微生物做载体，将保护 性抗原基因重组到微生物体中，使用能表达保护性抗 原基因的重组微生物制成的疫苗。优点：疫苗多为活疫苗，重组体用量少，抗原不需纯化，载体本身

28、可发挥佐剂效应增强免疫效果缺点：曾感染过腺病毒或者接种过痘苗的人，对载 体微生物已具有免疫力，使之接种后不易繁殖，因而 影响免疫效果。3、核酸疫苗(nucleic acid vaccine)核酸疫苗或称基因疫苗(gene vaccine)，指使用能够表达抗原的基 因本身，即核酸制成的疫苗。一种或多种抗原编码基因克隆到真核表达载体上，将构建的重组质粒直接注入到体内而激活机体免疫系统。优点(1)抗原合成和递呈过程与病原的自然感染相似，这是灭活疫苗和亚单位疫苗不能比拟的。(2)便于制备多价疫苗。(3)引起广泛的细胞免疫和体液免疫。(4)避免了病毒本身毒力返租和整合到宿主染色体。(5)易于构建和制备，

29、稳定性好 .(6)成本低廉，适于规模化生产。缺点：(1)被注射的、可由宿主吸收的 DNA有可能被整合到宿主的染色体中，并引起插入突变。尽管这种概率很低；(2)外源抗原的长期表达可能导致不利的免疫病理反应；(3)使用编码细胞因子或协同刺激分子的基因可能具有额外的危害；(4)有可能形成针对注射 DNA的抗体和出现不利的自身免疫紊乱；(5)所表达的抗原可能产生意外的生物活性。解决这些安全问题是研究核酸疫苗的焦点。研发方向：急需研制的基因工程病毒疫苗急需研制的基因工程病毒疫苗主要有十几种值得使用基因工程技术进行改造的传统病毒疫苗病毒基因工程疫苗主要集中在研制常规技术不能或很难解决的新疫苗和改造免疫保护

30、效果差，负反应较大，或成本较高，或使用不方便的传统疫苗上，有的疫苗兼有预防和治疗两种功能(3) AIDS苗研究方向：能诱发有效的中和抗体，阻止或大部分 阻止HIV感染免疫细胞；能诱发强细胞免疫；中和抗体屏障被部分突破时能有效清除 被感染细胞，是研究中应统筹考虑的。(2)研制方向：使用含前 S (主要是前SD的新一代乙肝基因工程疫苗，可使对现有S乙肝疫苗无反应的人群产生良好的免疫反应。目前，含前S的疫苗，新佐剂乙肝疫苗，乙肝抗原抗体复合物疫苗，治疗性乙肝研究的热点。研究方向；使用病毒外膜蛋白 E1+E2研制病毒样颗粒的亚单位疫苗 使用载体进行重组 活疫苗研究。由于丙肝病毒变异快，极易冲破已有中和

31、抗体的屏障， 选择变异不大且能诱 发细胞免疫的抗原是目前研究的重要的方向之一。目前研制的高度减毒的非复制型载体是研制该疫苗的重要途径；制备减毒活疫苗是 RSV疫苗研制的另一个重要途径，负链RNA病毒cDNA转染技术的成功给使用现代分子生物学技术制备RSV的分子减毒活疫苗带来了希望，也是目前RSV苗研制重要途径。目前使用分子生物学技术，有目的地去除与与毒力、潜伏及肿瘤相关基因的分子减毒疫苗株 正在研制中。基因工程技术表达的gB做亚单位疫苗或重组活疫苗的研究已成为目前HMV疫苗研究的一个重要方向。病毒糖蛋白gD和gB是主要的保护f抗原，与gC gE、gI联合使用可诱生体液和细胞免疫，在动物实验中，

32、HSV II gD的核酸疫苗可以保护动物免受感染及随后的潜伏感染， 这些研究为单纯疱疹病毒疫苗的研究提供了有力的证据。通过表达prM-E形成病毒样颗粒的亚单位疫苗显示了较好安全性和免疫保护性，是该疫苗研究的重要方向。使用该病毒感染性 cDNA进行的分子减毒活疫及多种亚型嵌合的减毒活疫苗研究也取得 了较好效果，是另一个重要途径。13什么是定向进化技术采用随机的基因突变或基因重组技术与定向的突变体筛选方法相结合的分子进化技术。步骤：制备突变体文库突变体文库在适当的表达系统内表达。筛选突变体方法：易错 PCR DNA或基因改组(DNA shuffling)14如何利用易错PCR发生突变体文库（一）易

33、错PCR叫错PCR勺概念是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过 调整反应条件来改变扩增过程中的突变频率，从 而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获 得蛋白质分子的随机突变体。2曾加碱基错配的方法枇高镁离子浓度。例口入钮离子。做变体系中的dNTPs浓度。花用低彳真度DNA聚合酶等。喝错PCR：功的关键选择合适的突变频率。一般目的基因突变1.5-51时，诱变结果理想。?嵌套易错PCR使其PCR昔误积累。15什么是DNAshu而ng技术DNA shuffling?体外同源重组技术。将来源不同但功能相同的一 组同源基因，用核酸酶I消化成随机片段，由这 些随机片段组成一个文库，使之互为引物和模

34、板 进行PCR扩增，当一个基因拷贝片段作为另一基 因拷贝的引物时，引起模板互换，重组因而发 生，导入体内后，选择正突变体作为新一轮的体 外重组。17基因工程药品的种类基因工程药物：干扰素，生长因子、胰岛素等基因工程疫苗基因工程抗体基因工程药品特点：高技术、高投入、长周期、高风险、高收益二、问答题1 .克隆制药基因涉及的基因工程技术有哪些？制药基因的克隆是指应用基因工程技术手段得到制药期的过稔克脑药基因所涉及 的堪因工程技术大体上分祖制药基因僦得；制药基因与载体分子的体夕卜跳反应; 将该人工辘DNA分子导入到睇正常复制的宿主辘中进行犷增;阳腌组子的筛 选和鉴定；翱子的表达以及蛋白的纯化五大步骤。

35、2 .如何获得制药基因制药基因的获得一般分为直接获得和间接获得。直接获得是指从 DNA直接获得，通常针对原核生物的基因。因为原核基因为连续基因，无 内含子；间接获得是指利用 mRNA、cDNA等，针对真核生物的基因，真核基因为断裂基因，有内含子；3 .连接酶的作用机理是什么？DNA连接酶催化其之间形成磷酸二酯键来形成DNA重组分子。4 .什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受哪些因素影向？5 .什么是Klenow酶？有哪些活性？在基因工程中有什么作用？6 .什么是同聚物加尾连接法？所谓同聚物加尾法就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核昔酸，制成人工黏T末端，外源

36、 DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核甘酸7 . PCR反应体系包含哪些物质？包才7种基本成分(1)热稳定DNA聚合酶(2)模板DNA(3)寡核甘酸引物(4)脱氧核甘三磷酸(dNTP)(5)二价阳离子(Mg+2)(6)维持 pH 值的缓冲液(Tris-HCl:pH 8.3-8.8)(7) 一价阳离子(KCl 70-100mmol/L )8 . PCR反应的原理是什么？原理是在模板、引物、 4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次

37、，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到 230拷贝(约为109个分子)。9 . PCR引物设计的原则是什么？引物长度应在1530加之间，而且匕下游引物的长度差别不能大于3bp,引物太 短，就可能同非靶序列杂交T得出芈预期的扩增产物；引物太长，则使它与模板的杂交速率 卜樨，结果在反应循环周期内，无法完成向模板DNA的完全杂交，从而降低了 PCR反应 的速率,引物中碱基的分布应当是随机的而理论上应分布均匀。避免一连串单个碱基或 其他不常见的结构。GC碱基的含.埴在45%55%左右口f -* A T h立T A f uh I fr 、上 mi I iHr 1,P- -I- X I l t Hl K nj t* * t引物才端的末位碱基最好选T、G、C，而不要选A。10 .影响PCR结果的因素有哪些？(1)温度循环参数(2)引物(3)影响酶活力的因素11 .载体的种类有哪些？各有什么特点？；载体根据其来源可以分为质粒载体、噬函体裁体，酵母辄胞载体和病毒载体，根据其主 要用途可以分为克隆囊体和表达载体，克隆载体是携带外源基因进入宿主细胞，使外源基因 在宿主细胞中繁殖的载体。克隆载体中都有一个松弛性复制子，能带动外源基因在宿