运城职业技术学院

1、运城职业技术学院课程教学设计实施方案项 目3.细菌的检验任 务2.饮料中菌落总数检验授课教师成少宁、乔冬授课地点综B106 授课方法理实一体化课 时2.0教学内容国标的查找方法、所需灭菌物品数量的确定方法、方案的制定方法实施步骤1.“六个一”企业案例（微生物快速检测系统）介绍 5min 微生物快速检测系统，可以检测固态、液态、表面、膏状、浆状样本；样品检测时无需任何的前处理过程，直接丢入检测瓶即可，检测后的检测瓶自带杀菌功能；检测样品只需0.1-1mL(0.1-1g);灵敏度高达可检测1目标微生物，特异性高达99.999%;操作步骤简单，只需三个操作步骤，无需专业技术人员；仪器便携式，可直接连

2、电脑出定量分析检测报告。检测范围：活菌总数、大肠杆菌、大肠菌群、肠道杆菌科、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、李斯特菌、肠球菌、乳酸杆菌、亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、霉菌（曲霉属真菌、曲霉菌）、酵母菌，共13种菌。应用范围：食品、厨房、工具、表面、水质、疾病控制、进出口检验检疫、药品及化妆品。可以在咖啡馆、餐厅、农产品及相关的加工公司、分析实验室、药厂、药房、化妆品厂、环境检测机构、水配送公司、制水厂等。2.下发任务书，布置任务： 5min 学生分组，每5-6人为一组进行饮料中菌落总数检验国标的查找、讨论实验方案、制定实验实施方案。3.教师介绍国标的查找方法，学生查找国标（课前完

3、成） 5min食品伙伴网标准下载输入关键词“食品 菌落总数”点击“搜索”“现行有效”与“已作废”选择 “现行有效”标准进行下载4.学生分组讨论实验方案，每组写出一份实验实施方案 50min要求：（1）确定需灭菌的玻璃器皿的种类与数量，需要从实验步骤中进行提炼（共需内装9毫升生理盐水的试管4支、1毫升吸管4支、25毫升吸管1支、内装225毫升生理盐水的三角瓶1个，培养皿8套）；（2）根据培养皿的套数计算所需的培养基的量，并相应计算培养基中各个成分的含量；（3）计算需配制生理盐水的量，并计算氯化钠的含量；（4）根据实际操作过程写出详细的实验实施方案。5.学生分组上交实验实施方案，教师对每组的方案进

4、行评价和补充 25min（1）共需内装9毫升生理盐水的试管4支、1毫升吸管4支、25毫升吸管1支、内装225毫升生理盐水的三角瓶1个，培养皿8套；（2）培养基250ml，其中胰蛋白胨1.25 g；酵母浸膏0.625 g；葡萄糖0.25 g；琼脂3.75g；蒸馏水250mL；（3）生理盐水500ml，氯化钠4.25克；（4）实际操作过程：培养基制备生理盐水制备玻璃器皿包扎灭菌稀释样品倒平板培养注：本次任务未结束，在任务结束后布置作业。设备、工具及材料教案，教学设计方案，课程标准，教学案例考 核备 注运城职业技术学院课程教学设计实施方案项 目3.细菌的检验任 务2.饮料中菌落总数检验授课教师成少宁

5、、乔冬授课地点综B106 授课方法理实一体化课 时2.0教学内容培养基的制备方法和灭菌方法实施步骤1.“六个一”企业案例（微生物快速检测方法）介绍 5min 此类方法是在比相应的传统方法在短的时间内可以得出结果。此类方法的典型例子是：膜过滤一微菌落一荧光法。具体方法是将一定量的样品(或样品稀释液)经膜过滤(过滤膜045m)，再将过滤膜放在培养基上或放在浸过液体培养基的厚纸板上，在适宜温度条件下培养一段时间，然后将膜放在浸过0.1ANS(8一苯胺基萘磺酸镁)溶液的纸片上作用10分钟，将膜揭下，在80条件下干燥 510分钟，最后在100倍的荧光显微镜(入=340 380nm)下计数蓝绿色菌落的数目

6、。 对于不同样品，膜过滤一微菌落一荧光法使用的培养基和培养时间不同。检验凝乳中酵母菌时，可采用含琼脂的固体培养基，也可放在2ml双料液体培养基浸润的纸片上培养1524小时。检验食品中需氧性细菌数时，可用琼脂计数平板，也可用营养肉汤或酪蛋白胨一豆粉蛋白胨液体培养基，培养8小时。食品中酵母和霉菌的选择性检测可使用添加100ppm氯霉素的麦芽汁提取物琼脂培养基，或添加100ppm氯霉素的双料麦芽汁提取物液体培养基。糖果中耐渗透酵母的检测可采用50%葡萄糖液体培养基，培养时间为48小时(菌数>10个克)72小时(菌数10个克)。2. 下发任务书，布置任务：学生每5-6人为一组按照制定的实验实施方

7、案进行培养基的制备和需灭菌相关物品的准备和包扎。3.学生讨论任务流程，进行任务分工 20min任务流程：秤取药品-溶化-调节pH值-分装-加塞-包扎；配制生理盐水分装包扎；吸管包扎4.学生分组按照实施方案进行培养基的熬煮、分装、包扎以及相应的玻璃器皿的包扎 60min（1）、秤取药品：配方：胰蛋白胨5.0 g；酵母浸膏2.5 g；葡萄糖1.0 g；琼 脂15.0 g；蒸馏水1000 mL、pH 7.0±0.2，按照培养基配方比例依次准确地秤取酵母浸膏、胰蛋白胨、葡萄糖放入烧杯中。注意事项：酵母浸膏比较粘稠，秤取时可先在称上减去烧杯和药匙的重量，再用药匙去蘸取酵母浸膏，一起放到称上秤取

8、。胰蛋白胨秤取时要迅速，因蛋白胨很容易吸潮。（2）、溶化：将烧杯中加入水，加热溶化后加入琼脂，继续加热，琼脂溶化后，补足损失水分。注意事项：琼脂溶化过程中，应控制火力，小火加热，以免培养基溢出；不断搅拌，以防培养基烧焦；配制培养基时，不要用铜或铁锅加热，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。（3）、调节pH值先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L氢氧化钠，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直到pH值达到7.0±0.2，若偏碱，则用1mol/L盐酸调节。注意事项：pH值不要调过头，以免回调影响培养基内各离子的浓度。（4）、分装分装试管

9、的量不要超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，分装三角瓶的量不要超过三角瓶的1/2。注意事项：分装时不要让培养基沾在管口上，以免沾染棉塞而引起污染。（5）、加塞：在分装好的试管和三角瓶上加上棉塞，阻止外界微生物的进入而污染，并保证有良好的通气性能。（6）、包扎在试管的棉塞外，三角瓶的棉塞外加上两层报纸，防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外用棉绳扎好。5.学生在课下进行培养基的灭菌。5. 教师在学生做的过程中进行指导和评价，随时指出和解决学生在操作过程中出现的问题注：本次任务未结束，在任务结束后布置作业。设备、工具及材料教案，教学设计方案，课程标准，教学案例，电炉、恒温培养箱、试管、培养皿、移液管（移液枪

10、）、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、试剂考 核备 注运城职业技术学院课程教学设计实施方案项 目3.细菌的检验任 务2.饮料中菌落总数检验授课教师成少宁、乔冬授课地点综B106 授课方法理实一体化课 时2.0教学内容菌落总数检验的采样方法、稀释方法、接种方法、培养方法实施步骤1.“六个一”企业案例(微生物快速测定方法)介绍 5min Limulus测试法用于革兰氏阴性菌脂多糖的测定。这种方法可以在30分钟1小时内定量测定食品中存在的死去的和活着的革兰氏阴性菌的细胞壁组成部分。因为内毒素与革兰氏阴性菌含量呈线性关系，所以可以根据革兰氏阴性菌的污染程度确定内毒素的含量。 这个方法可用于食品中内毒素的快速检测

11、，特别是新鲜易腐败的如牛奶、肉、鱼和蛋等食品，因为这些食品上的细菌多为革兰氏阴性菌。此方法还用于鉴定加工食品原料中革兰氏阴性菌（包括死菌在内）的含量，蛋白制品的卫生细菌学质量检测、肉类食品的细菌学质量检测，以及医学范围内的注射液质量检测等多个方面。2. 下发任务书，布置任务： 5min学生分组，每5-6人为一组进行饮料（食品坊提供）中菌落总数检验的饮料的选择、取样、稀释和接种。要求：严格遵循无菌操作，严格按照实验方案进行操作。3.学生分组讨论任务流程,进行任务分工，教师检查学生讨论和分工情况 10min4.每三个组找一名学生进行操作演示，其他学生指出操作过程的问题 15min5.教师补充,强调

12、操作过程中应注意的问题 5min加热培养基时电炉火一定要小,以防培养基溢出;稀释样品的过程中一定要注意同时往培养皿中加样;一定要先做好标记。6.学生分组无菌操作进行饮料中菌落总数检验的取样、接种和培养 45min熔化培养基标记稀释样品加样倒平板混匀恒温培养液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混

13、合均匀，制成1:100的样品匀液。按以上操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1 mL无菌吸管或吸头。根据对样品污染状况的估计，选择2个3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。及时将15 mL20 mL冷却至46 的平板计数琼脂培养基（可放置于46 ±1 恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ±1 培养48 h±2 h。水产品30 ±1

14、培养72 h±3 h。如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻转平板，按上述条件进行培养。7.教师在学生做的过程中进行指导和评价8.布置作业：查找饮料中菌落总数的合格范围（每组一份，批改率100%）9.学生实验完成后清洁整理实验室 5min设备、工具及材料教案，教学设计方案，课程标准，教学案例，电炉、恒温培养箱、试管、培养皿、移液管（移液枪）、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、试剂、饮料（食品坊提供）考 核备 注运城职业技术学院课程教学设计实施方案项 目3.细菌的检验任 务2.饮料中菌落总数检验授课教师成少宁、乔冬授课

15、地点综B106 授课方法理实一体化课 时2.0教学内容饮料中菌落总数检验的计数方法和报告方法实施步骤1.“六个一”企业案例(微生物快速测定方法)介绍 5min食品中微生物快速检测的方法一般可以在1-3小时内得出结果，其中较为典型的方法有：Limulus测试法，ATP测定法，直接表面荧光过滤技术以及氧气消耗测定法等。 ATP测定法是利用生物发光法，应用荧光素荧光素酶制剂进行的，在活细胞中ATP含量近乎是恒定的，利用特殊的酶试剂水解掉细菌膜，使ATP释放，ATP与荧光素荧光素酶制剂反应变成AMP和光，产生的光强度与ATP成正比，通过测定光强度可确定细菌浓度。这种方法可用于鲜肉、鲜鱼、牛奶、啤酒、矿

16、泉水以及无菌药品的检测等多种领域。 ATP+荧光素+荧光素酶（Mg2+）荧光素荧光素酶AmP+焦磷酸 荧光素荧光素酶AMP（O）氧化荧光素+荧光素酶+AMP+CO2+光2.下发任务书，布置任务： 5min学生分组，每5-6人为一组进行饮料中菌落总数检验平板的菌落计数和报告。要求：计数正确，报告方法正确3.平板计数 15min 学生组内讨论，对本组的平板进行计数，选出代表进行汇报，教师汇总，与学生共同评价。菌落计数方法：可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。选取菌落数在30 CFU3

17、00 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU的平板记录具体菌落数，大于300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。4.菌落总数的计算方法 35min学生组内讨论，对本组平板的菌落总数进行计算，选出代表进行汇报，教师汇总，与学生共同评价。 菌落总数计算方法：若只有一个稀释度平板

18、上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式计算。若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU300 CFU之间，其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU时，则以最接近30 CFU或300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。5.菌落总数的报告方法 10min 学生组内讨论，对本组平板的菌落总数进行报告，选出代表进行汇报，教师汇总，与学生共同评价。(1) 菌落数小于100 CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。(2) 菌落数大于或等于100 CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。(3) 若所有平板上为蔓延