抗(抑)菌试验

1、抗(抑)菌试验2.1.8.1 目的 测定抗(抑)菌产品对细菌和真菌的抗(抑)菌作用。 常使用的方法有抑菌环试验、 最小抑制浓度测定试验、 滞 留 抑 菌 效 果 测 定 试 验 、洗衣粉抗菌效果测定试验、振荡烧瓶试验、浸渍试验与奎因试验，可视 情况选用。2.1.8.2 抑菌环试验2.1.8.2.1 原理利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度， 以显示其抑菌作用。 试验通 过抑菌环大小以判断其是否具有抑菌能力。 本试验适用于抑菌剂与溶出性抗 (抑) 菌产品的鉴定。2.1.8.2.2 试验器材(1) 金黄色葡萄球菌 (ATCC 6538) 、大肠杆菌(8099) 、白色念珠菌 (ATCC 1

2、0231) 菌悬液(见 2.1.1.2) 及根据抑菌剂特定用途所用的其他菌悬液。(2) 抑菌剂载体 (5 mm 直径园形新华一号定性滤纸片，经压力蒸汽灭菌 处理后，置120C烤干2h,保存备用)。(3) 活菌培养计数所需器材 ( 见 2.1.1.3) 。 微量移液器(5卩l50卩l，可调式)。(5) 游标卡尺。(6) 营养琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基与沙堡琼脂培养基2.1.8.2.3 操作程序(1) 抑菌片的制备 : 对液体抑菌剂，取无菌并干燥的滤纸片。每片滴加实际使用浓度抑菌剂溶液20卩l ,然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内， 开盖置 温箱(37 C)中烤干，或置室温下自然干燥后备用

3、。溶出性抗(抑)菌产品，可直接制成直径为5mm厚不超过4mm圆片(块)， 每 4 片 ( 块 ) 一组。(2) 阴性对照样片的制备 : 取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌蒸馏水 20卩l，干燥后备用。溶出性抗(抑)菌产品的阴性对照样本，应取同种材质不含抑菌成份的 样品，制成与试验组大小相同的样片 (块)。(3) 试验菌的接种：用无菌棉拭子蘸取浓度为 5X 105cfu/ml5X 106cfu/ml试验菌悬液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹 3次。每涂抹1 次，平板应转动 60°，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温 干燥 5min 。(4) 抑菌剂样片贴放 ： 每次试验贴放

4、 1 个染菌平板，每个平板贴放 4 片试 验样片， 1 片阴性对照样片，共 5 片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各 样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上。贴放好后，用无 菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置37C温箱，培养16h18h 观察结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径 ( 包括贴片 ) 并记录。试验重复 3次。测量抑菌环时， 应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。 测量其直径应 以抑菌环外沿为界。2.1.8.2.4 评价规定(1) 抑菌作用的判断 ： 抑菌环直径大于 7mm 者，判为有抑菌作用。抑菌环直径小于或等于 7mm 者，判为无抑菌作用。(2) 3

5、 次重复试验均有抑菌作用结果者，判为合格。(3) 阴性对照组应无抑菌环产生。否则试验无效。2.1.8.2.5 注意事项(1) 每次试验均应设置阴性对照， 不可省略。 在报告中亦必须将对照组的 结果列出。(2) 接种用细菌悬液的浓度应符合要求。 浓度过低， 接种菌量少， 抑菌环 常因之增大 ; 浓度过高，接种量过多，抑菌环则可减小。(3) 应保持琼脂浓度的准确性，否则可影响抑菌环的大小。(4) 培养时间不得超过 18h 。培养过久， 部分细菌可恢复生长， 抑菌环变 小。(5) 抑菌环直径可受抑菌剂的量、抑菌性能和干湿度影响。故抑菌剂滤纸片应在 试验当天制备。2.1.8.3 最小抑菌浓度测定试验(

6、琼脂稀释法)2.1.8.3.1 原理本试验采用琼脂稀释法将不同浓度的抑菌剂混合溶解在琼脂培养基中， 然后点种细菌，通过细菌的生长与否，确定抗(抑)菌物质抑制受试菌生长的最 低浓度，即最小抑菌浓度(Mi ni mal In hibitory Co nee ntratio n, MIC)。本方法适用于不溶性抗(抑)菌产品。2.1.8.3.2 试验器材(1) 菌株金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 ，大肠杆菌 8099 或 ATCC 11229。 可根据抑菌剂的用途，选择特定的菌株。(2) 水解酪蛋白琼脂培养基(MH ,称取38gMH琼脂培养基，溶于1000ml水中， 加热至沸腾溶解，然后121C高

7、压灭菌15min,置45C50C水浴备用，此培养 基将用于对照试验。( 3) 0.03mol/L 磷酸盐缓冲液 pH7.2。(4) 加样器(1卩l10卩l )。(5) 45C50 C水浴恒温箱。( 6)吸管、试管、平皿。(7) 37 C培养箱。2.1.8.3.3 操作步骤(1) 抗(抑)菌溶液的配制：以无菌操作取 5ml或5g (固体研磨后)样品，放 入 45ml 灭菌磷酸缓冲液中， 充分震荡溶解， 配成 10%的均匀分散的溶液或悬液。(2) 含抗菌剂培养基配制：将已配成 10%勺抗(抑)菌溶液或悬液用 PBS做对 倍系列稀释成不同浓度的受试液，置 45C50C水浴恒温备用。(3) 双倍浓度培

8、养基配制：称取76gMH琼脂培养基，溶于1000ml水中。加热至 沸腾溶解。然后121C压力蒸汽灭菌15min，置45C50C水浴备用。此培养基 将用于稀释抗(抑)菌溶液或悬液。(4) 含抗(抑)菌液培养基的配制：分别取10ml系列稀释的抗菌液加入平皿内。 将在45C50C水浴中的双倍MH琼脂培养基10ml，加入平皿内，边加边摇晃 平板，使抗(抑)菌液和培养基充分混匀，待凝固后备用。(5) 用加样器取1卩l2卩l (含菌量约为107cfu/ml )菌悬液点种于含抗(抑) 菌液培养基的平皿，接种后所形成的菌液圈直径约 5mm- 8mm(每个点菌量约为 104cfu )。(6) 以同样方法接种不含

9、抗(抑)菌成分的MH琼脂平板，作为阳性对照。(7) 将接种后的平板放置35C培养箱中，倒置培养18h24h，观察结果。2.1.8.3.4 评判规定菌落生长被完全抑制的最低抗(抑)菌液浓度为该样品对受试菌的MIC。单一菌落生长可忽略不计。2.1.8.3.5 注意事项( 1 )接种时，应由低抗(抑)菌剂浓度向高浓度平板依次接种，最后接种对照 平板。(2) 为了保证平板受热均匀，培养时平板堆放不得超过4个。2.1.8.4 最小抑菌浓度测定试验(营养肉汤稀释法)2.1.8.4.1 原理本试验将不同浓度的抑菌剂混合溶解于营养肉汤培养基中， 然后接种细菌， 通过 细菌的生长与否，确定抗(抑)菌剂抑制受试菌

10、生长的最低浓度，即最小抑菌浓 度(Minimal Inhibitory Concentration ,MIC)。本方法式用于可溶性抑菌产品。2.1.8.4.2 试验器材(1)试验菌株：金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 ，大肠杆菌 8099 或 ATCC 11229。 可根据抑菌剂的用途，选择特定的菌株。( 2)营养肉汤培养基，见附录 A。( 3)稀释液，见附录 A。( 4)吸管、试管(5) 37 E培养箱。2.1.8.4.3 操作步骤( 1)按 2.1.1.2 所示方法制备的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌悬液( 2)含抗菌剂培养基配制：将抗(抑)菌溶液用蒸馏水做对倍系列稀释成不同 浓度的受试液，取各稀释度受试液 2.5ml 加入到含 2.5ml 双倍浓度营养肉汤的试 管中。(3) 取 0.1ml 含菌量约为 108cfu/ml 菌悬液接种于含抗(抑)菌剂的营养肉汤 的试管中，作为试验组样本。(4) 以同样方法接种不含抗(抑)菌剂的营养肉汤的试管中，作为阳性对照组 样本。(5) 取 2 支含营养肉汤的试管中，作为阴性对照组样本。(6) 将试验组样本、阳性对照组样本及阴性对照组样本放置37C培养箱中，培 养48h，观察结果。( 7)试验中应将试验用菌悬液进行活菌培养计数，其作用浓度应为565X 10 cfu/ml 5X 10