生技大二学习生化上册ch

1、 Chapter 4 核核 酸酸 Nucleic Acids重点内容：重点内容：核酸的组成核酸的组成DNA的一级结构及测序方法的一级结构及测序方法三种三种RNA的结构特点的结构特点核酸的性质核酸的性质常见的核酸研究技术常见的核酸研究技术二十一世纪是二十一世纪是生命科学的世纪生命科学的世纪生命生命 = 核酸核酸 + 蛋白质蛋白质二十一世纪是核酸、蛋白质的世纪二十一世纪是核酸、蛋白质的世纪生命是生命是 ？概述概述由储藏遗传信息的核酸和调节代谢的由储藏遗传信息的核酸和调节代谢的酶蛋白组成的系统。酶蛋白组成的系统。Friedrich Miescher DNA发现者发现者第一节第一节 核酸的种类、分布与

2、功能核酸的种类、分布与功能一、核酸的种类与分布一、核酸的种类与分布（一）核酸的种类（一）核酸的种类（ RNARNA、DNADNA） DNADNA：脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic aciddeoxyribonucleic acid）RNARNA：核糖核酸核糖核酸（ribonucleic acidribonucleic acid）: :tRNAtRNA (transfer (transfer RNA) RNA) 、mRNAmRNA (messenger RNA) (messenger RNA)、rRNArRNA（ribosomal RNAribosomal RNA）特殊

3、功能的特殊功能的RNA:RNA:细胞核小细胞核小RNARNA（snRNAsnRNA）、）、细胞质小细胞质小RNARNA（scRNAscRNA）、）、反义反义RNARNA（antisense RNAantisense RNA）、）、双链双链RNARNA（dsRNAdsRNA）、）、具有催化活性的具有催化活性的RNARNA（ribozymeribozyme）、）、MicroRNAMicroRNA等。等。真核生物真核生物原核生物原核生物 DNA细胞核（95%）线粒体、叶绿体（5%）核质区（拟核） RNA细胞质（75%）线粒体、叶绿体（15%）细胞核（10%）细胞质（二）核酸的分布（二）核酸的分布二、

4、核酸的生物学功能二、核酸的生物学功能 （一）一）DNADNA是主要的遗传物质是主要的遗传物质经典实验：经典实验：1944 ， O.T. Avery 肺炎双球菌转化实验肺炎双球菌转化实验1952 ， A. Hershey 和和M. Chase 噬菌体感染实验噬菌体感染实验19441944年，年，O.T.AveryO.T.Avery（美）肺炎链球菌的美）肺炎链球菌的转化转化实验实验, ,首次证明首次证明DNADNA是细菌的遗传物质。是细菌的遗传物质。Hershey-ChaseHershey-Chase（1952）噬菌噬菌体侵染细菌的体侵染细菌的实验。实验。（二）（二）RNARNA生物学功能生物学功

5、能RNARNA的功能：的功能：1.1.参与蛋白质的合成参与蛋白质的合成 rRNA(75-80%)rRNA(75-80%) tRNA(10-15%) tRNA(10-15%) mRNA(2-5%) mRNA(2-5%)2.2.遗传物质遗传物质3.3.具有生物催化剂功具有生物催化剂功能能4.4.参与基因表达的调参与基因表达的调控控一、核酸的元素组成一、核酸的元素组成 基本元素：基本元素：C H O N C H O N P P 核酸的元素组成有两个特点：核酸的元素组成有两个特点： 1. 1. 一般不含一般不含S S。 2. P 2. P含量较多，并且恒定（含量较多，并且恒定（9%-10%9%-10%

6、）。）。 因此，实验室中用因此，实验室中用定磷法定磷法进行核酸的进行核酸的定量分析。（定量分析。（DNA9.9% DNA9.9% 、RNA9.5%RNA9.5%）二二 核酸的分子组成核酸的分子组成核核 酸（酸（nucleic acid)核苷酸核苷酸(nucleotide) 磷酸磷酸 (phosphoric acid)核苷核苷(nucleoside) 戊糖戊糖(pentose)碱 基碱 基(base)1核苷酸核苷酸（1）Base:n核酸中除了核酸中除了5 5类基本的碱基外，还有一些含量甚少的类基本的碱基外，还有一些含量甚少的稀稀有碱基，有碱基，多数是甲基化的产物多数是甲基化的产物。如：。如：稀有

7、碱基稀有碱基12435DNA Sugar : deoxy-ribosen核苷由戊糖和碱基缩合而成，嘌呤的核苷由戊糖和碱基缩合而成，嘌呤的N9N9或嘧啶的或嘧啶的N1N1与戊糖与戊糖C-1C-1-OH-OH以以C-NC-N糖苷键相连接糖苷键相连接。 dAdANNNNNH2OH HOHOCH2H HHH9 9NONOOHOCH2H HHHOH O HU1假尿苷假尿苷 胸腺嘧啶核糖核苷胸腺嘧啶核糖核苷稀有核苷（稀有核苷（tRNA）n核苷酸是核苷的磷酸酯核苷酸是核苷的磷酸酯。如：。如：DNADNA为为5-5-磷酸磷酸- -脱氧核糖脱氧核糖核苷、核苷、RNARNA的为的为5-5-磷酸磷酸- -核糖核苷。

8、核糖核苷。OBOHOHOH2CPOHHOOB=腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶或胸腺密啶核糖核苷酸 OH2CPOHHOOOBOH脱氧核糖核苷酸2 2 核苷酸衍生物核苷酸衍生物nATP是生物体内分布最广和最重要的一种核苷酸衍生物，能量是生物体内分布最广和最重要的一种核苷酸衍生物，能量载体。它的结构如下：载体。它的结构如下：O-POO-NNNNNH2OHHOHHOHHOCH2O-POO-O-POO-三磷酸腺苷 (ATP) (2) (2) GTP (GTP (鸟嘌呤核糖核苷三磷酸鸟嘌呤核糖核苷三磷酸) )（3 3）环核苷酸）环核苷酸cAMP cAMP 和和 cGMPcGMPn激素的第二信使，激素的第二

9、信使，cAMPcAMP调节糖代谢、脂代谢。调节糖代谢、脂代谢。ncAMP cAMP 和和 cGMP cGMP 的环状的环状磷酯键是一个高能键。磷酯键是一个高能键。比比 ATP ATP 水解能高得多。水解能高得多。（4 4）辅酶的组成成分）辅酶的组成成分HSCoA、 NAD+、NADP+、FAD等辅助因子。（1 1）参与）参与DNADNA、RNARNA的合成、蛋白质的合成。的合成、蛋白质的合成。（2 2）在能量转化中起重要作用，）在能量转化中起重要作用，ATPATP是生物体内是生物体内能量的通用货币。能量的通用货币。（3 3）是构成多种辅酶的成分：）是构成多种辅酶的成分：NADNAD、NADPN

10、ADP、FADFAD、FMNFMN和和CoACoA。（4 4）参与细胞中的代谢与调节（参与细胞中的代谢与调节（cAMPcAMP、cGMPcGMP、UDP-UDP-葡萄糖）。葡萄糖）。3 3核苷酸的生物学作用核苷酸的生物学作用小结小结UDP-葡萄糖葡萄糖4 4多聚核苷酸多聚核苷酸(DNA/RNA)(DNA/RNA)结构特点结构特点n多聚核苷酸多聚核苷酸是通过核苷酸的是通过核苷酸的5 5- -P P与另一分子核苷酸与另一分子核苷酸的的C C3 3-OH-OH形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。相连而成的链状聚合物。nDNADNA或或RNARNA链的特点：链的特点：一端为一端为C C5

11、 5带有一个自由磷酸带有一个自由磷酸基，称为基，称为5-5-磷酸端（常用磷酸端（常用5 -5 -P P表示）；另一端表示）；另一端C C3 3带有自由的羟基，称为带有自由的羟基，称为3-3-羟基端（常用羟基端（常用3 -3 -OHOH表示）。表示）。当表示当表示DNADNA或或RNARNA链链时，必须注明它的方向是时，必须注明它的方向是5353或是或是3535（具有方向性）具有方向性）。一、一、DNADNA的分子结构的分子结构（一）（一）DNADNA的一级结构的一级结构 1. 1.定义：指定义：指DNADNA分子中脱氧核苷酸的排列顺序。即数量分子中脱氧核苷酸的排列顺序。即数量庞大的四种碱基的排

12、列顺序。庞大的四种碱基的排列顺序。 2. 2.DNADNA的碱基组成（的碱基组成（ChargaffChargaff定则）：定则）： （1 1）在所有的）在所有的DNADNA中，中，A=TA=T，G=C G=C 即即A+G=T+CA+G=T+C （2 2）DNADNA的碱基组成具有种的特异性，即不同生物物的碱基组成具有种的特异性，即不同生物物种的种的DNADNA具有自己独特的碱基组成，但没有组织具有自己独特的碱基组成，但没有组织和器官的特异性。和器官的特异性。 3.DNA3.DNA一级结构的表示法一级结构的表示法: :5 3 结构式结构式5 3 p p p pOH3 ACTG1 线条式线条式5

13、ACTGCATAGCTCGA 3 5 pACTGCATAGCTCGAOH 3 字母式字母式nDNADNA测序的生物学意义测序的生物学意义 DNADNA是遗传信息的储存者和传递者，遗传信息是是遗传信息的储存者和传递者，遗传信息是由碱基序列体现的，碱基序列略有改变，即可引由碱基序列体现的，碱基序列略有改变，即可引起遗传信息的显著改变。所以起遗传信息的显著改变。所以DNADNA测序是研究测序是研究DNADNA 功能的基础。功能的基础。 nDNADNA测序的实验方法测序的实验方法双脱氧终止法（双脱氧终止法（SangerSanger法）和法）和化学法化学法（GilbertGilbert法）法）4.4.D

14、NADNA一级结构的研究方法：一级结构的研究方法：DNA的双脱氧终止法测序的双脱氧终止法测序策略策略 体外合成一段与待测体外合成一段与待测DNA序列互补的序列互补的随机随机DNA片段群。片段群。Deoxynucleotide; DideoxynucleotideDideoxynucleotidech04DNASequencing.mov（二）（二）DNADNA的二级结构的二级结构1.1.定义：定义： DNADNA的二级结构指的二级结构指DNADNA的两条多聚核苷酸的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的双螺旋结构。链间通过氢键形成的双螺旋结构。2 2DNADNA双螺旋结构的特点双螺旋结构的特点1）D

15、NA由两条反平行的多由两条反平行的多核苷酸链组成，两条链绕同核苷酸链组成，两条链绕同一中心轴相缠绕，形成右手一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条双股螺旋，一条53，另，另一条一条35。螺旋上有大沟。螺旋上有大沟和小沟。和小沟。 DNAdouble helix B Formmajorgrooveminor groove2）嘌呤与嘧啶碱基位于双螺旋）嘌呤与嘧啶碱基位于双螺旋的内侧。的内侧。磷酸与脱氧核糖在双磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧。磷酸与脱氧核糖彼螺旋外侧。磷酸与脱氧核糖彼此通过此通过3、5-磷酸二酯键相连磷酸二酯键相连接，构成接，构成DNA分子的骨架。碱分子的骨架。碱基平面与纵轴垂直，糖环平

16、面基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行。与纵轴平行。3 3）两条核苷酸链，依靠碱基）两条核苷酸链，依靠碱基间形成的氢键结合在一起。间形成的氢键结合在一起。碱基具有严格的配对规律，碱基具有严格的配对规律，即即A A与与T T结合，结合，G G与与C C结合，结合，这种配对关系，称为这种配对关系，称为碱基碱基互补。互补。A A和和T T之间形成两个之间形成两个氢键，氢键，G G与与C C之间形成三个之间形成三个氢键。氢键。 双螺旋的两条链是互补关双螺旋的两条链是互补关系。系。4 4）螺旋横截面的直径约为）螺旋横截面的直径约为2 2 nmnm，每条链相邻两个碱基平每条链相邻两个碱基平面之间的距离为面

17、之间的距离为0.34 0.34 nmnm，每每1010个核苷酸形成一个螺旋，个核苷酸形成一个螺旋，其螺距（即螺旋旋转一圈）其螺距（即螺旋旋转一圈）高度为高度为3.4 3.4 nmnm。3 3DNADNA双螺旋的稳定因素双螺旋的稳定因素n维持维持DNADNA稳定性的主要因素包括：两条稳定性的主要因素包括：两条DNADNA链之间碱基配对形成的链之间碱基配对形成的氢键和碱基堆氢键和碱基堆积力积力；n另外，磷酸基团上的负电荷与介质中的另外，磷酸基团上的负电荷与介质中的阳离子间形成的离子键及范德华力对维阳离子间形成的离子键及范德华力对维持双螺旋结构的稳定性上也起一定的作持双螺旋结构的稳定性上也起一定的作

18、用用 。B-DNA：典型的典型的Watson-CrickWatson-Crick双螺旋双螺旋DNADNA。右手双股螺旋。右手双股螺旋。在相对湿度为在相对湿度为92%92%时的时的DNADNA钠盐。接近钠盐。接近DNADNA在细胞中的构象。在细胞中的构象。A-DNA：在相对湿度为在相对湿度为75%75%以下时的以下时的DNADNA纤维。右手双螺旋，纤维。右手双螺旋，外形粗短，外形粗短，RNA-RNARNA-RNA、RNA-DNARNA-DNA杂交分子具有这种结构。杂交分子具有这种结构。Z-DNAZ-DNA：左手双螺旋左手双螺旋DNADNA。天然。天然B-DNAB-DNA的局部区域可以形成的局部区

19、域可以形成Z-DNAZ-DNA。4DNA二级结构的多型性二级结构的多型性P489表表136列出了列出了 A、B、Z型型DNA的主要特征数据。的主要特征数据。DNADNA三链结构常出现在三链结构常出现在DNADNA复制、重组、转录的起复制、重组、转录的起始位点或调节位点。始位点或调节位点。 第三股链的存在可能使一些调控蛋白或第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNARNA聚聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。息的表达。TATTAT、C C+ +GCGC两种碱基配对方式（两种碱基配对方式（HoogsteenHoogsteen配对）。配对）。

20、 DNA三股螺旋（三股螺旋（ H-DNA）：）：H-DNA的结构的结构（三）（三）DNADNA的三级结构的三级结构一、定义一、定义： DNADNA的三级结构指在的三级结构指在DNADNA双螺旋二级结构的基双螺旋二级结构的基础上通过扭曲和折叠所形成的特定构象。础上通过扭曲和折叠所形成的特定构象。超螺旋是超螺旋是DNADNA三级结构的一种类型。超螺旋即三级结构的一种类型。超螺旋即DNADNA双螺旋的螺旋。双螺旋的螺旋。DNADNA超螺旋的意义：超螺旋的意义： 使使DNA形成高度致密状态从而得以装入核中形成高度致密状态从而得以装入核中Human genome DNA length= 3x109x0.

21、34x10-9=1.02mCell size: 10-6 to 10-5 m 推动推动DNA结构的转化以满足功能上的需要。如负超螺旋分结构的转化以满足功能上的需要。如负超螺旋分子所受张力会引起互补链分开导致局部变性，利于复制和子所受张力会引起互补链分开导致局部变性，利于复制和转录。转录。1.1.链环数链环数（linking numberlinking number）双螺旋双螺旋DNADNA中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数，中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数，以以L L表示。表示。2.2.扭转数扭转数（缠绕数：（缠绕数：twisting numbertwisting number）

22、DNADNA分子中的分子中的Watson-CrickWatson-Crick螺旋数，以螺旋数，以T T表示。表示。3.3.超螺旋数超螺旋数（writhing numberwrithing number）以以W W表示。表示。 所以：所以：L=T+WL=T+W DNADNA分子具有相同的结构，但分子具有相同的结构，但L L值值不同，所以称它们为拓不同，所以称它们为拓扑异构体。拓扑异构体之间可通过扑异构体。拓扑异构体之间可通过I/III/II类酶催化相互转类酶催化相互转变。变。二、二、DNA的拓扑学特征的拓扑学特征L=25,T=25,W=0松弛环形松弛环形1152010523L=23,T=23,W

23、=0解链环形解链环形15101520231510152025L=23,T=25,W=2负超螺旋负超螺旋121482316131510152023右手旋转拧松两匝后的线形右手旋转拧松两匝后的线形DNADNA超螺旋的形成超螺旋的形成超螺旋的拓超螺旋的拓扑学公式：扑学公式：L=T+W超螺旋超螺旋RNARNA的结构特点的结构特点nRNARNA的的U U替代替代DNADNA中的中的T T，组成组成RNARNA的核苷酸也的核苷酸也是以是以3 -5 3 -5 磷酸二酯键连接。磷酸二酯键连接。nRNARNA是单链分子，因此，在是单链分子，因此，在RNARNA分子中，并不分子中，并不遵守遵守A AG GT TC

24、 C的比例关系。的比例关系。nRNARNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构分子中，部分区域也能形成双螺旋结构（类似（类似A-DNAA-DNA双螺旋结构），不能形成双螺双螺旋结构），不能形成双螺旋的部分，则形成突环。这种结构可以形象旋的部分，则形成突环。这种结构可以形象地称为地称为“发夹发夹”结构结构或或茎环结构。茎环结构。二、二、RNARNA的分子结构的分子结构RNA的的主要类型：主要类型： tRNA、mRNA和和rRNAn在在RNARNA的双螺旋结构中，碱基的配对情况的双螺旋结构中，碱基的配对情况不象不象DNADNA中严格。中严格。G G 除了可以和除了可以和C C 配对外，配对外，也可以

25、和也可以和U U 配对。配对。G-U G-U 配对形成的氢键配对形成的氢键较弱。不同类型的较弱。不同类型的RNA, RNA, 其二级结构有明其二级结构有明显的差异。显的差异。ntRNAtRNA中除了常见的碱基外，还存在一些中除了常见的碱基外，还存在一些稀有碱基，这类碱基大部分位于突环部稀有碱基，这类碱基大部分位于突环部分分. .1.1.tRNAtRNA的一级的一级结构特点：结构特点：n分子量分子量2525k kDaDa左右，大左右，大约由约由70709090个核苷酸组个核苷酸组成，沉降系数为成，沉降系数为4 4S S左右。左右。n分子中含有较多的修饰分子中含有较多的修饰成分。成分。n3 3 -

26、 -末端都具有末端都具有CpCpAOHCpCpAOH的结构。的结构。 5 5 端多为端多为pG,pG,也有也有pCpC。（一）（一）tRNA2 2、tRNAtRNA的二级结构的二级结构特点特点tRNAtRNA的二级结构大都的二级结构大都呈呈“ 三叶草三叶草” 形状，形状，一般一般具有具有四四臂四环臂四环：包括氨基：包括氨基酸接受臂、反密码酸接受臂、反密码（环）臂、二氢尿（环）臂、二氢尿嘧啶（环）臂、嘧啶（环）臂、T T C C（环）（环）臂臂和可和可变环。变环。氨基酸接受臂氨基酸接受臂包含有包含有tRNAtRNA的的3 3- -末端和末端和5 5- -末端，末端， 3 3- -末端的最后末端的

27、最后3 3个核个核苷酸残基都是苷酸残基都是CCACCAOHOH，氨基酸可氨基酸可与其成酯，该区在蛋白质合成与其成酯，该区在蛋白质合成中起携带氨基酸的作用。中起携带氨基酸的作用。反密码反密码环环与氨基酸接受区相对，一般环与氨基酸接受区相对，一般环中含有中含有7 7个核苷酸残基，其中环个核苷酸残基，其中环中正中的中正中的3 3个核苷酸残基称为个核苷酸残基称为反反密码子密码子，与，与mRNAmRNA上的密码子反上的密码子反向配对向配对。tRNAtRNA的功能的功能: :在蛋白质生物合在蛋白质生物合成中转运氨基酸和识别密码子成中转运氨基酸和识别密码子的作用。的作用。3 3、tRNAtRNA的三级结构的

28、三级结构n在三叶草型二级结构的基础上，突环上在三叶草型二级结构的基础上，突环上未配对的碱基由于整个分子的扭曲而配未配对的碱基由于整个分子的扭曲而配成对，目前已知的成对，目前已知的tRNAtRNA的三级结构均为的三级结构均为倒倒L L形形。（二）（二）mRNAmRNAn约占总约占总RNARNA的的5%5%。n不同细胞的不同细胞的mRNAmRNA的链长和分子量差异很大。的链长和分子量差异很大。n它的功能是将它的功能是将DNADNA的遗传信息传递到蛋白质，指的遗传信息传递到蛋白质，指导蛋白质的合成。导蛋白质的合成。1 1、m mRNARNA一级结构的特点一级结构的特点真核：真核：单顺反子、单顺反子、

29、 5 5 - -末端有末端有“帽子帽子” 、 3 3 - -末端有末端有polyApolyA片段片段 和非编码区和非编码区 和非编码区和非编码区原核：原核：多顺反子多顺反子 5 5 - -末端无末端无“帽子帽子” 、 3 3 - -末端末端 无无polyApolyA片段片段 （病毒除外）（病毒除外） 有非编码区有非编码区 有非编码区有非编码区顺反子：顺反子： mRNAmRNA上具有翻译功能的核苷酸顺序。上具有翻译功能的核苷酸顺序。n极大多数真核细胞极大多数真核细胞mRNAmRNA在在3 3- -末端有一段长约末端有一段长约2020250250核苷酸的核苷酸的polyApolyA。polyApo

30、lyA是在转录后经是在转录后经polyApolyA聚合酶的作用而添加上去的。聚合酶的作用而添加上去的。npolyApolyA可能的功能：可能的功能：与与mRNAmRNA从细胞核到细胞质的转从细胞核到细胞质的转移有关；与移有关；与mRNAmRNA的半寿期有关，新合成的的半寿期有关，新合成的RNARNA其其polyApolyA链较长，而衰老的链较长，而衰老的mRNAmRNA，polyApolyA链缩短。链缩短。2）真核）真核mRNA 3 -polyA“尾巴尾巴”3 3）真核）真核mRNAmRNA5 5 - - “帽子帽子”结结构构 “帽子帽子”结构结构：甲基化的鸟苷酸通过焦磷酸与：甲基化的鸟苷酸通

31、过焦磷酸与真核真核mRNA5 5- -末端的末端的核苷酸以核苷酸以5 5、 5 5- -磷酸二酯键相连。磷酸二酯键相连。三种帽子结构：三种帽子结构： O型：m7G5ppp5 Np I型：m7G5ppp5NmpNp II型：m7G5ppp5NmpNmpNpn可能功能：可能功能： 抵抗抵抗5 5核酸外切酶降解核酸外切酶降解mRNAmRNA。 为核糖体提供识别位点，使为核糖体提供识别位点，使mRNAmRNA很快与核糖体结合，促很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成。进蛋白质合成起始复合物的形成。 *4）原核）原核mRNA 无无5帽子和帽子和3polyA，但有，但有5端先导区。端先导区。 S

32、D序列：序列：5端先导区中，有一段富含嘌呤的端先导区中，有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为碱基序列，典型的为5-AGGAGGU-3，位于，位于起始密码子起始密码子AUG前约前约10核苷酸处，此序列由核苷酸处，此序列由Shine和和Dalgarno发现，发现，称称SD序列序列。通过通过SD序列和核糖体序列和核糖体16S的的rRNA的的3末端富末端富含嘧啶碱基的序列互补。含嘧啶碱基的序列互补。（三）（三）rRNArRNArRNA与核糖体结合蛋白一起构成核糖体。与核糖体结合蛋白一起构成核糖体。 大肠杆菌中有三类大肠杆菌中有三类rRNA（原核）：（原核）： 5S rRNA、16S rRNA、23S r

33、RNA 真核细胞有四类真核细胞有四类rRNA： 5S rRNA、5.8S rRNA、18SrRNA、28S rRNA rRNA的功能：的功能：组成核糖体组成核糖体 23SrRNA具有催化肽键形成的肽基转移酶活性具有催化肽键形成的肽基转移酶活性参与参与tRNA与与mRNA的结合的结合蛋白质的合成需要三种蛋白质的合成需要三种RNA的参与的参与一、一、核酸的两性解离核酸的两性解离n由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱基呈现弱碱性，所以核酸的等电点比较低。碱基呈现弱碱性，所以核酸的等电点比较低。DNADNA的等电点为的等电点为4 44.54.5，RNA

34、RNA的等电点为的等电点为2 22.52.5。核酸在其等电点时溶解度最小。核酸在其等电点时溶解度最小。nRNARNA的等电点比的等电点比DNADNA低的原因，是低的原因，是RNARNA分子中核糖分子中核糖基基2-2-OHOH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNADNA没有这种作用。没有这种作用。第四节第四节 核酸的性质核酸的性质二、核酸的水解二、核酸的水解1.1.碱水解碱水解 室温室温0.1mol/L NaOH0.1mol/L NaOH条件下，条件下， DNADNA不水解。不水解。 在相同条件下，在相同条件下，RNARNA完全水解，得到完全水解，得到2 2-

35、 -和和3 3- -磷磷酸核苷的混合物。酸核苷的混合物。 这是因为这是因为RNARNA中中C C2-OH2-OH的存在，促进了磷酸酯键的的存在，促进了磷酸酯键的水解。水解。 DNADNA稳定，保留和传递遗传信息。稳定，保留和传递遗传信息。 RNARNA是是DNADNA的信使，完成任务后迅速降解。的信使，完成任务后迅速降解。2 2、核酸的酶解、核酸的酶解nRNARNA水解酶水解酶 RNaseRNasen DNA DNA水解酶水解酶 DNaseDNasen 核酸外切酶核酸外切酶n 核酸内切酶核酸内切酶 （限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶）n限制性核酸内切酶是限制性核酸内切酶是特异性的水解核酸中某些

36、特特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。定碱基顺序部位。三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收n碱基、核苷、核苷酸和核酸在碱基、核苷、核苷酸和核酸在240-290nm有较有较强的光吸收，强的光吸收，max=260nm。1.鉴定纯度鉴定纯度纯纯DNA，A260/A280 1.8（1.65-1.85）。）。若大于若大于1.8，表示污染了，表示污染了RNA或或DNA降解。降解。纯纯RNA，A260/A280 2.0。若有杂蛋白或苯酚，则若有杂蛋白或苯酚，则A260/A280明显降低。明显降低。2.增色效应：增色效应：变性后变性后DNA对对260nm紫外光的吸收率（紫外光的吸收率（A260）比变性）比

37、变性前明显增加，这种现象称为前明显增加，这种现象称为增色增色效应效应.天然状态的天然状态的DNA在完全变性后，紫在完全变性后，紫外吸收外吸收(260 nm)值增加值增加2540%，而，而RNA变性后，约增加变性后，约增加1.1%。3.含量计算含量计算1.0 OD相当于：相当于：50ug/mL双螺旋双螺旋DNA或：或：40ug/mL单链单链DNA（或（或RNA）或：或：20ug/mL核苷酸核苷酸四、核酸的变性、复性四、核酸的变性、复性1. 1. 核酸的变性（核酸的变性（denaturationdenaturation）与变性因素与变性因素n核酸的变性是指核酸的变性是指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成

38、核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链结构的过程。单链结构的过程。n核酸的变性核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它，所以它的一级结构保持不变。的一级结构保持不变。n能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。性。nA260值增加n粘度下降n浮力密度增大n分子量不变2.2.DNADNA变性后的表现变性后的表现3.3.DNADNA的热的热变性和解链温度（变性和解链温度（TmTm）DNADNA的热变性过程是突变性的，它在很窄的温度区的热变性过程是突变

39、性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，间内完成。因此，通常将通常将DNADNA的变性达到的变性达到50%50%时时的温度称为的温度称为DNADNA的熔解温度（的熔解温度（melting melting temperature,Tm),Tmtemperature,Tm),Tm也称解链温度或也称解链温度或DNADNA的熔点。的熔点。 一般一般DNADNA的的T Tm m值在值在70-8570-85 C C之间之间影响影响DNADNA的的TmTm值的因素：值的因素： A.DNAA.DNA均一性均一性 均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围内。均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围内。 B.G-CB.

40、G-C含量与含量与TmTm值成正比值成正比(G-C)%=(G-C)%=（Tm-69.3Tm-69.3）2.442.44 C. C.离子强度离子强度: :离子强度越高，离子强度越高，TmTm越高。越高。4 4、核酸的复性、核酸的复性n变性变性DNADNA在适当的条件下在适当的条件下，两条彼此分开的单链，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复复性性。将热变性的将热变性的DNADNA缓慢冷却时，可以复性（一般低于缓慢冷却时，可以复性（一般低于Tm20Tm202525），这一过程也叫退火（），这一过程也叫退火（annealing)annea

41、ling)。分子量越大复性越难。浓度越大，复性越快。分子量越大复性越难。浓度越大，复性越快。DNADNA复性复性1.DNA1.DNA分离纯化分离纯化 真核真核DNADNA以核蛋白（以核蛋白（DNPDNP）形式存在，）形式存在，DNPDNP溶于溶于 水或盐（水或盐（1 mol/L NaCl1 mol/L NaCl），不溶于），不溶于0.14 mol/L0.14 mol/L 的的NaClNaCl中。利用此性质，可将中。利用此性质，可将DNPDNP与与RNARNA核蛋白核蛋白 分开，提取出分开，提取出DNPDNP。 DNADNA核蛋白可用水饱和酚抽提，去除蛋白质。核蛋白可用水饱和酚抽提，去除蛋白质。

42、 还可用氯仿还可用氯仿- -异戊醇去除蛋白质。异戊醇去除蛋白质。第五节第五节 核酸的研究技术核酸的研究技术一、核酸的分离纯化一、核酸的分离纯化2.RNA2.RNA的分离纯化（的分离纯化（mRNAmRNA的分离、纯化）的分离、纯化） 用用0.14mol/L NaCl0.14mol/L NaCl使使DNPDNP沉淀，沉淀， RNARNA核蛋白核蛋白（RNPRNP）在上清液中。）在上清液中。 去蛋白：盐酸胍、苯酚等。去蛋白：盐酸胍、苯酚等。 必须防止必须防止RNARNA酶对酶对RNARNA的破坏。的破坏。二、限制性核酸内切酶二、限制性核酸内切酶 1. 1. 限制修饰作用：限制修饰作用：I I、III

43、I、IIIIII类限制性内切酶类限制性内切酶 I I和和IIIIII类类: :双功能酶双功能酶（甲基化修饰切（甲基化修饰切割）割）IIII类类: :两种酶组成双两种酶组成双元系统元系统 识别长度识别长度4 48 8个核个核苷酸，且具有回文苷酸，且具有回文结构结构 三、核酸的凝胶电泳三、核酸的凝胶电泳1.1.琼脂糖电泳琼脂糖电泳分离分离200bp-50kb200bp-50kb片段片段DNADNA2.PAGE2.PAGE电泳电泳分离分离5-500bp5-500bp小片段小片段DNADNA。 EB（溴化乙锭）（溴化乙锭）（1）它的基本步骤为：设计一对引物。优化）它的基本步骤为：设计一对引物。优化反应体系。选择热循环温度。鉴定扩增