植物组织培养教案(20211109144835)

1、?植物细胞与组织培养?教案主讲：陈发菊李晓玲易飞一、本课程的性质、地位和作用植物组织培养是以植物细胞、组织、器官为研究对象，运用工程学原理，利用人工培养 基按照预定目标，对植物的器官、组织、细胞和原生质体进行培养，改变生物性状，生产生 物产品，为人类生产和生活效劳的一门综合性技术科学， 也是现代生物技术的核心技术之一。 在植物的优良品种快速繁殖、 脱毒苗木生产、 缩短育种进程、 种质资源保存等方面具有其它 技术无法比较的优势。它的主要研究内容是研究在无菌及离体条件下，细胞、组织、器官所需营养条件和环境 条件；细胞、组织、器官的形态发育规律，植物材料的快速大量繁殖方法；原生质体融合方 法与机理；

2、 再生个体的遗传变异； 种质资源的离体保存机理与方法； 通过植物细胞工程实现 对动植物的遗传改造 , 创造新的生物种质 , 为人类造福。二、教学目的及要求 了解植物组织培养的开展概况、开展现状、未来开展趋势及在生产实践中应用。 理解植物组织培养的根本原理。 了解植物组织培养实验室或商业性种苗生产企业的设计与构建。熟悉培养室常用仪 器、设备及用具，并掌握其使用方法，熟知组织培养实验室常用药品，并掌握其性质、用途 及配制方法。 了解植物组织培养中如洗涤、 灭菌、培养基配制、 无菌操作等技术环节，并掌握其操 作规程，会熟练操作。 了解影响植物组织培养的环境条件。 掌握植物器官、愈伤组织、胚胎、花药与

3、花粉、细胞、原生质体培养及种质资源保存 的根底技术。 掌握植物组培快繁及脱毒苗培育技术。熟知外植体初代培养、诱导增殖、壮苗与生根及瓶苗驯化等各技术环节，并了解组织培养中污染、褐变及超度含水态苗发生的原因及控制 措施。 了解重要植物的组培快繁与脱毒技术及组培苗工厂化生产与经营管理。三、内容与课时安排24学时章节目录课堂讲授内容及学时分配表章节内容学时第1章概述2第2章植物组织培养实验室的构建和操作技术4第3章愈伤组织培养2第4章胚状体发生2第5章器官培养2第6章花药和花粉培养2第7章细胞培养2第8章原生质体培养和体细胞杂交2第9章植物脱毒技术3第10章组培苗工厂化生产的经营与管理11第11章种质

4、保存2-第1章概 述2学时-一一植物组织培养的概念二植物组织培养的开展三植物组织培养的应用本章小结目的要求：1掌握组织培养的概念和类型;2掌握组织培养的特点；3了解组织培养开展史；(4) 初步掌握组织培养在农业实践上的应用。一、植物组织培养的概念(一) 植物组织培养的概念高等植物的组织培养(tissue culture)技术是指别离一个或数个体细胞或植物体的一部 分在无菌条件下培养的技术。 通常我们所说的广义的组织培养， 是指通过无菌操作别离植物 体的一局部(即外植体explant)，接种到培养基上，在人工控制的条件进行培养，使其生成完 整的植株。(二) 植物组织培养的生理依据细胞全能性 (c

5、ell totipotency) ：植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并 具有发育成为完整植株的潜在能力。植物生长调节物质对于植物细胞组织的分化和决定具有关键性作用。 它包括：生长素类、 细胞分裂素类、赤霉素、脱落酸、乙烯等生长素类主要用于愈伤组织的形成， 体细胞胚的产生及试管苗的生根。 常用的有 2,4-D 、 NAA、 IBA、IAA 等。其作用强弱为 2,4-D>NAA>IBA>IAA。细胞分裂素类那么有促进细胞的分裂与分化， 延迟组织的衰老，促进芽的产生等作用。 常 用的有Zip、KT、6-BA、ZT等作用强弱顺序为。Zip>KT>6-BA>

6、;ZT。赤霉素那么有促进已分化的芽伸长生长，打破种子休眠的作用。常用的为GA3。(三) 植物组织培养的类型组织培养按培养对象可分为组织或愈伤培养、器官培养、植株培养、细胞和原生质体培 养等。1组织或愈伤组织培养(tissue, callus culture)为狭义的组织培养，是对植物体的各部 分组织进行培养，如茎尖分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮组织、胚乳组织和薄壁 组织等等；或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养， 二者均通过再分化诱导形成植株。2. 器官培养(organ culture)即离体器官的培养，根据作物和需要的不同，可以包括 别离茎尖、茎段、根尖、叶片、叶原基、子叶、花瓣

7、、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果实 等外植体的培养3. 植株培养(plant culture )是对完整植株材料的培养，如幼苗及较大植株的培养。4 细胞培养(cell culture )是对由愈伤组织等进行液体振荡培养所得到的能保持较好分 散性的离体单细胞或花粉单细胞或很小的细胞团的培养。5.原生质体培养 ( protoplast culture )是用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养。 组织培养是本世纪开展起来的一门新技术， 由于科学技术的进步， 尤其是外源激素的应 用，使组织培养不仅从理论上为相关学科提出了可靠的实验证据，而且一跃成为一种大规模、批量工厂化生产种苗的新方法，并在生产上

8、越来越得到广泛的应用。植物组织培养之所以开展如此之快， 应用的范围如此之广泛， 是由于具备以下几个特点： 培养条件可以人为控制 组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、 昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响， 且条件均一， 对植物生长极 为有利，便于稳定地进行周年培养生产。 生长周期短，繁殖率高植物组织培养是由于人为控制培养条件， 根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同 的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往 20-30d 为一个周期。所以，虽然 植物组织培养需要一定设备及能源消耗， 但由于植物材料能按几何级数繁殖生产， 故总

9、体来 说本钱低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。 管理方便，利于工厂化生产和自动化控制 植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激 素等条件， 极利于高度集约化和高密度工厂化生产， 也利于自动化控制生产。 它是未来农业 工厂化育苗的开展方向。 它与盆栽、 田间栽培等相比省去了中耕除草、 浇水施肥、 防治病虫 害等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。二 、植物细胞与组织培养的开展 植物组织培养的研究可以追溯到 20 世纪初期，根据其开展情况，大体可以分为三个时 期。1萌芽阶段组织培养技术的蓬勃开展只是近 50年的事，但它的

10、整个历史可以追溯至 19 世纪末和上 世纪初。20世纪初，在Schleiden和Schwann所开展起来的细胞学说的推动下， 1902年德 国植物学家 Haberlandt 提出了高等植物的器官和组织为许多细胞组成的观点， 以及植物细胞 全能性的理论， 即植物的体细胞，在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖，发育成完整植株的潜在能力。他首次发表了植物离体细胞培养实验的报告。1912年，Habefiandt的学生Kotte和美国的 Robins 在根尖培养中获得了组织培养的成功。 Kotte 采用了无机盐、葡萄糖、蛋白 胨、天冬酰胺，及添加各种氨基酸的培养基。 Robins 用含无机盐、葡萄糖或果糖

11、的琼脂培 养基，培养了长度为1.453.75cm的豌豆、玉米和棉花的茎尖， 形成了一些缺绿的茎和根。2奠基阶段自 Haberlandt 的实验之后，直到 1934年美国的 White 由番茄根建立了第一个活泼生长 的无性繁殖系， 并反复转移到新鲜培养基中继代培养， 使根的离体培养实验获得了真正的成 功，并在以后 28 年间培养了 1600 代。这之后， White 又以小麦根尖为材料，研究了光、温 度、通气、 pH 值、培养基组成等各种培养条件对生长的影响，并于 1937 年建立了第一个组 织培养的综合培养基，其成分均为化合物，包括3种B族维生素，即吡哆醇、硫胺素和烟酸，该培养基后来被定名为W

12、hite培养基。与此同时，Gautherer (1934)在研究山毛柳和黑杨等形成层的组织培养实验中，提出了 B 族维生素和生长素对组织培养的重要意义， 并于 1939 年连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。同年，White 由烟草种间杂种的瘤组织， Nobecourt 由胡萝卜均建立了与上述类似的连续生长的组织培养物。因此，Gautherer，White 和 Nobecourt 一起被誉为组织培养学科的奠基人。 我们现在所用的培养方法和培养基， 根本上都是由这三位科学家建立的。后来， White 于 1943年发表了?植物组织培养手册? 专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。3快速开展

13、和应用阶段40 年代 Skoog 和崔徵在烟草茎切段和髓培养以及器官形成的研究中发现，腺嘌呤或腺 苷可以解除培养基中生长素( IAA )对芽形成的抑制作用，而能诱导形成芽，从而明确了腺 嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。即这一比例高时， 产生芽； 这一比例低时，那么形成根；相等那么不分化。 在寻找促进细胞分裂的物质过程中， Miller 等人于 1956 年发现了冲动素。 不久即知道冲动素可以代替腺嘌呤促进发芽， 并且效果可增加 3万倍。 结 果上述控制器官分化的激素模式变为冲动素与生长素的比例关系。这方面的成功发现， 有力地推动了植物组织培养的开展。1952年； Morel

14、和 Martin 通过茎尖分生组织的离体培养，从已受病毒侵染的大丽花中 首次获得无病毒植株。19351945年Muir把单细胞放在一张铺在愈伤组织上面的滤纸上培 养，使细胞发生了分裂，即实施了看护接种技术，使单细胞培养获得初步成功。1960年，Cocking等人用真菌纤维素酶别离植物原生质体获得成功。1971年，Takebe等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株， 这不仅在理论上证明了无壁的原生质体同样具 有全能性，而且在实践上为外源基因的导入提供了理想的受体材料。80年代中期以来，对禾谷类作物的原生质体培养也相继告捷，在这方面中国学者做出了重要奉献。1962 年印度Guha 等人成功地在毛叶

15、曼陀罗花药培养中，由花粉诱导得到单倍体植株，从而促进了花药 和花粉培养的研究。以后相继在烟草、水稻、小麦、玉米、番茄、辣椒、草莓、苹果等多种植物培养中获得 成功， 其数目到达 160多种， 其中烟草、水稻和小麦等的花药育种培养在中国取得了引入注 目的成就。1960年， Morel 提出了一个离体无性繁殖兰花的方法，其繁殖系数极高。由于这一方法 有很大的应用价值，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起兰花工业。1973年Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体融合，获得了第一个体细胞杂种，Cocking 等倡导的原生质体培养和体细胞杂交， 研究得到了迅速开展， 已经能使矮牵牛和烟草属的杂种细胞增

16、殖分化生 成杂种植株。在整个植物组织培养开展的历史中， 我国学者做出多方面的奉献， 除了前述的崔徵的研 究成效以外，还有 1993 年李继侗等关于玉米等植物离体根尖培养的研究工作，以及罗士韦 关于幼胚和茎尖培养，李正理关于离体胚的研究培养、王伏雄等关于幼胚的研究培养工作。三、植物组织培养的应用 植物组织培养成为生物科学的一个广阔领域， 除了在根底理论的研究上占有重要地位以 外，还在农业生产中也得到越来越广泛的应用。(一) 植物组织培养的快速繁殖用植物组织培养的方法进行快速繁殖 (rapidpropagation) 是生产上最有潜力的应用，包括 花卉欣赏植物、蔬菜、果树、大田作物及其他经济作物。

17、快繁技术不受季节等条件的限制， 生长周期短，而且能使不能或很难繁殖的植物进行增殖。快速繁殖可用以下手段进行：通过茎尖、茎段、鳞茎盘等产生大量腋芽；通过根、叶等 器官直接诱导产生不定芽； 通过愈伤组织培养诱导产生不定芽。 试管快速繁殖应用在以下生 产或研究中： (1)繁殖杂交育种中得到的少量杂交种，以及保存自交系、不育系等。 (2)繁殖脱毒培养得到的少量无病毒苗。 (3)繁殖生产上急需的或种源较少的种苗。由于组织培养周 期短， 增殖率高及能全年生产等特点， 加上培养材料和试管苗的小型化， 这就可使有限的空 间培养出大量的植物，在短期内培养出大量的幼苗。组织培养突出的优点是“快，通过这 一方法在较

18、短时期内迅速扩大植物的数量， 以一个茎尖或一小块叶片为基数， 经组织培养一 年内可增殖到 10 000100 000株。(二) 脱毒植物在生长过程中几乎都要遭受到病毒病不同程度的危害，有的种类甚至同时受到数种病毒病的危害， 尤其是很多园艺植物靠无性方法来增殖， 假设蒙受病毒病，代代相传，越染越 重，甚至会造成极严重的后果。自从 Morell952 年发现采用微茎尖培养方法可得到无病毒苗 (virus free) 后，微茎尖培养就成为解决病毒病危害的重要途径之一。假设再与热处理相结合， 那么可提高脱毒培养的效果。 对于木本植物， 茎尖培养得到的植株难以发根生长， 那么可采用茎 尖微体嫁接的方法来

19、培育无病毒苗。组织培养无病毒苗的方法已在很多作物的常规生产上得到应用， 如马铃薯， 甘薯，草莓， 苹果， 香石竹， 菊花等。而且已有不少地区建立了无病毒苗的生产中心， 这对于无病毒苗的 培养、鉴定、繁殖、保存、利用和研究，形成了一个标准的系统程序，从而到达了保持园艺 植物的优良种性和经济性状的目的。三体细胞无性系变异和新品种培育 breeding 植物组织培养过程中往往存在大量的变异， 这种变异称为体细胞无性系变异。 具有如下 特点：1变异的无方向性：既有有利的变异，也有有害的变异既有形态变异，也有生理变异。2变异的普遍性：变异在组织培养中经常发生，出现在组织培养的各个时期。既有数 量性状变异

20、，又有质量性状变异。既有农艺性状变异，又有经济性状变异；既有表型变异， 又有生理变异。 与自然变异与辐身诱变相比， 体细胞无性系变异广泛而普遍。 且易于获得纯 合个体。3植物体细胞无性系变异的类型：一类为可遗传变异，主要是由于遗传物质的变化引 起的尤以基因突变为主。另一类是不可遗传的变异，为生理型变异。往往是由于培养过 程中外加的激素及其它化学物质的刺激引起。如叶形、育性等。4弓|起植物体细胞无性系变异的原因：激素的刺激为主要原因。高浓度的GA和IAA ,会造成畸形胚的高频发生， TDZ可使植株产生白化苗或玻璃化植株。 2，4-D那么使培养细胞发 生染色体数量变化。随培养时间的延长，染色体变异

21、频率升高，变异的性状和范围手扩大。5植物体细胞无性系变异的利用价值及途径：它是一种重要的遗传变异来源，是一种 重要的遗传资源。对于育种有重要的应用价值。四单倍体育种花药、花粉的培养在苹果、柑橘、葡萄、草莓、石刁柏、甜椒、甘蓝、天竺葵等约20种园艺植物得到了单倍体植株。 在常规育种中为得到纯系材料要经过多代自交， 而单倍体育 种，经染色体加倍后可以迅速获得纯合的二倍体，大大缩短了育种的世代和年限。五种质保存 用植物组织培养技术保存种质具有以下优点：1在较小的空间内可以保存大量的种质资源。2具有较高的繁殖系数。3防止外界不利气候及其他栽培因素的影响，可常年进行保存。4不爱昆虫、病毒和其他病原体的影

22、响。 5有利于国际间的种质交换与交流。六遗传转化 大多数植物遗传转化方法需要通过植物组织培养来进行。本章小结 ：1植物组织培养是指别离单个或多个细胞或植物体的一局部，在人工配制的培养基 上进行培养，使之长成一株完整植物体的过程。2按照外植体的不同，组织培养可分为植株培养、胚胎培养、器官培养、细胞培养 和原生质体培养 5 种类型。 3组织培养具有：培养条件可以人为控制；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利 于工厂化生产的突出特点，因而开展迅速。4组织培养技术在农业生产上的应用主要表达于以下几个方面：快速繁殖优良苗木； 获得脱毒苗；育种上应用；工厂化育苗。第2章 植物组织培养实验室的构建和操作技术(

23、4学时)第节商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备第二节1培养基及其配制第三节外植体的选择与培养第四节试管苗的驯化与移载本章小结目的要求：(1) 掌握组织培养实验室的设计；(2) 掌握组织培养常用的实验仪器设备及其使用方法；(3) 掌握调控组织培养的主要环境条件。掌握灭菌和消毒的区别；(5) 掌握灭菌的不同方法和具体操作过程；(6) 掌握无菌接种的步骤；(7) 掌握外植体的培养方法和步骤；(8) 一般掌握外植体褐变和玻璃化的处理方法；(9) 掌握试管苗驯化的根本程序；在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最根本的设备条件有个全面的 了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改

24、建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的，实验室规模太小，那么会限制生产，影响效率。在设计组织 培养实验室时，应按组织培养程序来设计，防止某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组 织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具， 同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。第一节商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备一、设计一个标准的组织培养实验室应当包括：洗涤室、配置室、无菌室、培养室、观察室等。 在实际中可结合可行条件，合并一局部。(一) 洗涤室(cleaning room)洗涤室用于完成玻璃器皿等仪器的清洗、枯燥和贮存。室内应

25、配备大型水槽，最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺垫橡胶。上下水道要畅通。备有塑料筐，用于运输培养 器皿。备有枯燥架，用于放置枯燥涮净的培养器皿。(二) 准备室(repairing room)准备室要求明亮、 通风。 在准备室内要完成培养基制备以及试管苗出瓶、 清洗与整理工 作。如果房间较多， 可将准备室分为洗涤室和配置室两局部。 洗涤室专门负责试管苗出瓶与 培养器皿的清洗工作；配置室那么负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。三缓冲室 进入无菌室前要在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋，戴上口罩。 应当在此室内安 装灭菌用的紫外灯。控制无菌室及培养室的配电板等。四无菌操作室 tra

26、nsfering room 接种室是进行植物材料的别离接种及培养物转移的一个重要操作室。 其无菌条件的好坏 对组织培养成功与否起重要作用。在工作方便的前提下，接种室宜小不宜大，一般78m2，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。接种室要求干爽安静， 清洁明亮。 在适当位置吊装 1-2 盏紫外线灭菌灯， 用以照射灭菌。 最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。五 培养室 culturing room 培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、 数目、 及其他附属设备而定。 其设计

27、以充分利用空间和节省能源为原那么。 高度比培养架略高 为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般设 5 层，最低一层离地高约 l0cm ，其他每层间隔 30cm 左右，培养架即高 1. 7m 左右。培养架长度都是根据日光灯的 长度而设计，如采用 40W日光灯，那么长1.3m, 30W的长Im ,宽度一般为60cm。培养室最重要的因子是温度，一般保持在2027 C左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。 由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度, 最好不同种类有不同的 培养室。室内湿度也要求恒定,相对湿度以保持在70 80为好,可安装加湿器。

28、控制日光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照1016h也有的需要连续照明。短日照植物需要短日照条件,长日照 植物需要长日照条件。现代组培实验室大多设计为采 用天然太阳光照作为主要能源,这样不但可以节省能源,而且组培苗接受太阳光生长良好, 驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。六驯化室驯化室要求清洁无菌, 配有空调机、 加湿器、 恒温恒湿控制仪、 喷雾器、 光照调节装置、 通风口以及必要的杀菌剂。七温室 应配有空调机、通风口、加湿器、恒温恒湿控制装置、喷雾装置、光照调节装置以及必要的杀菌杀虫装置及相应药剂。二、仪器设备和器皿用具一仪器设备见实验室设计1超净台,优点是操作方便自如,比较舒适,工作

29、效率高,准备时间短。开机10分钟即可操作, 可进行长时间使用。 在工厂化生产中, 接种工作量很大, 需要经常长久地工作时, 超净台是很理想的设备。超净台功率在145260W左右，它装有小型鼓风机，使空气穿过一个前置过滤器, 在这里把大局部空气尘埃先过滤掉, 然后再使空气穿过一个细致的高效过 滤器,它除去了大于 0. 3um 的尘埃、细菌和真菌孢子等,最后以较洁净的气流吹到工作台 面。超净空气的流速为每分钟 2430m,这已足够防止附近空气袭扰而引起的污染， 这样的 流速也不会阻碍采用酒精灯对器械等的灼烧消毒。 在这样的无菌条件下操作， 就可以保证无 菌材料在转移接种过程中不受污染。超净台分水平

30、式和垂直式二种型号。2无菌箱,在投资少的情况下,可以用接种箱来代替超净台。接种箱依靠密闭、药剂 熏蒸和紫外灯照射来保证内部空间无菌。但操作活动受限制,准备时间长,工作效率低。3空调机，保证室内温度，一般为25 ± 2 C,应安置在室内较高的位置。以便于排热散凉。4 .除湿机，培养室的湿度应为7080%湿度过高易长杂菌，湿度过低培养器皿内的培养基会失水变干，影响培养物的生长。5恒温箱，用于植物材料的培养，可以控制温度、湿度及光照等。6烘箱，用于枯燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌和测定干物重。用于枯燥需保 持80100C；进行干热灭菌需保持 150 C,达13h;假设测定干物重，那么温

31、度应控制在 80 C 烘干至完全枯燥为止。7高压灭菌锅，用于进行培养基和器械用具的灭菌。小规模实验室可选用小型手提式 高压灭菌锅。 如果是连续的大规模生产, 应选用大型立式的或卧式的高压灭菌锅。 通常以电 作能源。&冰箱，主要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料等。9 电子分析天平和托盘天平，电子分析天平，用于称取大量元素、微量元素、维生素、 激素等微量药品精确度为 0.0001g；托盘天平用于称取用量较大的糖和琼脂等，其精确度为 0. 1g。天平应放置在枯燥、不受震动的天平操作台上。10显微镜及解剖镜，种类较多，用于别离微茎尖可采用双筒实体解剖镜。双筒解剖镜 在别离

32、茎尖等较小组织时,便于观察、操作,通常放大 5-80 倍。放大 40 倍以上操作需要有 相当熟练的技术和较好的工具。 为进行操作, 要有照明装置。 解剖镜上带有照相装置, 根据 需要随时对所需材料进行摄影记录。11. 水浴锅，用于溶解难溶药品和熔化琼脂条12. 摇床与转床、用于改善液体培养材料的通气状况及促进酶解原生质体的解离。一般在液体培养中转速为每分钟 100次左右,在解离原生质体时为每分钟80左右。13磁力搅拌器，磁力搅拌器用于加速搅拌难溶的物质，如各种化学物质、琼脂粉等。 磁力搅拌器还可加热,使之更利于溶解。14电蒸馏水器，电蒸馏水器，采用硬质玻璃或金属制成。蒸馏水用于配制母液或培养

33、基,配制培养基可用自来水来代替,假设实验要求严格的话,那么须用蒸馏水。15酸度计，组织培养中培养基pH值的准确度是十分重要的，应当使用酸度计，假设无酸度计,也可使用 pH 试纸进行粗测。首次使用酸度计前,应用标准液调节定位,然后固定。测量 pH 值时,待测液必须充分 搅拌均匀。 如果培养基温度过高, 测量时要调整 pH 值计上的温度扭使之和培养基温度相当。 注意保护好玻璃电极,用后电极应用蒸馏水冲洗净,盖上电极帽。16、离心机，用于收集原生质体，转速要求较低。一般为10004000rpm即可。二各类器皿1. 培养器皿：在组织培养中配制培养基和进行培养需大量的玻璃器皿。要求由碱性溶 解度小的硬质

34、玻璃制成, 以保证长期贮存药品及培养的效果； 培养用的还要求透光度好, 能 耐高压高温， 能方便放人培养基和培养材料的器皿， 根据培养的目的和要求， 可以采用不同 种类、规格的玻璃器皿。其中以试管、三角瓶、培养皿等使用较多。最常使用的是三角瓶，规格有l00ml ，250ml ， 500ml 等，一般使用 l00ml 三角瓶，无论静止或振荡培养皆适用。其培养面积大，利于组织生长，受光也比试管好。由于瓶口较小， 亦不易污染。培养皿常用 9、 12cm 直径等规格，要求上、下能密切吻合。这在游离细胞、原生质体、 花粉等的静置培养、看护培养、无菌种子的发芽、植物材料的别离等都需采用。试管常用 18mm

35、Xl80mm 或 20mmX200mm 规格。可用于培养较高的试管苗，另外也不 易污染。培养器皿还可就地取材， 采用一些代用品。 工厂化生产可采用广口的 200ml 罐头瓶， 加 盖半透明的塑料盖， 由于瓶口大，所以大量繁殖时操作方便、 工作效率高， 也减少了培养材 料的损伤。但缺点是易引起污染。目前， 培养容器和制备培养基所需的玻璃器皿逐渐被塑料器皿所代替。 塑料容器具有质 轻、透明、不易破碎、本钱低等优点，如培养容器多为平底方盒形，可提高培养空间利用率 的植株数， 并能一层层地叠摞起来， 从而节约空间。 这类塑料制品多是采用聚丙烯材料制成， 能耐高温， 可进行高压灭菌。有些产品为一次性消耗

36、品， 不但可节省洗涤人工，还可节省时 间，提高效率。一次性塑料容器或带螺丝帽的玻璃瓶，无须另外配盖，使用时比较方便。瓶口封塞可用多种方法， 要具有一定的通气性和密闭性， 以防止培养基枯燥和杂菌污染。 以前封口常用棉塞。 但这种封口方法夏季极易污染， 且不易保持培养基的湿度。 现在多采用 聚丙烯塑料薄膜作为封口， 以线绳结扎或橡皮圈箍扎。 为了增加通气性， 可在里面衬一层硫 酸纸或牛皮纸。这样经济方便，且通气好。也可采用专用的封口膜。2分注器，小型操作时可采用烧杯直接分装。大型实验室可采用医用“下口杯作为 分装工具，在“下口杯的下口管上套一段软胶管，加一弹簧止水夹，使用时非常适宜。更 大规模或要

37、求更高效率时，可考虑采用液体自动定量灌注设备。3离心管，用于离心收集原生质体，一般用5ml、 10ml 规格。4. 刻度移液管，常用的有 0.1ml、0.2ml、0.5ml、2ml、5ml、10ml。用于配制培养基 时吸取不同种类的母液。应多准备几支，分开使用。5细菌过滤器，用于除去不能采用湿热灭菌法的液体中的细菌。一般采用0.22um微孔滤膜进行抽滤灭菌。包括滤头，注射器或采用抽滤装置：真空泵、吸滤瓶、滤气玻璃管等。6.实验器皿，在组织培养中配制培养基，贮藏母液，材料的消毒等需要各种化学实验用的玻璃器皿，包括 100ml、250ml、500ml、1000ml 烧杯；10ml、l00ml、10

38、00ml 量筒；100ml、 1000ml 试剂瓶 (棕色 )等等。(三) 器械用具1 .镊子类( forceps )常应用医疗上的镊子。根据操作需要有各种类型，假设用 l00ml 的三角瓶作为培养瓶，可 用 20em 长的镊子。 镊子过短. 容易使手接触瓶口， 造成污染。 镊子太长， 使用起来不灵活。 如在别离茎尖幼叶时，那么用钟表镊子。2. 剪刀类( scissors) 可采用医疗五官科用的中型剪刀。主要用于切断茎段、叶片等。也可以用弯形剪刀，由 于其头部弯曲，可以深入到瓶口中进行剪切。3. 解剖刀切割较小材料和别离茎尖分生组织时， 可用解剖刀。刀片要经常调换，使之保持锋利状 态，否那么切

39、割时会造成挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培养效果。4解剖针解剖针可深入到培养瓶中，转移细胞或愈伤组织。 也可用于别离微茎尖的幼叶， 可以自 制。5接种工具包括接种针、接种钩及接种铲，由白金丝或镍丝制成6钻孔器 用于取肉质茎、块茎、肉质根内部的组织时采用。一般为 T 字型。口径有各种规格。 7其它包括酒精灯，电炉，试管架，搪瓷盘等多种。第二节 培养基及其配制 目的要求：(1) 一般掌握培养基的种类、特点；(2) 掌握根本培养基的配方；(3) 一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量；(4) 掌握培养基母液和常用培养基的配制方法和步骤；(5) 熟练掌握培养基的灭菌方法；(6) 一般掌握培养基的筛

40、选方法。培养基( culture medium )是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植 物的组织对营养有不同的要求， 甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同， 只 有满足了它们各自的特殊要求， 它们才能很好地生长。 因此， 没有一种培养基能够适合一切 类型的植物组织或器官， 在建立一项新的培养系统时， 首先必须找到一适宜的培养基， 培养 才有可能成功。 在植物组织培养历史进程中， 事实上也紧密地伴随着培养基的研制史。 对植 物的营养要求的不断认识， 对已有培养基的改进， 或者将新发现的植物激素、 新的有益成分 应用于培养基之中，都大大促进了组织培养研究的迅速开展，取得

41、越来越多的成功。 一、培养基的成分培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大 类。1水水是植物原生质体的组成成分， 也是一切代谢过程的介质和溶媒。 它是生命活动过程中 不可缺少的物质。 配制培养基母液时要用蒸馏水， 以保持母液及培养基成分的精确性， 防止 贮藏过程发霉变质 '大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的 变化引起不良效果。2无机元素 (inorganicelement)大量元素，指浓度大于 05mmolL 的元素，有 N，P，K，Ca，Mg，S 等。其作用是：(1) N 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱

42、等的组成成分，是生命不 可缺少的物质。在制备培养基时以 N03-N 和 NH4-N 两种形式供给。大多数培养基既含有NO， -N 又含 NH4-N 。 NH4-N 对植物生长较为有利。供给的物质有KN03 、 NH4NO3 等。有时，也添加氨基酸来补充氮素。(2) P 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成局部。磷也是ATP、ADP 等的组成成分。在植物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能 量，而且也促进对 N 的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。常用的物质有 KH2P04 或 NaH2P04 等。(3) K 对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。

43、K 增加时，蛋白质合成 增加，维管束、纤维组织兴旺，对胚的分化有促进作用。但浓度不易过大，一般为 1-3mg L 为好。制备培养基时，常以 KCl 、 KNO ，等盐类提供。(4) Mg、S和Ca、Mg是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以 MgS04 7H20提供。用量为13mg/ L较为适宜；Ca是构成细 胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以CaCl2 2H20提供。(5) 微量元素 指小于0.5mmol /L的元素，Fe, B, Mn , Cu, Mo , Co等。铁是一些氧 化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成

44、分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。 培养基中的铁对胚的形成、 芽的分化和幼苗转绿有促进作用。 在制做培养基时不用 Fe2(S04)3 和FeCl3(因其在pH值5. 2以上，易形成Fe(OH)，的不溶性沉淀)，而用FeS047H20和 Na2-EDTA结合成螯合物使用。B, Mn , Zn, Cu, Mo , Co等，也是植物组织培养中不可 缺少的元素，缺少这些物质会导致生长，发育异常现象。总之，植物必需营养元素可组成结构物质，也可是具有生理活性的物质，如酶、辅酶以 及作为酶的活化剂，参与活泼的新陈代谢。此外，在维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平 衡等电化学方面起着重要作用。 当某些营养元

45、素供给缺乏时， 愈伤组织表现出一定的缺素症 状。如缺氮，会表现出一种花色素苷的颜色，不能形成导管；缺铁，细胞停止分裂；缺硫， 表现出非常明显的褪绿；缺锰或钼，那么影响细胞的伸长。3有机化合物 (organic compound)培养基中假设只含有大量元素与微量元素， 常称为根本培养基。 为不同的培养目的往往要 参加一些有机物以利于快速生长。常参加的有机成分主要有以下几类：(1) 碳水化合物：最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组 织很好的生长。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。蔗糖使用浓度在2%3%，常用3%,即配制1L培养基称取30g蔗糖，有时可用2.5

46、%，但在胚培养时采 用 4 15的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。不同糖类对生长的影响不同。 从各种糖对水稻根培养的影响来看,以葡萄糖效果最好,果糖和蔗糖相当,麦芽糖差一些。 不同植物不同组织的糖类需要量也不同,实验时要根据配方规定按量称取,不能任意取量。 高压灭菌时一局部糖发生分解、 制定配方时要给予考虑。 在大规模生产时, 可用食用的绵白 糖代替。(2) 维生素 (vitamin) 这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢 活动, 对生长、 分化等有很好的促进作用。 虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需 的维生素,但在数量上还明显缺乏,通常需参加一至数种维生素

47、,以便获得最良好的生长。 主要有Vsl(盐酸硫胺素卜VD6(盐酸吡哆醇卜Vpp(烟酸卜VC(抗坏血酸)、有时还使用生物 素、叶酸、VB2等。一般用量为0. 11.0mg/L。有时用量较高。Vm对愈伤组织的产生和 生活力有重要作用, VB6 能促进根的生长, Vpp 与植物代谢和胚的发育有一定关系。 Vc 有 防止组织变褐的作用。(3) 肌醇 (myo-inosit0l) 又叫环己六醇， 在糖类的相互转化中起重要作用。 通常可由磷酸 葡萄糖转化而成， 还可进一步生成果胶物质， 用于构建细胞壁。 肌醇与 6 分子磷酸残基相结 合形成植酸，植酸与钙、 镁等阳离子结合成植酸钙镁，植酸可进一步形成磷脂，

48、参与细胞膜 的构建。使用浓度一般为lOOmg / L,适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。(4) 氨基酸 (aminoacide) 是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用 的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。 有时应用水解乳蛋白或水解酪蛋白， 它们是牛乳用酶法等加工的水解产物， 是含有约 20种氨基酸的混合物，用量在 101000mg/L之间。由于它们营养丰富，极易引起污染。 如在培养中无特别需要，以不用为宜。(5) 天然复合物 其成分比较复杂，大多

49、含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对 细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用， 但对器官的分化作用不明显。 它的成分大多不 清楚，所以一般应尽量防止使用。1) 椰乳 是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在 1020，与其果实成熟度及产地关系也很大。它在愈伤组织和细胞培养中有促进 作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用，但茎尖组织的大小假设超过1mm时，椰乳就不发生作用。2) 香蕉 用量为150200ml/l。用黄熟的小香蕉，参加培养基后变为紫色。对pH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。3) 马铃薯(pota

50、to)去掉皮和芽后，加水煮 30min，再经过过滤，取其滤液使用。用量为 150200g/ L。对pH值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。4) 水解酪蛋白 为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸，使用浓度为 100200mgL。 受酸和酶的作用易分解，使用时要注意。5) 其他 酵母提取液 (YE)(0 . 01 0. 05) ，主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液(0.01%-0.5% )、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。4植物激素 (hormone)是植物新陈代谢中产生的天然化合物， 它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、 分裂、

51、 发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多 的生理生化活动， 在培养基的各成分中， 植物激素是培养基的关键物质， 对植物组织培养起 着决定性作用。(1) 生长素类 (auxin) 在组织培养中， 生长素主要被用于诱导愈伤组织形成， 诱导根的分 化和促进细胞分裂、 伸长生长。在促进生长方面， 根对生长素最敏感。 在极低的浓度下， (10-5 10-8mg / L)就可促进生长，其次是茎和芽。天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件 易被破坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物质。IAA (indoaceticacid ，吲

52、哚乙酸 ) 是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是 生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的 IAA 分解酶降解，受光也易分解。IBA (indolebutyric acid ，吲哚丁酸 )是促进发根能力较强的生长调节物质。NAA naphthaleneaceticacid，萘乙酸在组织培养中的起动能力要比 IAA高出34倍， 且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA 和 IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。2， 4-D 2， 4-二氯苯氧乙酸 起动能力比 IAA 高 10 倍，特别在促进愈

53、伤组织的形成上 活力最高， 但它强烈抑制芽的形成， 影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒 效应。生长素配制时可先用少量 95 %酒精助溶。2, 4-D可用0. 1mol / L的NaOH或KOH助 溶。生长素常配成 1mgdml 的溶液贮于冰箱中备用。2GA gibberellicacid ，赤霉素 有 20 多种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同、培养基中添加的是GA3，主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株； 赤霉素和生长素协同作用， 对形成层的分化有影响， 当生长素赤霉素比值高时有利 于木质局部化，比值低时有利于韧皮局部化；此外，赤霉素还用于打破休眠，

54、促进种子、块 茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。赤霉素溶于酒精，配制时可用少量 95%酒精助溶。赤霉素不耐热，高压灭菌后将有 70% 100%失效，应当采用过滤灭菌法参加。3细胞分裂素类 cytokinin 这类激素是腺嘌呤的衍生物， 包括 6-BA6- 苄基氨基嘌呤 、 Ktkinetin 冲动素 、 Zt zeatin 玉米素 等。其中 Zt 活性最强，但非常昂贵，常用的是 6-BA。在培养基中添加细胞分裂素有三个作用： 诱导芽的分化促进侧芽萌发生长， 细胞分裂 素与生长素相互作用， 当组织内细胞分裂素生长素的比值高时， 诱导愈伤组织或器官分化 出不

55、定芽。促进细胞分裂与扩大。抑制根的分化。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽 的分化、茎、苗的增殖，而防止在生根培养时使用。生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向， 是愈伤组织、是长根还是长芽。 如为了 促进芽器官的分化， 应除去或降低生长素的浓度， 或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的 比例。生长调节物质的使用甚微，一般用mgL 表示浓度。在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为0. 055mg/L,细胞分裂素 0.0510mg/L。5培养材料的支持物1琼脂 agar 在固体培养时琼脂是最好的固化剂。 琼脂是一种由海藻中提取的高

56、分子 碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40C即凝固为固体状凝胶。通常所说的 煮化"培养基，就是使琼脂溶解于90C以上的热水。琼脂的用量在610g/ L之间，假设浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的 组织中去。 假设浓度过低， 凝固性不好。新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。一般琼脂以 颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还 与高压灭菌时的温度、时间、 pH 值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过 碱加之高温会使琼脂发生水解， 丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐， 也会逐渐丧失凝

57、固能 力。参加琼脂的固体培养基与液体培养基相比优点在于操作简便，通气问题易于解决， 便于经常观察研究等，但它也有不少缺点，如培养物与培养基的接触即吸收 面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢， 影响养分的充分利用， 同时培养物排出的一些代谢废物， 聚集在吸收表 面，对组织产生毒害作用。市售的各种琼脂几乎都含有杂质，特别是 Ca、 Mg 及其他微量元 素。因此在研究植物组织或细胞的营养问题时， 那么应防止使用琼脂。 可在液体培养基外表安 放一个无菌滤纸制成的滤纸桥，然后在滤纸桥上进行愈伤组织培养。(2) 其他 有玻璃纤维、滤纸桥、海绵等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有 影响或影响较小。6抗生物质 (antibiotic)抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等