GST标签的去除

1、GST 标签的去除可在目的蛋白的功能或结构研究之前进行。根据目的蛋白的性质不同，完全消化所需的蛋白酶量、温度、及孵育长度也各异。含有 PreScission 蛋白酶、凝血酶或 Xa 因子识别位点的标签蛋白可在与 GlutathioneSepharose层析填料结合时切割，或者洗月后在溶液中切割。当 GST 蛋白与柱结合时，切割释放了目的蛋白，它与结合缓冲液一起洗脱，而 GST 部分仍与填料结合。一般来说，柱上切割是推荐使用的方法，因为许多潜在的杂质都能洗掉，目的蛋白在洗脱时具有更高的纯度。如果需要优化切割条件，建议洗脱后切割。从蛋白或肽段制备中去除丝氨酸蛋白酶如凝血酶、Xa 因子和 PreSc

2、ission 蛋白酶，可利用BenzamidineSepharose4FastFlow 来进行，此填料有大包装。为了方便，BenzamidineSepharose4FastFlow也有预填充的 HiTrapBenzamidineFF1ml 和 5ml 柱。凝血酶凝血酶能够对带有可接近的凝血酶识别序列的融合蛋白进行位点特异的切割，用于消化包含凝血酶识别序列的 pGEX 载体所制备的 GST 标签蛋白(pGEX-1 入 T、pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2 及 pGEX-4T-3)。在 22C,1XPBS 中，一个单位的酶 16 小时可切割 100ag 待测

3、 GST 标签蛋白，切割效率在 90%以上。Xa 因子纯化自牛血浆的 Xa 因子特异切割四肽 Ile-Glu-Gly-Arg 之后的蛋白，可用于消化包含此序列的 pGEX 载体所制备的 GST 标签蛋白(pGEX-3X、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2 和 pGEX-5X-3)。在 22,1mMCaCl2、100mMNaCl 和 50mMTris-HCl(pH8.0)的反应体系中，一个单位的酶 16 小时可切割 100ag 待测 GST 标签蛋白，切割效率在 90%以上。PreScission 蛋白酶PreScission 蛋白酶是一种遗传改造的融合蛋白,由人鼻病毒 3C 蛋白酶和 GS

4、T 组成。这种蛋白酶是专为蛋白酶的去除而设计，能实现同时的蛋白酶固定和pGEX-6P-2 和 pGEX-6P-3）所产生的 GST 融合蛋白的切割。PreScission 蛋白酶特异切割 Glu和 Gly 残基之间的识别序列 LeuGluValLeuPheGlnGlyPro。 蛋白酶在 4C 具有最大活性， 因此切割在低温下进行，改善了目的蛋白的稳定性。在 5C,50mMTris-HCl、150mMNaCl、1mMEDTA、1mMDTT（pH7.0）的反应体系中，一个单位的酶 16 小时可切割 100 心 g 待测 GST标签蛋白，切割效率在 90%以上。GST 标签蛋白可通过亲和层析，利用固

5、定在基质上的谷胱甘肽从例如细菌裂解液中轻松纯化。GST 与谷胱甘肽之间的高特异性确保了单个步骤就能获得高纯度。洗脱在温和、非变性的条件下进行，因此保留了蛋白的抗原性和功能。通用电气医疗集团现有多种亲和纯化产品。GlutathioneSepharose 填料（表 1）也有多种形式,从预填充的 MultiTrap?96 孔过滤板到预装柱的 SpinTrap?、GraviTrap?、HiTrap?及HiPrep?柱，或实验室包装（填料包装的体积从 25ml 到 500ml）。不同的形式提供了从微克到克规模的样品的纯化选择。表 1.GlutathioneSepharose 填料的特征pGEX-6P 载

6、体（pGEX-6P-1CharacteristicsGlutathioneSepharoseHighPerformanceGlutathioneSepharose4FastFlowGlutathioneSepharose4BMatrixHighiycross-linked,6%agaroseAverageparticle34pmsizeBindingcapacity110mgRecommended10mg10mg50-300cm/h5cn/bJ 生1 每毫升填料结合的重组谷胱甘肽硫转移酶。GST 蛋白的结合取决于上样样品中蛋白的大小、构象和浓度。GST 与谷胱甘肽的结合也是流速依赖的，低流速通

7、常会提高结合能力。这对于上样过程很重要。蛋白性质、pH 和温度，以及使用过的填料也会影响结合能力。2 室温下的水。仪器的选择将取决于特定的纯化。在利用微型离心柱时洗脱在台式离心机中进行，或利用重力流柱手动进行，或利用蠕动泵或注射器再加上预填充的 GSTrap 柱进行分步梯度洗脱。GSTMultiTrap96 孔板是为小体积的高通量筛选而设计的，每孔能纯化多达500ggGST 标签蛋白。每根 GSTSpinTrap 柱能纯化多达 500ag 蛋白。对于更大量的纯化，预装柱如 GSTGraviTrap、GSTrap 和 GSTPrep16/10 则提供了卓越的形式。GSTSpinTrap 柱GST

8、SpinTrap 柱非常适合放大之前的表达水平及纯化条件的筛选。柱的设计可用于微型离心机。每根柱子含有 50 屋 GlutathioneSepharose4B,足够纯化最多 500 窥重组 GST。柱子在含有 0.05%Kathon?（一种抗菌的防腐剂）的 1XPBS 缓冲液中经过了预平衡。每个包装含有50 根柱子。随机选择大肠杆菌转化物，这些转化物中含有表达带 GST 标签的人肌红蛋白的 cDNA,之后表达，并用 GSTSpinTrap 柱进行纯化。人肌红蛋白的 cDNA 与线性化的 pGEX-5X-1 连接，并转化大肠杆菌 BL21 细胞。24 个随机选择的克隆接种到 3ml 培养基中，过

9、夜培养。用 IPTG 诱导表达 2 小时。取每个培养物 1.5ml,通过反复冻融步骤制备裂解液，再上样到 GSTSpinTrap 柱中。取每种还原型谷胱甘肽洗脱液的等份，上样到 SDS 凝胶中，用于 SDS-PAGE 的分析（图 1）。结果显示，24 个转化物中的 7 个表达了带 GST 标签的肌红蛋白MG123456789101112图 1.筛选 24 个随机选择的含有表达带 GST 标签的人肌红蛋白的 cDNA 的大肠杆菌转化物，将洗脱液进行 SDS-PAGE 分析。M=LMW-SDSMarkerKit。1-24 泳道含有利用还原型谷胱甘肽从 GSTSpinTrap 柱上洗脱下来的产物。G

10、STGraviTrap 柱GSTGraviTrap 是方便的一次性柱子，其中预装了 2mlGlutathioneSepharose4B,足够纯化最多 20mgGST 标签蛋白。每个包装含有 10 根预装柱，是由生物兼容的聚丙烯制造的。特殊的釉料保护填料在纯化过程中不会变干。GSTGraviTrap 柱在送达时的包装可便利地转化成柱子支架(Workmate)。产品包装中的塑料托盘可用于收集废液。当处理体积超过 10ml 时，将Labmate?PD-10BufferReservoir 与柱子连接，能将上样量增加至大约 35ml。9700。6600045000-GST-myoglobin-GST20

11、10014400MG131415161718192021222324M970006600045000300。 。-GST-myoglobin-GST2010。GSTBulk 试剂盒GSTBulk 试剂盒含有 10ml 大包装的 GlutathioneSepharose4B 和 5 根一次性的柱子。有了这个试剂盒，GST 标签蛋白可利用柱层析或分批法进行纯化。GSTBulk 试剂盒含有足够的试剂，能纯化最多 50mgGST 标签蛋白。GSTMultiTrap96 孔过滤板GSTMultiTrap96 孔过滤板目前有两种选择：GSTMultiTrapFF 和 GSTMultiTrap4B，分别预装

12、了 GlutathioneSepharose4FastFlow 和 GlutathioneSepharose4B。两种产品都能提供高重复性、高通量的筛选，从不澄清或澄清的样品中小规模快速纯化 GST 标签蛋白。典型的应用包括不同重组子的表达筛选，蛋白可溶性的筛选，以及小规模平行纯化条件的优化。利用 GSTMultiTrap 可直接从不澄清的细胞裂解液中纯化最多 500ggGST 标签蛋白/孔，缩短了操作时间，将敏感目的蛋白的降解降至最低。96 孔板形式具有很大的灵活性，可与自动化的机器人系统共同使用，也可通过离心或抽真空手工操作。孔与孔之见、板与板之间的一致性能确保了高重复性。利用 GSTMu

13、ltiTrapFF 来设计缓冲液筛选研究，确定纯化 GST-海马钙结合蛋白的最佳缓冲液条件。检测的参数有缓冲液、pH、氯化钠、甘油、DTT 和谷胱甘肽。同时还进行了超声破碎与市售细胞裂解试剂盒的使用效果比较。利用 MODDE?软件（Umetrics）来进行因子设计（实验设计）和统计分析。不同缓冲液条件和样品制备方法随机应用到过滤板中。样品、结合缓冲液或洗涤缓冲液中谷胱甘肽的存在显著降低了纯化的 GST-海马钙结合蛋白的产量，而缓冲液对产量无影响。低 pH 改善了产量，而 pH 和添加剂如 DTT、甘油或氯化钠未显著影响纯度（图2）。筛选结果表明，对于 GST-海马钙结合蛋白的纯化，获得最高产量

14、和纯度的缓冲液条件是介于 10到 20mM 的磷酸钠，140 至 ij400mM 的 NaCl,pH6.2-7.4。样品制备可通过市售的细胞裂解试剂盒及超声破碎来进行，不会显著影响纯化结果1.LMVJSDS-MarkrKitI1?-0446-01-之.SttirtiTKJtenal3.Sonicotion.10mHP&S.10mMNaCl.pH7.4白.CslLytickit.10mMPSS.litOmMNoCI7.H5OlLytickjt10mMPBSA00mMNaCI2mMglutathiijny5%glysrolpH36.SonKotion,20mHPE&TOOmMNaC

15、l.5%g机电口|pH527.Sonwiotion20mMP65,00mMNQCI.3EMqlutothntpH68.Sontcotion.50mMTris-HCl.400mMNaCl.glycerolpH6.29.Sonkotion,50mMTris-HCl,pH610.Sonkation,50mMTrt5-HCl,1+0mHNaCl,2mMalutathk*nP5mMDTI.51qtycrolpH811.Sonkation,100mHTrbHCL140mMNad.5mHDTTpH&212SonkotiorvlOOmMTriHHd,270mHNod,11nMglutathione2.

16、5mb.T2.5%glycerol.pH7.4图 2.将 GSTMultiTrapFF 过滤板的一些孔中收集而来的 GST-海马钙结合蛋白的洗脱组分进行SDS-PAGE（还原条件，ExcelGel?SDSGradient8-18；考马斯蓝染色）。GST 缓冲液试剂盒GST 缓冲液试剂盒含有纯化 GST 标签蛋白所使用的结合及洗脱缓冲液的储备溶液。试剂盒省去了耗时的缓冲液制备，促进了快速、便利且重现性好的纯化工作。足够的试剂可纯化最多 20mgGST 标签蛋白。GST 缓冲液试剂盒含有 10XPBS,还原型谷胱甘肽、稀释缓冲液和操作指南小册子。蛋白纯化的放大纯化过程可轻松放大；Glutathio

17、neSepharose4FastFlow、GlutathioneSepharose4B 及GlutathioneSepharoseHighPerformance 都有更大的预装柱，以及大包装的填料。推荐增加第二步的凝胶过滤步骤，来精炼目的蛋白，去除可能的聚集物。97000660004500030000201001铝0。GST-H7391011LanesGSTrap 亲和柱是 1ml 和 5ml 的 HiTrap 预装柱，能纯化毫克级的 GST 标签蛋白。GSTrap 柱填充有三种不同的 GlutathioneSepharose 填料GSTrapFF、GSTrap4B 和 GSTrapHP。利用

18、注射器及提供的连接器，蠕动泵或液相色谱系统如？KTA?design,可进行样品上样、洗涤和洗脱。GSTprepFF16/20 是预装了 GlutathioneSepharose4FastFlow 的 20mlHiprep 柱，可用于毫克至克规模的 GST 标签蛋白的纯化。来自通用电气医疗集团(GEHealthcare)的谷胱甘肽硫转移酶(GST)基因融合系统是一种表达、纯化和检测大肠杆菌中所产生的 GST 标签蛋白的多功能系统。系统包括三个主要成分：pGEX质粒表达载体、GST 纯化的产品以及一系列 GST 检测产品。一系列切割 GST 标签的位点特异蛋白酶则是该系统的补充。GST 亲和标签实

19、现了温和的纯化过程，不会影响蛋白的天然结构和功能。GST 基因融合系统的优势包括：?所有 pGEX 载体带有 tac 启动子，实现化学诱导的高水平表达?温和、非变性的缓冲液成分，以分离活性蛋白?基于 GlutathioneSepharose?填料的亲和层析产品实现了从微克到克规模样品的一步纯化?方便的预装柱形式适合单个样品或平行筛选多个重组克隆?pGEX 载体上的 PreScission?蛋白酶、凝血酶或 Xa 因子识别位点能将目的蛋白从融合产物中切割下来?利用抗-GST 抗体轻松检测融合蛋白在天然情况下，GST 以分子量 26,000 的蛋白存在，它在大肠杆菌中的表达产物具有完全的酶活。经过

20、鉴定，pGEX 载体的重组日本血吸虫（Schistosomajaponicum）GST 的晶体结构与天然蛋白一致。pGEX 质粒载体将基因或基因片段与 GST 融合后，在细胞内高水平诱导表达。重组蛋白很容易利用 GlutathioneSepharose 填料通过亲和层析从比如大肠杆菌细胞裂解液中纯化（图 1）,要么是预装柱，要么是分批纯化。图 1.GlutathioneSepharoseHighPerformance、GlutathioneSepharose4FastFlow 以及GlutahioneSepharose4B 目前都有大包装填料，预装柱以及多孔板，用于 GST 标签蛋白的纯化。利

21、用位点特异的蛋白酶，可实现目的蛋白与 GST 的切割，此蛋白酶的识别位点位于 pGEX 载体上多克隆位点的上游。GST 标签的切除是在柱中进行的，作为纯化步骤或纯化后离线的一部分。重组蛋白可利用 GST 检测模块中提供的免疫分析来检测，或用抗-GST 抗体在 Westernblotting 中检测，或通过比色分析来检测。pGEX 载体通过将一个基因或基因片段插入某个 pGEX 载体的多克隆位点，可构建出 GST 标签蛋白。载体提供了三种翻译读码框，从 EcoRI 限制性酶切位点开始（详见表 1）pGEX 载体是为基因或基因片段的高水平细胞内诱导表达而设计的。大肠杆菌中的表达产生了标签蛋白，GS

22、T 部分在氨基端，目的蛋白在竣基端。目前有 13 个 pGEX 载体（详见图 2）;所有载体都有 tac 启动子，用于高水平的化学诱导表达，以及内部的 laclq 基因，在任何大肠杆菌宿主中使用。pGEX-lXTThrombnILeuVolProArgGlySeeProGluPhlieVolThrAspCTGGTTCCGCGTGGATCCCCGGAAHCATCGTGACTGACTGACGABomHIEcoRIStopcodonsPGEX-2TThrombinlieuVolProArgGlySJpro3gHisArgAspCFGGnCCGCGTGGATCCCCGGGAAHCATCGTGACTGA

23、CTGACG一I$(nol%oRJPGEX-2TKThrombinKmoseleuVolProArgGlySrllArgArgAlaSrVdlCTGGTTCCGCGTGGATCTCGTCGTGCATCTGHGGATCCCCGGGAATTCATCGTGACTGAJEcoRlStopco5onsPGEX-4T-1ThrombinILeuVolProArgGly$erIPTOGluPheProGlyArgLeuGluArg*oHtsArgAspCTGGTTCCGCGTGGATCCaGGAAHCCCGGGTCGACTCGAGCGGCCGCATCGTGACTGACacnHIsmal) )S。11Notl

24、StopcodonspGEX-4T-2ThrombinkwVolProArgGlySrlp( (o38ProG&ThrAraAloAloAhCTGGTTCCGCGTGGATCCCCAGGAATTCCCGGGTCGACTCGAGCGGCCGCATCGTGABomHIZcoftl5mq；SolxhoNtlStopcodonpGEX-AT-3ThrocnbnllwVolProArgGlySrlftoA$nSrArgVolAspSerSrGlyArgIto7olThrAspCTGGTTCCGCGTGGATCCCCGMTTCCCGGGTCGACTCGAGCGGCCGCAKGTGACTGACTG6

25、omHI蕊疝1-Smo1so福 厂NodStopcodonsPGEX-3XFoctorXohieGluGlyArJ*GlyHeProGlyA$nSfSaATCGAAGGTCGTGgGATCCCCGGGAATTCATCGTGACTGACTGAC嬴HI1端。用cvcodonTPGEX-5X-1FuelsXQIIkGuGl/Argl*GlykProGluPh*fro3ArgGluArgProH$ArgAspATCGMGGTCGTGGGATCCCCGAAHCCCGGGTCGACTCGAGCGGCCGCATCGTGACTGAEnHIJ对而i而TStopcodonsPGEX-5X-2FactorXoIHe

26、GluGyArglGly必ProGlUeProGl/SerIhrArgAloAloAlo$rATCGAAGGTCGTGfiGATCCfC.GGA”CCC空飞叼C%GCGGCC(yATCGTGA,eamHI15mol荷，hot0tlStopTodonPGEX-5X-3FactorXoIII。GuGArgrGlySProArgA$nS3A( (9VolAspSr$rGlyZU9VolThrAspATCGAAGGTCGTGGGATCCCCAGGAATTCCCGGGTCGACTCGAGCGGCCaATCGTGACTGACTGABomHI20RI十；0尸$01Notl_*-ItopcodonTpGEX-

27、6P-lPre$ci$sonProtosleuGluVolLeuFheGlnGlyProLeuGlySerProGluFheFToGlyArgleGluArgProHisCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCTGGGATCCCCGGAATTCCCGGGTCGACTCGAGCGGCCGCAT11( ( -1) )JBom网EcoRI初一SH-NotlPGEX-6P-2PrSci$knProtectluGluVolSuPheGh，GlyFroIQUGlySaProGlylieProGlySecThrAraAloAloAloSerCTGGAGTTCTGHCCAGGGGCCCCTGGdATCCCCAGGAAHCCCGGGTCGACTCGGCGGCCGCATCGLJJ l。二二“iBamHIEcoM饷Not1PGEX-6P-3PreScissonProteoseLeuGluVolleuFtwGlnGlyProUuGlySfProA$nS4rArgVolAspSaSrGlyArgCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCTGGGATCCCCGAATTCCCGGGTCGACTCGAGCGGCCGC11117,在JJIBamHICcoRI5molSoilNod图 2.谷胱甘肽硫转移酶融合载体的图谱，显示出读码框和主要特征。所有 13 个载体在三种读码框