外科学(整形)专业毕业论文cxcr4基因沉默对黑色素瘤侵袭和转移影响的实验研究

1、外科学(整形)专业毕业论文 精品论文 CXCR4基因沉默对黑色素瘤侵袭和转移影响的实验研究关键词：黑色素瘤 趋化因子受体CXCR4 shRNA 基因沉默 肿瘤侵袭摘要：侵袭和转移是影响黑色素瘤患者生存的首要因素，也是其治疗的最大障碍。SDF-1/CXCR4生物轴作为少数具有点对点精确传导生物信息的生物轴系统之一，在多数肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用。越来越多的研究说明，趋化因子受体CXCR4(Chemokine receptor CXCR4)参与肿瘤侵袭和转移的多个关键环节。本研究利用RNA干扰技术下调趋化因子受体CXCR4基因的表达，探讨CXCR4基因沉默对黑色素瘤及细胞系体外侵袭及转移的影

2、响及机制。设计合成CXCR4特异性短发夹状RNA(shRNA)插入pSilencer载体，转染人高转移性黑色素瘤细胞株MV3，RT-PCR和Western blot检测shRNA对靶基因CXCR4表达的影响。利用Transwell小室模型检测细胞体外侵袭能力，MTT检测细胞增殖状况。通过裸鼠尾静脉瘤细胞注射方法，构建黑色素瘤转移模型，检测CXCR4基因沉默对黑色素瘤转移能力的影响。研究证实，在人转移性黑色素瘤细胞系、人黑色素瘤原发灶及转移组织内均存在CXCR4选择性高表达；实验成功构建并筛选出CXCR4特异性shRNA质粒载体，结果说明，以CXCR4为靶向的shRNA能够有效下调CXCR4基因

3、的表达，降低黑色素瘤细胞增殖、体外侵袭及转移能力。提示CXCR4是黑色素瘤侵袭和转移过程中的重要调控因子，为黑色素瘤的生物治疗提供了新的靶分子并奠定实验根底。 研究背景 恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)在整形外科临床所遇见的体表肿瘤类型中相对少见，但其恶性程度极高。在所有原发于皮肤的恶性肿瘤中，皮肤恶性黑色素瘤虽然只占4，而其致死率却占79。黑色素瘤的发病率正以每年57的速度逐年上升，在男性是发病率增长最快的恶性肿瘤。黑色素瘤早期即可通过血行传播发生远处转移，对放/化疗均不敏感，预后较差。侵袭和转移是黑色素瘤最显著的特征和影响患者生存的首要因素，也是其治疗困难的一个重

4、要原因。所以，说明黑色素瘤侵袭转移的机理，探索有效控制黑色素瘤侵袭和转移的途径，对进一步改善黑色素瘤疗效、防止其复发、转移和提高患者生存率均具有重要意义。 近年研究说明，趋化因子受体CXCR4参与肿瘤侵袭和转移的多个关键环节。基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor，SDF-1)与其特异性受体CXCR4所构成的SDF-1/CXCR4生物学轴在多种肿瘤播散、细胞选择性和非随意转移过程中发挥重要作用。然而，CXCR4在黑色素瘤侵袭转移过程中所起的具体作用和调控机制，以及沉默CXCR4基因对黑色素瘤侵袭和转移有何影响尚待深入研究。 目的 探讨SDF-1/CXCR4

5、信号通路在黑色素瘤侵袭和转移过程中的作用，以及利用shRNA干扰技术沉默CXCR4基因表达后对黑色素瘤侵袭和转移的影响及机制，以寻求一条黑色素瘤基因治疗的新途径。 方法 (1)应用Western blot和RT-PCR检测CXCR4基因在高转移性黑色素瘤MV3细胞系中的表达，利用Envision免疫组织化学法观察人黑色素瘤原发灶及转移组织中CXCR4的表达。 (2)设计合成CXCR4特异性shRNA，将其插入pSilencer质粒载体，并将重组后的pSilencer质粒载体经脂质体包裹转染黑色素瘤MV3细胞株，抗性筛选稳定抑制CXCR4表达的永久性克隆。应用RT-PCR技术检测shRNA对黑色

6、素瘤细胞内CXCR4 mRNA表达，用FCM法检测细胞周期的分布情况，应用Western blot法检测CXCR4蛋白变化。 (3)采用Transwell小室模型检测细胞体外侵袭能力，MTT法检测黑色素瘤细胞增殖情况。 (4)用MV3细胞注射构建裸鼠皮下移植瘤动物模型，评价CXCR4-shRNA瘤体内直接注射对黑色素瘤的抑瘤效应。通过裸鼠尾静脉瘤细胞注射方法，建立黑色素瘤定向肺转移模型，检测CXCR4基因沉默对黑色素瘤细胞肝、脑、肺等实质性器官转移能力的影响。运用RT-PCR和Envision免疫组织化学方法检测瘤细胞株和瘤体内MMP-2表达变化。 结果 (1)Western blotting

7、检测结果显示：Mv3细胞中CXCR4的蛋白片段表达量较高；免疫组化结果显示：转移性黑色素瘤原发灶组织及转移灶内CXC4高表达。 (2)成功构建和筛选出CXCR4特异性的shRNA质粒载体。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳证实CXCR4-shRNA插入pSilence载体，成功筛选稳定抑制CXCR4表达的永久性细胞克隆，实验组和无关对照组均有抗性细胞生长。阳性克隆测序结果说明合成的寡核苷酸链序列插入正确。稳定转染CXCR4-shRNA的高转移性黑色素瘤细胞Mv3的CXCR4 mRNA和蛋白的表达较空白对照组明显下调。FCM检测显示细胞周期分布无明显改变。 (3)Transwell小室体外趋化侵袭实验结

8、果说明，黑色素瘤MV3细胞体外侵袭能力减弱。MTT Assay检测结果显示，CXCR4-shRNA质粒载体转染MV3细胞后，瘤细胞增殖活性降低，细胞活力明显下降。 (4)裸鼠黑色素瘤皮下种植瘤成功率为100，绘制的肿瘤生长曲线说明，CXCR4-shRNA转染组的肿瘤生长明显受到抑制。CXCR4-shRNA转染组与空白对照组和阴性CXCR4-NC对照组比拟在统计学上具有显著性差异(P0.01)。肝、脑组织内转移瘤数目实验组较对照组明显少。黑色素瘤定向肺转移能力下降：空白对照组、无关对照组和实验组裸鼠肺转移发生率分别为：90、87.5和20；空白对照组、无关对照组和实验组裸鼠的肺转移结节数目分别为

9、206、165和23个。RT-PCR及细胞免疫荧光染色显示，转染CXCR4-shRNA的黑色素瘤瘤MV3细胞系MMP-2表达下调；免疫组织化学结果显示，实验组裸鼠黑色素瘤瘤体及转移灶组织MMP-2的表达低于对照组。 结论 (1)CXCR4在人黑色素瘤组织和高转移性黑色素瘤细胞株MV3中的表达明显上调可能与黑色素瘤的侵袭转移有关。 (2)经用脂质体介导的shRNA体内表达法制备的CXCR4-shRNA在黑色素瘤细胞中可获得高效转染，并能产生特异性的基因沉默效应，以CXCR4为靶向的shRNA能够有效下调CXCR4基因的表达。 (3)shRNA介导的CXCR4基因沉默在体外实验能够显著抑制黑色素瘤

10、细胞的生长和增殖活性，减弱体外侵袭能力。 (4)shRNA介导的CXCR4基因沉默可在黑色素瘤皮下种植瘤产生抑瘤效应，明显降低肝、脑器官转移能力和定向肺转移能力。其机制可能与SDF-1/CXCR4信号途径阻断，进而抑制MMP-2的表达有关。 CXCR4是黑色素瘤侵袭和转移过程中的重要调控因子，SDF-1/CXCR4生物轴在调控黑色素瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用，CXCR4有望成为预防和治疗黑色素瘤侵袭和转移的潜在靶标。特异性shRNA介导的CXCR4基因沉默下调CXCR4基因表达，有望为转移性黑色素瘤的分子靶向基因治疗提供一条新途径。正文内容 侵袭和转移是影响黑色素瘤患者生存的首要因素，也

11、是其治疗的最大障碍。SDF-1/CXCR4生物轴作为少数具有点对点精确传导生物信息的生物轴系统之一，在多数肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用。越来越多的研究说明，趋化因子受体CXCR4(Chemokine receptor CXCR4)参与肿瘤侵袭和转移的多个关键环节。本研究利用RNA干扰技术下调趋化因子受体CXCR4基因的表达，探讨CXCR4基因沉默对黑色素瘤及细胞系体外侵袭及转移的影响及机制。设计合成CXCR4特异性短发夹状RNA(shRNA)插入pSilencer载体，转染人高转移性黑色素瘤细胞株MV3，RT-PCR和Western blot检测shRNA对靶基因CXCR4表达的影响。利用T

12、ranswell小室模型检测细胞体外侵袭能力，MTT检测细胞增殖状况。通过裸鼠尾静脉瘤细胞注射方法，构建黑色素瘤转移模型，检测CXCR4基因沉默对黑色素瘤转移能力的影响。研究证实，在人转移性黑色素瘤细胞系、人黑色素瘤原发灶及转移组织内均存在CXCR4选择性高表达；实验成功构建并筛选出CXCR4特异性shRNA质粒载体，结果说明，以CXCR4为靶向的shRNA能够有效下调CXCR4基因的表达，降低黑色素瘤细胞增殖、体外侵袭及转移能力。提示CXCR4是黑色素瘤侵袭和转移过程中的重要调控因子，为黑色素瘤的生物治疗提供了新的靶分子并奠定实验根底。 研究背景 恶性黑色素瘤(malignant melan

13、oma，MM)在整形外科临床所遇见的体表肿瘤类型中相对少见，但其恶性程度极高。在所有原发于皮肤的恶性肿瘤中，皮肤恶性黑色素瘤虽然只占4，而其致死率却占79。黑色素瘤的发病率正以每年57的速度逐年上升，在男性是发病率增长最快的恶性肿瘤。黑色素瘤早期即可通过血行传播发生远处转移，对放/化疗均不敏感，预后较差。侵袭和转移是黑色素瘤最显著的特征和影响患者生存的首要因素，也是其治疗困难的一个重要原因。所以，说明黑色素瘤侵袭转移的机理，探索有效控制黑色素瘤侵袭和转移的途径，对进一步改善黑色素瘤疗效、防止其复发、转移和提高患者生存率均具有重要意义。 近年研究说明，趋化因子受体CXCR4参与肿瘤侵袭和转移的多

14、个关键环节。基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor，SDF-1)与其特异性受体CXCR4所构成的SDF-1/CXCR4生物学轴在多种肿瘤播散、细胞选择性和非随意转移过程中发挥重要作用。然而，CXCR4在黑色素瘤侵袭转移过程中所起的具体作用和调控机制，以及沉默CXCR4基因对黑色素瘤侵袭和转移有何影响尚待深入研究。 目的 探讨SDF-1/CXCR4信号通路在黑色素瘤侵袭和转移过程中的作用，以及利用shRNA干扰技术沉默CXCR4基因表达后对黑色素瘤侵袭和转移的影响及机制，以寻求一条黑色素瘤基因治疗的新途径。 方法 (1)应用Western blot和RT-P

15、CR检测CXCR4基因在高转移性黑色素瘤MV3细胞系中的表达，利用Envision免疫组织化学法观察人黑色素瘤原发灶及转移组织中CXCR4的表达。 (2)设计合成CXCR4特异性shRNA，将其插入pSilencer质粒载体，并将重组后的pSilencer质粒载体经脂质体包裹转染黑色素瘤MV3细胞株，抗性筛选稳定抑制CXCR4表达的永久性克隆。应用RT-PCR技术检测shRNA对黑色素瘤细胞内CXCR4 mRNA表达，用FCM法检测细胞周期的分布情况，应用Western blot法检测CXCR4蛋白变化。 (3)采用Transwell小室模型检测细胞体外侵袭能力，MTT法检测黑色素瘤细胞增殖情

16、况。 (4)用MV3细胞注射构建裸鼠皮下移植瘤动物模型，评价CXCR4-shRNA瘤体内直接注射对黑色素瘤的抑瘤效应。通过裸鼠尾静脉瘤细胞注射方法，建立黑色素瘤定向肺转移模型，检测CXCR4基因沉默对黑色素瘤细胞肝、脑、肺等实质性器官转移能力的影响。运用RT-PCR和Envision免疫组织化学方法检测瘤细胞株和瘤体内MMP-2表达变化。 结果 (1)Western blotting检测结果显示：Mv3细胞中CXCR4的蛋白片段表达量较高；免疫组化结果显示：转移性黑色素瘤原发灶组织及转移灶内CXC4高表达。 (2)成功构建和筛选出CXCR4特异性的shRNA质粒载体。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳

17、证实CXCR4-shRNA插入pSilence载体，成功筛选稳定抑制CXCR4表达的永久性细胞克隆，实验组和无关对照组均有抗性细胞生长。阳性克隆测序结果说明合成的寡核苷酸链序列插入正确。稳定转染CXCR4-shRNA的高转移性黑色素瘤细胞Mv3的CXCR4 mRNA和蛋白的表达较空白对照组明显下调。FCM检测显示细胞周期分布无明显改变。 (3)Transwell小室体外趋化侵袭实验结果说明，黑色素瘤MV3细胞体外侵袭能力减弱。MTT Assay检测结果显示，CXCR4-shRNA质粒载体转染MV3细胞后，瘤细胞增殖活性降低，细胞活力明显下降。 (4)裸鼠黑色素瘤皮下种植瘤成功率为100，绘制的

18、肿瘤生长曲线说明，CXCR4-shRNA转染组的肿瘤生长明显受到抑制。CXCR4-shRNA转染组与空白对照组和阴性CXCR4-NC对照组比拟在统计学上具有显著性差异(P0.01)。肝、脑组织内转移瘤数目实验组较对照组明显少。黑色素瘤定向肺转移能力下降：空白对照组、无关对照组和实验组裸鼠肺转移发生率分别为：90、87.5和20；空白对照组、无关对照组和实验组裸鼠的肺转移结节数目分别为206、165和23个。RT-PCR及细胞免疫荧光染色显示，转染CXCR4-shRNA的黑色素瘤瘤MV3细胞系MMP-2表达下调；免疫组织化学结果显示，实验组裸鼠黑色素瘤瘤体及转移灶组织MMP-2的表达低于对照组。

19、 结论 (1)CXCR4在人黑色素瘤组织和高转移性黑色素瘤细胞株MV3中的表达明显上调可能与黑色素瘤的侵袭转移有关。 (2)经用脂质体介导的shRNA体内表达法制备的CXCR4-shRNA在黑色素瘤细胞中可获得高效转染，并能产生特异性的基因沉默效应，以CXCR4为靶向的shRNA能够有效下调CXCR4基因的表达。 (3)shRNA介导的CXCR4基因沉默在体外实验能够显著抑制黑色素瘤细胞的生长和增殖活性，减弱体外侵袭能力。 (4)shRNA介导的CXCR4基因沉默可在黑色素瘤皮下种植瘤产生抑瘤效应，明显降低肝、脑器官转移能力和定向肺转移能力。其机制可能与SDF-1/CXCR4信号途径阻断，进而

20、抑制MMP-2的表达有关。 CXCR4是黑色素瘤侵袭和转移过程中的重要调控因子，SDF-1/CXCR4生物轴在调控黑色素瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用，CXCR4有望成为预防和治疗黑色素瘤侵袭和转移的潜在靶标。特异性shRNA介导的CXCR4基因沉默下调CXCR4基因表达，有望为转移性黑色素瘤的分子靶向基因治疗提供一条新途径。侵袭和转移是影响黑色素瘤患者生存的首要因素，也是其治疗的最大障碍。SDF-1/CXCR4生物轴作为少数具有点对点精确传导生物信息的生物轴系统之一，在多数肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用。越来越多的研究说明，趋化因子受体CXCR4(Chemokine receptor CX

21、CR4)参与肿瘤侵袭和转移的多个关键环节。本研究利用RNA干扰技术下调趋化因子受体CXCR4基因的表达，探讨CXCR4基因沉默对黑色素瘤及细胞系体外侵袭及转移的影响及机制。设计合成CXCR4特异性短发夹状RNA(shRNA)插入pSilencer载体，转染人高转移性黑色素瘤细胞株MV3，RT-PCR和Western blot检测shRNA对靶基因CXCR4表达的影响。利用Transwell小室模型检测细胞体外侵袭能力，MTT检测细胞增殖状况。通过裸鼠尾静脉瘤细胞注射方法，构建黑色素瘤转移模型，检测CXCR4基因沉默对黑色素瘤转移能力的影响。研究证实，在人转移性黑色素瘤细胞系、人黑色素瘤原发灶及

22、转移组织内均存在CXCR4选择性高表达；实验成功构建并筛选出CXCR4特异性shRNA质粒载体，结果说明，以CXCR4为靶向的shRNA能够有效下调CXCR4基因的表达，降低黑色素瘤细胞增殖、体外侵袭及转移能力。提示CXCR4是黑色素瘤侵袭和转移过程中的重要调控因子，为黑色素瘤的生物治疗提供了新的靶分子并奠定实验根底。 研究背景 恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)在整形外科临床所遇见的体表肿瘤类型中相对少见，但其恶性程度极高。在所有原发于皮肤的恶性肿瘤中，皮肤恶性黑色素瘤虽然只占4，而其致死率却占79。黑色素瘤的发病率正以每年57的速度逐年上升，在男性是发病率增长最快的

23、恶性肿瘤。黑色素瘤早期即可通过血行传播发生远处转移，对放/化疗均不敏感，预后较差。侵袭和转移是黑色素瘤最显著的特征和影响患者生存的首要因素，也是其治疗困难的一个重要原因。所以，说明黑色素瘤侵袭转移的机理，探索有效控制黑色素瘤侵袭和转移的途径，对进一步改善黑色素瘤疗效、防止其复发、转移和提高患者生存率均具有重要意义。 近年研究说明，趋化因子受体CXCR4参与肿瘤侵袭和转移的多个关键环节。基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor，SDF-1)与其特异性受体CXCR4所构成的SDF-1/CXCR4生物学轴在多种肿瘤播散、细胞选择性和非随意转移过程中发挥重要作用。然

24、而，CXCR4在黑色素瘤侵袭转移过程中所起的具体作用和调控机制，以及沉默CXCR4基因对黑色素瘤侵袭和转移有何影响尚待深入研究。 目的 探讨SDF-1/CXCR4信号通路在黑色素瘤侵袭和转移过程中的作用，以及利用shRNA干扰技术沉默CXCR4基因表达后对黑色素瘤侵袭和转移的影响及机制，以寻求一条黑色素瘤基因治疗的新途径。 方法 (1)应用Western blot和RT-PCR检测CXCR4基因在高转移性黑色素瘤MV3细胞系中的表达，利用Envision免疫组织化学法观察人黑色素瘤原发灶及转移组织中CXCR4的表达。 (2)设计合成CXCR4特异性shRNA，将其插入pSilencer质粒载体

25、，并将重组后的pSilencer质粒载体经脂质体包裹转染黑色素瘤MV3细胞株，抗性筛选稳定抑制CXCR4表达的永久性克隆。应用RT-PCR技术检测shRNA对黑色素瘤细胞内CXCR4 mRNA表达，用FCM法检测细胞周期的分布情况，应用Western blot法检测CXCR4蛋白变化。 (3)采用Transwell小室模型检测细胞体外侵袭能力，MTT法检测黑色素瘤细胞增殖情况。 (4)用MV3细胞注射构建裸鼠皮下移植瘤动物模型，评价CXCR4-shRNA瘤体内直接注射对黑色素瘤的抑瘤效应。通过裸鼠尾静脉瘤细胞注射方法，建立黑色素瘤定向肺转移模型，检测CXCR4基因沉默对黑色素瘤细胞肝、脑、肺等

26、实质性器官转移能力的影响。运用RT-PCR和Envision免疫组织化学方法检测瘤细胞株和瘤体内MMP-2表达变化。 结果 (1)Western blotting检测结果显示：Mv3细胞中CXCR4的蛋白片段表达量较高；免疫组化结果显示：转移性黑色素瘤原发灶组织及转移灶内CXC4高表达。 (2)成功构建和筛选出CXCR4特异性的shRNA质粒载体。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳证实CXCR4-shRNA插入pSilence载体，成功筛选稳定抑制CXCR4表达的永久性细胞克隆，实验组和无关对照组均有抗性细胞生长。阳性克隆测序结果说明合成的寡核苷酸链序列插入正确。稳定转染CXCR4-shRNA的高转移

27、性黑色素瘤细胞Mv3的CXCR4 mRNA和蛋白的表达较空白对照组明显下调。FCM检测显示细胞周期分布无明显改变。 (3)Transwell小室体外趋化侵袭实验结果说明，黑色素瘤MV3细胞体外侵袭能力减弱。MTT Assay检测结果显示，CXCR4-shRNA质粒载体转染MV3细胞后，瘤细胞增殖活性降低，细胞活力明显下降。 (4)裸鼠黑色素瘤皮下种植瘤成功率为100，绘制的肿瘤生长曲线说明，CXCR4-shRNA转染组的肿瘤生长明显受到抑制。CXCR4-shRNA转染组与空白对照组和阴性CXCR4-NC对照组比拟在统计学上具有显著性差异(P0.01)。肝、脑组织内转移瘤数目实验组较对照组明显少

28、。黑色素瘤定向肺转移能力下降：空白对照组、无关对照组和实验组裸鼠肺转移发生率分别为：90、87.5和20；空白对照组、无关对照组和实验组裸鼠的肺转移结节数目分别为206、165和23个。RT-PCR及细胞免疫荧光染色显示，转染CXCR4-shRNA的黑色素瘤瘤MV3细胞系MMP-2表达下调；免疫组织化学结果显示，实验组裸鼠黑色素瘤瘤体及转移灶组织MMP-2的表达低于对照组。 结论 (1)CXCR4在人黑色素瘤组织和高转移性黑色素瘤细胞株MV3中的表达明显上调可能与黑色素瘤的侵袭转移有关。 (2)经用脂质体介导的shRNA体内表达法制备的CXCR4-shRNA在黑色素瘤细胞中可获得高效转染，并能

29、产生特异性的基因沉默效应，以CXCR4为靶向的shRNA能够有效下调CXCR4基因的表达。 (3)shRNA介导的CXCR4基因沉默在体外实验能够显著抑制黑色素瘤细胞的生长和增殖活性，减弱体外侵袭能力。 (4)shRNA介导的CXCR4基因沉默可在黑色素瘤皮下种植瘤产生抑瘤效应，明显降低肝、脑器官转移能力和定向肺转移能力。其机制可能与SDF-1/CXCR4信号途径阻断，进而抑制MMP-2的表达有关。 CXCR4是黑色素瘤侵袭和转移过程中的重要调控因子，SDF-1/CXCR4生物轴在调控黑色素瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用，CXCR4有望成为预防和治疗黑色素瘤侵袭和转移的潜在靶标。特异性shR

30、NA介导的CXCR4基因沉默下调CXCR4基因表达，有望为转移性黑色素瘤的分子靶向基因治疗提供一条新途径。侵袭和转移是影响黑色素瘤患者生存的首要因素，也是其治疗的最大障碍。SDF-1/CXCR4生物轴作为少数具有点对点精确传导生物信息的生物轴系统之一，在多数肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用。越来越多的研究说明，趋化因子受体CXCR4(Chemokine receptor CXCR4)参与肿瘤侵袭和转移的多个关键环节。本研究利用RNA干扰技术下调趋化因子受体CXCR4基因的表达，探讨CXCR4基因沉默对黑色素瘤及细胞系体外侵袭及转移的影响及机制。设计合成CXCR4特异性短发夹状RNA(shRNA)

31、插入pSilencer载体，转染人高转移性黑色素瘤细胞株MV3，RT-PCR和Western blot检测shRNA对靶基因CXCR4表达的影响。利用Transwell小室模型检测细胞体外侵袭能力，MTT检测细胞增殖状况。通过裸鼠尾静脉瘤细胞注射方法，构建黑色素瘤转移模型，检测CXCR4基因沉默对黑色素瘤转移能力的影响。研究证实，在人转移性黑色素瘤细胞系、人黑色素瘤原发灶及转移组织内均存在CXCR4选择性高表达；实验成功构建并筛选出CXCR4特异性shRNA质粒载体，结果说明，以CXCR4为靶向的shRNA能够有效下调CXCR4基因的表达，降低黑色素瘤细胞增殖、体外侵袭及转移能力。提示CXCR

32、4是黑色素瘤侵袭和转移过程中的重要调控因子，为黑色素瘤的生物治疗提供了新的靶分子并奠定实验根底。 研究背景 恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)在整形外科临床所遇见的体表肿瘤类型中相对少见，但其恶性程度极高。在所有原发于皮肤的恶性肿瘤中，皮肤恶性黑色素瘤虽然只占4，而其致死率却占79。黑色素瘤的发病率正以每年57的速度逐年上升，在男性是发病率增长最快的恶性肿瘤。黑色素瘤早期即可通过血行传播发生远处转移，对放/化疗均不敏感，预后较差。侵袭和转移是黑色素瘤最显著的特征和影响患者生存的首要因素，也是其治疗困难的一个重要原因。所以，说明黑色素瘤侵袭转移的机理，探索有效控制黑色素瘤

33、侵袭和转移的途径，对进一步改善黑色素瘤疗效、防止其复发、转移和提高患者生存率均具有重要意义。 近年研究说明，趋化因子受体CXCR4参与肿瘤侵袭和转移的多个关键环节。基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor，SDF-1)与其特异性受体CXCR4所构成的SDF-1/CXCR4生物学轴在多种肿瘤播散、细胞选择性和非随意转移过程中发挥重要作用。然而，CXCR4在黑色素瘤侵袭转移过程中所起的具体作用和调控机制，以及沉默CXCR4基因对黑色素瘤侵袭和转移有何影响尚待深入研究。 目的 探讨SDF-1/CXCR4信号通路在黑色素瘤侵袭和转移过程中的作用，以及利用shRNA干

34、扰技术沉默CXCR4基因表达后对黑色素瘤侵袭和转移的影响及机制，以寻求一条黑色素瘤基因治疗的新途径。 方法 (1)应用Western blot和RT-PCR检测CXCR4基因在高转移性黑色素瘤MV3细胞系中的表达，利用Envision免疫组织化学法观察人黑色素瘤原发灶及转移组织中CXCR4的表达。 (2)设计合成CXCR4特异性shRNA，将其插入pSilencer质粒载体，并将重组后的pSilencer质粒载体经脂质体包裹转染黑色素瘤MV3细胞株，抗性筛选稳定抑制CXCR4表达的永久性克隆。应用RT-PCR技术检测shRNA对黑色素瘤细胞内CXCR4 mRNA表达，用FCM法检测细胞周期的分

35、布情况，应用Western blot法检测CXCR4蛋白变化。 (3)采用Transwell小室模型检测细胞体外侵袭能力，MTT法检测黑色素瘤细胞增殖情况。 (4)用MV3细胞注射构建裸鼠皮下移植瘤动物模型，评价CXCR4-shRNA瘤体内直接注射对黑色素瘤的抑瘤效应。通过裸鼠尾静脉瘤细胞注射方法，建立黑色素瘤定向肺转移模型，检测CXCR4基因沉默对黑色素瘤细胞肝、脑、肺等实质性器官转移能力的影响。运用RT-PCR和Envision免疫组织化学方法检测瘤细胞株和瘤体内MMP-2表达变化。 结果 (1)Western blotting检测结果显示：Mv3细胞中CXCR4的蛋白片段表达量较高；免疫

36、组化结果显示：转移性黑色素瘤原发灶组织及转移灶内CXC4高表达。 (2)成功构建和筛选出CXCR4特异性的shRNA质粒载体。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳证实CXCR4-shRNA插入pSilence载体，成功筛选稳定抑制CXCR4表达的永久性细胞克隆，实验组和无关对照组均有抗性细胞生长。阳性克隆测序结果说明合成的寡核苷酸链序列插入正确。稳定转染CXCR4-shRNA的高转移性黑色素瘤细胞Mv3的CXCR4 mRNA和蛋白的表达较空白对照组明显下调。FCM检测显示细胞周期分布无明显改变。 (3)Transwell小室体外趋化侵袭实验结果说明，黑色素瘤MV3细胞体外侵袭能力减弱。MTT Assay

37、检测结果显示，CXCR4-shRNA质粒载体转染MV3细胞后，瘤细胞增殖活性降低，细胞活力明显下降。 (4)裸鼠黑色素瘤皮下种植瘤成功率为100，绘制的肿瘤生长曲线说明，CXCR4-shRNA转染组的肿瘤生长明显受到抑制。CXCR4-shRNA转染组与空白对照组和阴性CXCR4-NC对照组比拟在统计学上具有显著性差异(P0.01)。肝、脑组织内转移瘤数目实验组较对照组明显少。黑色素瘤定向肺转移能力下降：空白对照组、无关对照组和实验组裸鼠肺转移发生率分别为：90、87.5和20；空白对照组、无关对照组和实验组裸鼠的肺转移结节数目分别为206、165和23个。RT-PCR及细胞免疫荧光染色显示，转

38、染CXCR4-shRNA的黑色素瘤瘤MV3细胞系MMP-2表达下调；免疫组织化学结果显示，实验组裸鼠黑色素瘤瘤体及转移灶组织MMP-2的表达低于对照组。 结论 (1)CXCR4在人黑色素瘤组织和高转移性黑色素瘤细胞株MV3中的表达明显上调可能与黑色素瘤的侵袭转移有关。 (2)经用脂质体介导的shRNA体内表达法制备的CXCR4-shRNA在黑色素瘤细胞中可获得高效转染，并能产生特异性的基因沉默效应，以CXCR4为靶向的shRNA能够有效下调CXCR4基因的表达。 (3)shRNA介导的CXCR4基因沉默在体外实验能够显著抑制黑色素瘤细胞的生长和增殖活性，减弱体外侵袭能力。 (4)shRNA介导

39、的CXCR4基因沉默可在黑色素瘤皮下种植瘤产生抑瘤效应，明显降低肝、脑器官转移能力和定向肺转移能力。其机制可能与SDF-1/CXCR4信号途径阻断，进而抑制MMP-2的表达有关。 CXCR4是黑色素瘤侵袭和转移过程中的重要调控因子，SDF-1/CXCR4生物轴在调控黑色素瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用，CXCR4有望成为预防和治疗黑色素瘤侵袭和转移的潜在靶标。特异性shRNA介导的CXCR4基因沉默下调CXCR4基因表达，有望为转移性黑色素瘤的分子靶向基因治疗提供一条新途径。侵袭和转移是影响黑色素瘤患者生存的首要因素，也是其治疗的最大障碍。SDF-1/CXCR4生物轴作为少数具有点对点精确传

40、导生物信息的生物轴系统之一，在多数肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用。越来越多的研究说明，趋化因子受体CXCR4(Chemokine receptor CXCR4)参与肿瘤侵袭和转移的多个关键环节。本研究利用RNA干扰技术下调趋化因子受体CXCR4基因的表达，探讨CXCR4基因沉默对黑色素瘤及细胞系体外侵袭及转移的影响及机制。设计合成CXCR4特异性短发夹状RNA(shRNA)插入pSilencer载体，转染人高转移性黑色素瘤细胞株MV3，RT-PCR和Western blot检测shRNA对靶基因CXCR4表达的影响。利用Transwell小室模型检测细胞体外侵袭能力，MTT检测细胞增殖状况。通

41、过裸鼠尾静脉瘤细胞注射方法，构建黑色素瘤转移模型，检测CXCR4基因沉默对黑色素瘤转移能力的影响。研究证实，在人转移性黑色素瘤细胞系、人黑色素瘤原发灶及转移组织内均存在CXCR4选择性高表达；实验成功构建并筛选出CXCR4特异性shRNA质粒载体，结果说明，以CXCR4为靶向的shRNA能够有效下调CXCR4基因的表达，降低黑色素瘤细胞增殖、体外侵袭及转移能力。提示CXCR4是黑色素瘤侵袭和转移过程中的重要调控因子，为黑色素瘤的生物治疗提供了新的靶分子并奠定实验根底。 研究背景 恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)在整形外科临床所遇见的体表肿瘤类型中相对少见，但其恶性程度

42、极高。在所有原发于皮肤的恶性肿瘤中，皮肤恶性黑色素瘤虽然只占4，而其致死率却占79。黑色素瘤的发病率正以每年57的速度逐年上升，在男性是发病率增长最快的恶性肿瘤。黑色素瘤早期即可通过血行传播发生远处转移，对放/化疗均不敏感，预后较差。侵袭和转移是黑色素瘤最显著的特征和影响患者生存的首要因素，也是其治疗困难的一个重要原因。所以，说明黑色素瘤侵袭转移的机理，探索有效控制黑色素瘤侵袭和转移的途径，对进一步改善黑色素瘤疗效、防止其复发、转移和提高患者生存率均具有重要意义。 近年研究说明，趋化因子受体CXCR4参与肿瘤侵袭和转移的多个关键环节。基质细胞衍生因子-1(stromal cell derive

43、d factor，SDF-1)与其特异性受体CXCR4所构成的SDF-1/CXCR4生物学轴在多种肿瘤播散、细胞选择性和非随意转移过程中发挥重要作用。然而，CXCR4在黑色素瘤侵袭转移过程中所起的具体作用和调控机制，以及沉默CXCR4基因对黑色素瘤侵袭和转移有何影响尚待深入研究。 目的 探讨SDF-1/CXCR4信号通路在黑色素瘤侵袭和转移过程中的作用，以及利用shRNA干扰技术沉默CXCR4基因表达后对黑色素瘤侵袭和转移的影响及机制，以寻求一条黑色素瘤基因治疗的新途径。 方法 (1)应用Western blot和RT-PCR检测CXCR4基因在高转移性黑色素瘤MV3细胞系中的表达，利用Env

44、ision免疫组织化学法观察人黑色素瘤原发灶及转移组织中CXCR4的表达。 (2)设计合成CXCR4特异性shRNA，将其插入pSilencer质粒载体，并将重组后的pSilencer质粒载体经脂质体包裹转染黑色素瘤MV3细胞株，抗性筛选稳定抑制CXCR4表达的永久性克隆。应用RT-PCR技术检测shRNA对黑色素瘤细胞内CXCR4 mRNA表达，用FCM法检测细胞周期的分布情况，应用Western blot法检测CXCR4蛋白变化。 (3)采用Transwell小室模型检测细胞体外侵袭能力，MTT法检测黑色素瘤细胞增殖情况。 (4)用MV3细胞注射构建裸鼠皮下移植瘤动物模型，评价CXCR4-

45、shRNA瘤体内直接注射对黑色素瘤的抑瘤效应。通过裸鼠尾静脉瘤细胞注射方法，建立黑色素瘤定向肺转移模型，检测CXCR4基因沉默对黑色素瘤细胞肝、脑、肺等实质性器官转移能力的影响。运用RT-PCR和Envision免疫组织化学方法检测瘤细胞株和瘤体内MMP-2表达变化。 结果 (1)Western blotting检测结果显示：Mv3细胞中CXCR4的蛋白片段表达量较高；免疫组化结果显示：转移性黑色素瘤原发灶组织及转移灶内CXC4高表达。 (2)成功构建和筛选出CXCR4特异性的shRNA质粒载体。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳证实CXCR4-shRNA插入pSilence载体，成功筛选稳定抑制CX

46、CR4表达的永久性细胞克隆，实验组和无关对照组均有抗性细胞生长。阳性克隆测序结果说明合成的寡核苷酸链序列插入正确。稳定转染CXCR4-shRNA的高转移性黑色素瘤细胞Mv3的CXCR4 mRNA和蛋白的表达较空白对照组明显下调。FCM检测显示细胞周期分布无明显改变。 (3)Transwell小室体外趋化侵袭实验结果说明，黑色素瘤MV3细胞体外侵袭能力减弱。MTT Assay检测结果显示，CXCR4-shRNA质粒载体转染MV3细胞后，瘤细胞增殖活性降低，细胞活力明显下降。 (4)裸鼠黑色素瘤皮下种植瘤成功率为100，绘制的肿瘤生长曲线说明，CXCR4-shRNA转染组的肿瘤生长明显受到抑制。C

47、XCR4-shRNA转染组与空白对照组和阴性CXCR4-NC对照组比拟在统计学上具有显著性差异(P0.01)。肝、脑组织内转移瘤数目实验组较对照组明显少。黑色素瘤定向肺转移能力下降：空白对照组、无关对照组和实验组裸鼠肺转移发生率分别为：90、87.5和20；空白对照组、无关对照组和实验组裸鼠的肺转移结节数目分别为206、165和23个。RT-PCR及细胞免疫荧光染色显示，转染CXCR4-shRNA的黑色素瘤瘤MV3细胞系MMP-2表达下调；免疫组织化学结果显示，实验组裸鼠黑色素瘤瘤体及转移灶组织MMP-2的表达低于对照组。 结论 (1)CXCR4在人黑色素瘤组织和高转移性黑色素瘤细胞株MV3中

48、的表达明显上调可能与黑色素瘤的侵袭转移有关。 (2)经用脂质体介导的shRNA体内表达法制备的CXCR4-shRNA在黑色素瘤细胞中可获得高效转染，并能产生特异性的基因沉默效应，以CXCR4为靶向的shRNA能够有效下调CXCR4基因的表达。 (3)shRNA介导的CXCR4基因沉默在体外实验能够显著抑制黑色素瘤细胞的生长和增殖活性，减弱体外侵袭能力。 (4)shRNA介导的CXCR4基因沉默可在黑色素瘤皮下种植瘤产生抑瘤效应，明显降低肝、脑器官转移能力和定向肺转移能力。其机制可能与SDF-1/CXCR4信号途径阻断，进而抑制MMP-2的表达有关。 CXCR4是黑色素瘤侵袭和转移过程中的重要调

49、控因子，SDF-1/CXCR4生物轴在调控黑色素瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用，CXCR4有望成为预防和治疗黑色素瘤侵袭和转移的潜在靶标。特异性shRNA介导的CXCR4基因沉默下调CXCR4基因表达，有望为转移性黑色素瘤的分子靶向基因治疗提供一条新途径。侵袭和转移是影响黑色素瘤患者生存的首要因素，也是其治疗的最大障碍。SDF-1/CXCR4生物轴作为少数具有点对点精确传导生物信息的生物轴系统之一，在多数肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用。越来越多的研究说明，趋化因子受体CXCR4(Chemokine receptor CXCR4)参与肿瘤侵袭和转移的多个关键环节。本研究利用RNA干扰技术下调趋

50、化因子受体CXCR4基因的表达，探讨CXCR4基因沉默对黑色素瘤及细胞系体外侵袭及转移的影响及机制。设计合成CXCR4特异性短发夹状RNA(shRNA)插入pSilencer载体，转染人高转移性黑色素瘤细胞株MV3，RT-PCR和Western blot检测shRNA对靶基因CXCR4表达的影响。利用Transwell小室模型检测细胞体外侵袭能力，MTT检测细胞增殖状况。通过裸鼠尾静脉瘤细胞注射方法，构建黑色素瘤转移模型，检测CXCR4基因沉默对黑色素瘤转移能力的影响。研究证实，在人转移性黑色素瘤细胞系、人黑色素瘤原发灶及转移组织内均存在CXCR4选择性高表达；实验成功构建并筛选出CXCR4特

51、异性shRNA质粒载体，结果说明，以CXCR4为靶向的shRNA能够有效下调CXCR4基因的表达，降低黑色素瘤细胞增殖、体外侵袭及转移能力。提示CXCR4是黑色素瘤侵袭和转移过程中的重要调控因子，为黑色素瘤的生物治疗提供了新的靶分子并奠定实验根底。 研究背景 恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)在整形外科临床所遇见的体表肿瘤类型中相对少见，但其恶性程度极高。在所有原发于皮肤的恶性肿瘤中，皮肤恶性黑色素瘤虽然只占4，而其致死率却占79。黑色素瘤的发病率正以每年57的速度逐年上升，在男性是发病率增长最快的恶性肿瘤。黑色素瘤早期即可通过血行传播发生远处转移，对放/化疗均不敏感，

52、预后较差。侵袭和转移是黑色素瘤最显著的特征和影响患者生存的首要因素，也是其治疗困难的一个重要原因。所以，说明黑色素瘤侵袭转移的机理，探索有效控制黑色素瘤侵袭和转移的途径，对进一步改善黑色素瘤疗效、防止其复发、转移和提高患者生存率均具有重要意义。 近年研究说明，趋化因子受体CXCR4参与肿瘤侵袭和转移的多个关键环节。基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor，SDF-1)与其特异性受体CXCR4所构成的SDF-1/CXCR4生物学轴在多种肿瘤播散、细胞选择性和非随意转移过程中发挥重要作用。然而，CXCR4在黑色素瘤侵袭转移过程中所起的具体作用和调控机制，以及沉默

53、CXCR4基因对黑色素瘤侵袭和转移有何影响尚待深入研究。 目的 探讨SDF-1/CXCR4信号通路在黑色素瘤侵袭和转移过程中的作用，以及利用shRNA干扰技术沉默CXCR4基因表达后对黑色素瘤侵袭和转移的影响及机制，以寻求一条黑色素瘤基因治疗的新途径。 方法 (1)应用Western blot和RT-PCR检测CXCR4基因在高转移性黑色素瘤MV3细胞系中的表达，利用Envision免疫组织化学法观察人黑色素瘤原发灶及转移组织中CXCR4的表达。 (2)设计合成CXCR4特异性shRNA，将其插入pSilencer质粒载体，并将重组后的pSilencer质粒载体经脂质体包裹转染黑色素瘤MV3细

54、胞株，抗性筛选稳定抑制CXCR4表达的永久性克隆。应用RT-PCR技术检测shRNA对黑色素瘤细胞内CXCR4 mRNA表达，用FCM法检测细胞周期的分布情况，应用Western blot法检测CXCR4蛋白变化。 (3)采用Transwell小室模型检测细胞体外侵袭能力，MTT法检测黑色素瘤细胞增殖情况。 (4)用MV3细胞注射构建裸鼠皮下移植瘤动物模型，评价CXCR4-shRNA瘤体内直接注射对黑色素瘤的抑瘤效应。通过裸鼠尾静脉瘤细胞注射方法，建立黑色素瘤定向肺转移模型，检测CXCR4基因沉默对黑色素瘤细胞肝、脑、肺等实质性器官转移能力的影响。运用RT-PCR和Envision免疫组织化学

55、方法检测瘤细胞株和瘤体内MMP-2表达变化。 结果 (1)Western blotting检测结果显示：Mv3细胞中CXCR4的蛋白片段表达量较高；免疫组化结果显示：转移性黑色素瘤原发灶组织及转移灶内CXC4高表达。 (2)成功构建和筛选出CXCR4特异性的shRNA质粒载体。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳证实CXCR4-shRNA插入pSilence载体，成功筛选稳定抑制CXCR4表达的永久性细胞克隆，实验组和无关对照组均有抗性细胞生长。阳性克隆测序结果说明合成的寡核苷酸链序列插入正确。稳定转染CXCR4-shRNA的高转移性黑色素瘤细胞Mv3的CXCR4 mRNA和蛋白的表达较空白对照组明显下

56、调。FCM检测显示细胞周期分布无明显改变。 (3)Transwell小室体外趋化侵袭实验结果说明，黑色素瘤MV3细胞体外侵袭能力减弱。MTT Assay检测结果显示，CXCR4-shRNA质粒载体转染MV3细胞后，瘤细胞增殖活性降低，细胞活力明显下降。 (4)裸鼠黑色素瘤皮下种植瘤成功率为100，绘制的肿瘤生长曲线说明，CXCR4-shRNA转染组的肿瘤生长明显受到抑制。CXCR4-shRNA转染组与空白对照组和阴性CXCR4-NC对照组比拟在统计学上具有显著性差异(P0.01)。肝、脑组织内转移瘤数目实验组较对照组明显少。黑色素瘤定向肺转移能力下降：空白对照组、无关对照组和实验组裸鼠肺转移发

57、生率分别为：90、87.5和20；空白对照组、无关对照组和实验组裸鼠的肺转移结节数目分别为206、165和23个。RT-PCR及细胞免疫荧光染色显示，转染CXCR4-shRNA的黑色素瘤瘤MV3细胞系MMP-2表达下调；免疫组织化学结果显示，实验组裸鼠黑色素瘤瘤体及转移灶组织MMP-2的表达低于对照组。 结论 (1)CXCR4在人黑色素瘤组织和高转移性黑色素瘤细胞株MV3中的表达明显上调可能与黑色素瘤的侵袭转移有关。 (2)经用脂质体介导的shRNA体内表达法制备的CXCR4-shRNA在黑色素瘤细胞中可获得高效转染，并能产生特异性的基因沉默效应，以CXCR4为靶向的shRNA能够有效下调CX

58、CR4基因的表达。 (3)shRNA介导的CXCR4基因沉默在体外实验能够显著抑制黑色素瘤细胞的生长和增殖活性，减弱体外侵袭能力。 (4)shRNA介导的CXCR4基因沉默可在黑色素瘤皮下种植瘤产生抑瘤效应，明显降低肝、脑器官转移能力和定向肺转移能力。其机制可能与SDF-1/CXCR4信号途径阻断，进而抑制MMP-2的表达有关。 CXCR4是黑色素瘤侵袭和转移过程中的重要调控因子，SDF-1/CXCR4生物轴在调控黑色素瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用，CXCR4有望成为预防和治疗黑色素瘤侵袭和转移的潜在靶标。特异性shRNA介导的CXCR4基因沉默下调CXCR4基因表达，有望为转移性黑色素瘤的分子靶向基因治疗提供一条新途径。侵袭和转移是影响黑色素瘤患者生存的首要因素，也是其治疗的最大障碍。SDF-1/CXCR4生物轴作为少数具有点对点精确传导生物信息的生物轴系统之一，在多数肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用。越来越多的研究说明，趋化因子受体CXCR4(Chemokine receptor CXCR4)参与肿瘤侵袭和转移的多个关键环节。本研究利用RNA干扰技术下调趋化因子受体CXC