exosomes外泌体实验方案

1、外泌体分离提纯草案By朱旭峰以超高速离心的方法来分离外泌体(细胞上清)1.1细胞培养液(CM)是来自无菌的80%-90%勺培植细胞， 并用浓度比1:1.000的蛋白酶抑制剂混合。(sigma)1.2快速地将 CM 用 0.22m 的过滤筛(Millipore)过滤，来分离完整地细胞和残渣。超速离心于 120,000_g(SorvallWXULTRASERIE&otorA-641)4C.2 小时1.3用 1mL 冷的 PBS 重悬和清洗小囊泡，再次超速离心 120,000_g(SorvallWXULTRASERIES,rotorA-641)C4.2 小时1.4再用 100L 冷的 PBS

2、 重悬后转移到低粘附的管中1.5快速地使用或置于-80C 中待用为检测外泌体的蛋白浓度， 取 2L 的样品置于卡上，用 DirectDetect?(Millipore)2 材料1.%2 细胞培养液2.%2 蛋白酶抑制(Sigmaj)c)过滤筛(Millipore)4、冷的 PBS5、低粘附的管6、DirectDetect?(Millipore)以超高速离心的方法来分离外泌体(人血浆)1、在提取外泌体之前应该向血浆里添加 1；500 浓度比的蛋白酶抑制剂(Sigma)1、将上清液移至一个新的管中离心 200*g20 分钟 4c1、小心地再将上清液移至新的管中离心 10000*g30 分钟于 4c

3、 来去除较大的囊泡、1、此阶段的样品可以1、将样品用 0.22 仙 m 的注射器滤筛(Millipore)过滤并且离心110000g(SorvallWXULTRASERIES,rotorF65L、24c1、用冷的 PBS 重悬后再次超速离心(110,000g,1h,4C).,1、将外泌体小心干燥并且用冷的 PBS 重悬1、外泌体应该立即使用或-80 摄氏度冷藏2.材料a)蛋白酶抑制(Sigma)b)过滤筛(Millipore)c)冷的 PBSd)低粘附的管e)DirectDetect?(Millipore)1.%2ExoQuickExoQuickM化学沉淀法ExoQuiclTM的使用要按照厂家

4、提供的说明书来实行该试剂盒可以简单地提取 CM,人血浆，和血清里的外泌体，只需用倒相管按照所指示的量来加入 ExoQuic1TM试齐 I盒里的溶液溶液孵化过夜，在 4c 温和的摇晃在流式细胞仪缓冲液中洗涤试剂盒里的带荧光的免疫磁珠已经被绑定，用流式细胞仪鉴定即可(BDBioscienceS)己合使用 CellQuest 的软件。2 材料a)ExoQuic1TM试齐 1J 盒b)流式细胞仪2.%2用 METM分离外泌体样品(CM 或人血清)要按照商品说明书(NewEnglandPeptide-NEP)稀释样品要事先处理好，17,000g7 分钟来去除微粒物质然后用 METM试剂来孵化样品(NEP

5、peptide)并且用旋转震荡在室温混合 15 分钟孵化完的样品要室温离心 10000g7 分钟所有的样品要用 PBS 洗三次最后小囊泡要用合适的 KIT 缓冲液重悬3.%2抗体以下的外泌体有关的一抗和二抗是用作：WestenBlot,ELISAF 口 FACS(流式细胞术)mAbaCD9,mAbaCD63,mAbaCD81,mAbaCD63-FITCaCD81-PE,来自于BecktonDickinson,mAbaCD63-biotin(BioLegend),mAbaAlix(SantaCruz),mAbaTsg101(Abcam),pAbaRab5(SantaCruz),mrAbaRab5

6、(Epitomics),mAbaCalnexin(Abcam),二抗是 anti-Mouse 和 anti-RabbitHRP-conjugated(Dako)专门的月中瘤外泌体(HBM1andHBM2)结合抗体由 HansaBioMedR&Dteam.提供4.%2用 WestenBlotWestenBlot 探测外泌体的蛋白将样品用合适容积的蛋白 loadingBuffer(Lonza)重悬在合适的浓度下用 SDS-pag 吩离外泌体的蛋白质把蛋白转到硝酸纤维素膜上(GEHealthcare一二抗体孵化信号要在暗室里用 ECLW 加5.%2外泌体免疫捕捉和蛋白定量 ELISAELIS

7、A从已经加了不同抗体的96孔板(Nunc)里的细胞上消或者人血浆为免疫捕捉而筛选外泌体结合抗体(96 孔板的抗体用碳酸氢盐缓冲液 PH=9.6 稀释，用0.5%BSA定和 1%的蔗糖稳定)PBSfc 入 0.05%Tween-20(PBST 作为洗涤缓冲液，但如果有提示说明，应该用PBSW 释样品将外泌体样本， CM,人血浆样本加入 96 板孔内(最终容积为 100Nl),孵化 4c 过夜或者室温 2 小时(可以使用商业化的 exosomes 捕捉平板(HansaBioMed)传统上的 protocol 包含使用主要的抗体(aCD9 或 aCD63 在样品缓冲液(0.5%BSAPBS 中稀释

8、2 小时于 4C。在大量的冲洗后，用辣根过氧化物酶二抗(BioRad),在需要的地方用样品缓冲液1 小时于 4C。基于 BMBluePODSubstrat 辣根过氧化物酶的底物(Roche 反应的光密度反应，在 450nm 的酶标仪下记录 Infinite_M1000(TECAN)QuantaBluFluorogenicPeroxidaseSubstrate(ThermoScienti 侬用连续的激发光束在 325/425nmSuperSignalWestFemtoChemiluminescentSubstrate(ThermoScientific)要先孵化 1 分钟然后在酶标仪化学发光模式读

9、数2.材料a)96 孔板b)碳酸氢盐缓冲液 PH=9.6BSAPBSTween-20 蔗糖d)辣根过氧化物酶二抗e）辣根过氧化物酶的底物f）酶标仪6.%2磁珠捕获外泌体. .商业化的预包裹的乳胶微球根据商品说明书（HansaBioMed）来分离外泌体每个样品先用 1ml 的 PB 既稀释选用合适的珠子去孵化 4c 过夜，旋转震荡。之后可以用离心的方法来分离（5000 个，10 分钟），再用 PBS 诜涤 3 次。. .磁珠分离法比较了“1 仙 m 大小的链霉亲和素磁珠”（ThermoScientific,88816）和“亚显微大小的超磁力珠”（内部订购）先用 PBSTfc 涤磁珠然后加入 1.

10、2叱g 的抗体（外泌体结合的同种抗体，CD9K体（BecktonDickinson）生物素化的抗体用于链霉亲和素磁珠，然后用 PBS 诜三次，再用合适的固定剂固定（干酪素，BSAE 人血清）室温 1 小时重悬于 PBS 然后加入样品（CM 或人血浆）为了最终可以富集磁珠到近 108/ml,将其孵化过夜 4 摄氏度旋转 rotation用电磁分离磁珠，在量化外泌体蛋白或提取外泌体 RNAi 前用 PBST洗三次磁珠也会溶解于 Laemmlibuffer,所以在做为 westenbolt 先将其煮沸或者可以选择做 bead-basedELISA. .免疫珠分离法用主要的抗体孵化免疫磁珠 2 小时于室温，用 EL